小鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向平滑肌样细胞分化过程中myocardin的表达

目地探讨血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清体外诱导骨髓间充质干细胞定向分化为平滑肌细胞的可行性及myocardin在此过程中的表达变化。方法采用全骨髓贴壁法分离骨髓间充质干细胞,血小板源性生长因子BB(50μg/L)联合高浓度胎牛血清诱导骨髓间充质干细胞,分别于诱导前,及诱导4d和8d后用免疫细胞化学法检测细胞平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和myocardin的表达。结果免疫组织化学显示,诱导前及诱导4d和8d时,平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链和myocardin三种蛋白的表达逐渐增强,平均灰度值逐渐降低,不同时间点之间比较差异有显著性(P<0.05)。结论血小板源性生长因子BB联合高浓度胎牛血清可有效诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化。Myocardin在此分化过程中可能起了重要作用。     

不同胎牛血清、培养瓶体外培养大鼠骨髓间充质干细胞效果比较

目的 比较普通、高纯度胎牛血清培养基及塑料瓶、玻璃瓶体外培养全骨髓贴壁法分离的骨髓间充质干细胞的效果.方法 采用全骨髓贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,常规传代及纯化.分为4组.其中2组分别采用含10％标准胎牛血清的DMEM培养基、含10％高纯度胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,分别为标准胎牛血清组和高纯度胎牛血清组.2组分别用一次性塑料瓶和玻璃瓶培养,分别为塑料瓶组和玻璃瓶组.比较标准胎牛血清组合高纯度胎牛血清组、塑料瓶组和玻璃瓶组骨髓间充质肝细胞细胞的黏附、增殖、分化状况及细胞形态.结果 标准胎牛血清组贴壁细胞少,原代第10天细胞密度低,细胞透亮,出现突起,类似神经样细胞,传代后细胞呈瘢痕样及神经球样细胞形态;高纯度胎牛血清组贴壁细胞较多,密度均匀,呈典型的栅栏样、鱼群及漩涡样集落生长,传代后呈典型长梭形紧密排列.塑料瓶组塑料培养瓶内细胞贴附牢固,呈典型形态生长;玻璃瓶组玻璃培养瓶内细胞换液时部分脱落.结论 体外培养骨髓间充质肝细胞采用高纯度胎牛血清、一次性塑料瓶者培养效果好于普通胎牛血清和玻璃瓶.     

脐带血清体外培养临床应用人骨髓间充质干细胞的方法研究

目的:观察脐带血清等4种不同培养体系体外培养人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的效果,建立一种适合临床移植需要的人BM-MSCs培养方法.方法:从20例新鲜成人骨髓穿刺液中分离BM-MSCs,分别用含10 %脐带血清、胎牛血清(FCS)、成人血清的DMEM/F12培养基和MesenCult培养基培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组BM-MSCs定向分化.结果:采用4种培养体系都能从骨髓液中分离培养出BM-MSCs,脐带血清和MesenCult组培养的BM-MSCs在增殖数量和速度上相似,而优于FCS和AB型血清组.脐带血清和MesenCult组培养的BM-MSCs表达CD29、CD73、CD105的阳性率比FCS和AB型血清组高(均P<0.05),而CD31阳性率低于FCS和AB型血清组(P<0.05),脐带血清和MesenCult组培养的BM-MSCs诱导为成骨细胞和脂肪细胞阳性率高于FCS和AB型血清组(P<0.05).结论:脐带血清与MesenCult组培养的BM-MSCs的纯度和体外诱导分化能力相似,优于FCS和AB型血清组,脐带血清适合临床应用.     

Caspase-3在骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中的表达

目的 观察骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠后脑组织中caspase-3的表达.方法 无菌分离骨髓间充质干细胞,用培养液DMEM/F12(含2% B27,EGF 40 ng/ml,bFGF 20 ng/ml)诱导骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化,免疫组化检测NSE表达.线栓法建立大鼠缺血再灌注模型.RT-PCR 检测 MSCs 回输脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中caspase-3 mRNA的表达.结果 骨髓间充质干细胞诱导神经样细胞后,免疫组化检测NSE呈阳性表达.RT-PCR检测caspase-3 mRNA 表达,治疗组 caspase-3表达明显低于模型组(P<0.05).治疗组Caspase-3低于对照组,但无统计学意义(P>0.05).结论 骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠后脑组织caspase-3基因下调,抑制神经细胞凋亡.     

淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠骨髓基质细胞Shh通路的影响

目的探讨淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠骨髓基质细胞Shh信号通路的影响。方法实验分组:正常组(2%胎牛血清+DMEM培养的细胞),高糖组(2%胎牛血清+高糖-DMEM培养的细胞),淫羊藿苷组1(2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培养的细胞),淫羊藿苷组2(2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培养的细胞);荧光定量测定Shh通路相关基因——补丁基因1(PTCH1)和光滑基因(SMO)的表达情况。结果淫羊藿苷组1与其他组比较:PTCH1和SMO基因的表达均明显增高(P0.05)。结论淫羊藿苷对高糖培养条件下大鼠骨髓基质细胞Shh通路有加强作用。     

流体剪切力对5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的观察5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,并探讨流体剪切力对诱导过程的影响。方法贴壁法从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞,进行纯化传代培养,取第4代骨髓间充质干细胞以3、5、10、15及20μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用12、24及48 h,用免疫荧光法鉴定分化的心肌样细胞α-肌动蛋白表达率,10μmol/L作用24 h为最佳诱导浓度。通过建立流体剪切力模型,设立以下四组:不加载流体剪切力组、加载5 dyn/cm2流体剪切力组、加载15 dyn/cm2流体剪切力组和加载25 dyn/cm2流体剪切力组,作用24 h,倒置显微镜观察诱导后骨髓间充质干细胞形态的变化,4周后逆转录聚合酶链反应测定分化的心肌样细胞心肌肌钙蛋白ImRNA的表达。结果骨髓间充质干细胞随着传代逐渐变成梭形,5-氮杂胞苷诱导后骨髓间充质干细胞胞体逐渐增大并伸出细长突起,部分相邻细胞的突起连接成网,形态学上表现出向心肌细胞方向转化的特征。免疫荧光显示α-肌动蛋白表达阳性。经过流体剪切力作用细胞后,心肌肌钙蛋白I的表达增高,阳性条带均比未进行力学刺激的细胞表达明显,以15 dyn/cm2剪切力最明显。但是25 dyn/cm2剪切力作用结果并没有随着力的增大而增大。结论 5-氮杂胞苷可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,5-氮杂胞苷可联合剪应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,且诱导效果优于单独使用5-氮杂胞苷。     

姜黄素水解衍生物对血管平滑肌细胞增殖及低密度脂蛋白受体表达的影响

目的研究姜黄素水解衍生物对氧化型低密度脂蛋白促牛主动脉平滑肌细胞增殖和对牛血管平滑肌细胞膜低密度脂蛋白受体表达的影响。方法用盐酸加三氯化铝水解姜黄素,获得姜黄素水解衍生物;用氧化型低密度脂蛋白培养牛血管平滑肌细胞建立促增殖模型,MTT比色法观察姜黄素水解衍生物对牛血管平滑肌细胞增的抑制作用;流式细胞仪检测血管平滑肌细胞膜上低密度脂蛋白受体表达的影响;采用逆转录聚合酶链反应检测c-myc的表达。结果姜黄素水解衍生物对10mg/L氧化型低密度脂蛋白培养的血管平滑肌细胞增殖有明显的抑制作用,高中低剂量组的抑制率分别为46%、37%和22%(P<0.01或0.05);对血管平滑肌细胞膜上的低密度脂蛋白受体的表达均有明显的上调作用,高中低剂量组低密度脂蛋白受体表达率分别比对照组高33.85%、17.95%和5.75%(P<0.01或0.05);能够下调c-myc的表达。结论姜黄素水解衍生物能明显抑制牛主动脉平滑肌细胞增殖,上调低密度脂蛋白受体的表达,从而延缓动脉粥样硬化的发生发展。     

氧化型低密度脂蛋白对平滑肌祖细胞增殖和表型的影响

目的 研究氧化型低密度脂蛋白对血管平滑肌祖细胞生物学性状的影响.方法 分离人外周血单个核细胞,用纤粘连蛋白、血小板源性生长因子BB和EGM培养基诱导培养出平滑肌祖细胞,用细胞免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应法鉴定.用分别含终浓度为25、50、100、200 mg/L氧化型低密度脂蛋白的培养基培养平滑肌祖细胞24 h,然后用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖能力,用细胞免疫荧光法和逆转录-聚合酶链反应法检测α-平滑肌肌动蛋白的表达.结果 平滑肌祖细胞呈"峰、谷"样生长,可表达α-平滑肌肌动蛋白和调宁蛋白.4种不同浓度氧化型低密度脂蛋白组细胞增殖能力均高于对照组(P<0.05),当氧化型低密度脂蛋白为50 mg/L时细胞增殖能力最强,氧化型低密度脂蛋白组细胞内α-平滑肌肌动蛋白的表达明显弱于对照组.结论 氧化型低密度脂蛋白可以促进血管平滑肌祖细胞的增殖并减弱其α-平滑肌肌动蛋白的表达.     

大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响

目的:探讨大鼠脑组织匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元样细胞分化的影响.方法:全骨髓培养法从wistar大鼠中分离培养BMSCs,流式细胞仪鉴定,预诱导24h后,分为4组.空白对照组(A组)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20ng/mL组(B组)、bFGF20ng/mL+正常脑匀浆上清100μg/mL组(C组)、bFGF 20ng/mL+损伤脑匀浆上清100μL/mL组(D组),诱导48h至细胞分化.免疫细胞化学染色分别检测各组诱导分化后神经特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果:第4代BMSCs CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、99.7%和2.2%,诱导后的细胞均具有神经细胞形态特征.免疫组化染色结果:NSE在诱导各组(B组、C组、D组)的表达率为44.50%,63.10%和73.30%,MAP-2的表达率为45.70%、65.30%和75.60%,各组均不表达GFAP.结论:大鼠脑组织匀浆上清能提高BMSCs向神经细胞方向分化的阳性率,损伤脑匀浆的作用更强.     

沥水调脂胶囊对弱氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白1及血管内皮细胞P选择素表达的影响

目的　通过探讨健脾祛痰方药沥水调脂胶囊含药血清对弱氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞表达的单核细胞趋化蛋白 1及血管内皮细胞表达P选择素的影响 ,阐明沥水调脂胶囊抗炎防治动脉粥样硬化作用机理。方法　 1.脐静脉内皮细胞的培养 :取新鲜脐带 ,用Ⅱ型胶原酶消化脐静脉内皮细胞后 ,用含有 2 0 %的胎牛血清的M199培养基接种。实验用第 3代。 2 .脐动脉平滑肌细胞的培养 :取新鲜脐带 ,剥离出脐动脉 ,用Ⅳ型胶原酶联合胰酶 ,分二步消化 ,用 2 0 %的胎牛血清的DMEM培养基接种 ,实验用第 3代 ,实验时用无血清培养基。 3.弱氧化低密度脂蛋白的制备 :用铜离子体外氧化法获得 ,用硫代巴比妥法测硫代巴比妥酸反应物值及琼脂糖电泳 ,测定氧化程度。 4 .含药血清的制备 :用沥水调脂胶囊按成人剂量的 8倍 ,灌喂大鼠 ,取大鼠血清 ,用或不用甲醇沉降蛋白后用冻干机冻干 ,临用时用三蒸水将其稀释至用蛋白沉降前的原体积或血清原体积。 5 .用细胞酶联免疫法测定内皮细胞表面P选择素的表达或酶联免疫法测定平滑肌细胞培养上清液中单核细胞趋化蛋白 1的含量。结果　含 2 0 %的除蛋白含药血清对弱氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞表达的单核细胞趋化蛋白 1具有一定的抑制作用。含有 10 %沥水调脂胶囊药血清培养     

Tetrandrine inhibits activation of rat hepatic stellate cells in vitro via transforming growth factor-β signaling

AIM: To investigate the effect of various concentrations of tetrandrine on activation of quiescent rat hepatic stellate cells (HSCs) and transforming growth factor-β (TGF-β) signaling in vitro.METHODS: HSCs were isolated from rats by in situperfusion of liver and 18% Nycodenz gradient centrifugation, and primarily cultured on uncoated plastic plates for 24 hwith DMEM containing 20% fetal bovine serum (FBS/DMEM) before the culture medium was substituted with 2% FBS/DMEM for another 24 h. Then, the HSCs were cultured in 2% FBS/DMEM with tetrandrine (0.25, 0.5, 1,2 mg/L, respectively). Cell morphological features were observed under an inverted microscope, smooth muscleα-actin (α-SMA) was detected by immunocytochemistry and image analysis system, laminin (LN) and type Ⅲprocollagen (PCⅢ) in supernatants were determined byradioimmunoassay. TGF-β1 mRNA, Smad 7 mRNA and Smad 7 protein were analyzed with RT-PCR and Western blotting, respectively.RESULTS: Tetrandrine at the concentrations of 0.25-2 mg/L prevented morphological transformation of HSC from the quiescent state to the activated one, while α-SMA, LN and PCⅢ expressions were inhibited. As estimated by gray values, the expression of α-SMA in tetrandrine groups (0.25, 0.5, 1, 2 mg/L) was reduced from 21.3% to 42.2%(control: 0.67, tetrandrine groups: 0.82, 0.85, 0.96, or 0.96, respectively, which were statistically different from the control, P＜0.01), and the difference was more significant in tetrandrine at 1 and 2 mg/L. The content of LN in supernatants was significantly decreased in tetrandrine groups to 58.5%, 69.1%, 65.8% or 60.0% that of the control respectively, and that of PCⅢ to 84.6%, 81.5%,75.7% or 80.7% respectively (P＜0.05 vs control), with no significant difference among tetrandrine groups. RTPCR showed that TGF-β1 mRNA expression was reduced by tetrandrine treatments from 56.56% to 87.90% in comparison with the control, while Smad 7 mRNA was increased 1.4-4.8 times. The TGF-β1 mRNA and Smad 7 mRNA expression was in a significant negative correlation (r= -0.755, P＜0.01), and both were significantly correlated with α-SMA protein expression (r = -0.938, P＜0.01;r = 0.938, P＜0.01, respectively). The up-regulation of Smad 7 protein by tetrandrine (1 mg/L)was confirmed by Western blotting as well.CONCLUSION: Tetrandrine has a direct inhibiting effect on the activation of rat HSCs in culture. It up-regulates the expression of Smad 7 which in turn blocks TGF-β1 expression and signaling.     

下调GPM6B基因抑制平滑肌表达特异性标记蛋白

目的 研究糖蛋白M6B（Glycoprotein M6B,GPM6B）基因对间充质细胞C3H10T1/2向平滑肌细胞分化的影响。 方法 将慢病毒感染后的sh-GPM6B细胞作为处理组,慢病毒感染后的sh-Scramble细胞作为对照组进行后续实验。用sh-GPM6B质粒和工具质粒在293T细胞系包装慢病毒。用病毒液感染C3H10T1/2小鼠间充质细胞系制备sh-GPM6B稳转细胞系。荧光显微镜观察病毒转染效率,Western法检测GPM6B基因的干涉效率。慢病毒shRNA干涉抑制GPM6B基因表达后,通过TGF-β1诱导对照组和sh-GPM6B细胞向平滑肌分化。Western blot法检测平滑肌特异标记蛋白SM-MHC和α-SMA表达水平。q-PCR法检测SM-MHC和α-SMA的mRNA转录水平。 结果 慢病毒感染后sh-GPM6B干涉细胞GPM6B基因蛋白表达降低至对照组（40~70）%水平。Sh-GPM6B处理组细胞与sh-Scramble对照组细胞相比,SM-MHC蛋白表达水平显著下调（P<0.05）;SM-MHC和α-SMA mRNA转录水平明显降低（P<0.01）。 结论 下调GPM6B基因可抑制TGF-β1诱导的间充质细胞向平滑肌细胞分化。     

KLF2介导自噬对颅内动脉瘤血管平滑肌细胞表型调节的影响

目的探讨Krüppel样转录因子(KLF2)在颅内动脉瘤组织中的表达及其介导自噬对血管平滑肌细胞(VSMCs)表型调节的影响。方法收集病人颅内动脉瘤组织,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western Blotting)检测颅内动脉瘤组织中KLF2表达;将VSMCs分为control组、shNC组、shKLF2组、pcDNA3.1/NC组、pcDNA3.1/KLF2组和pcDNA3.1/KLF2+3-MA组。shNC组、shKLF2组、pcDNA3.1/NC组、pcDNA3.1/KLF2组分别转染shNC、shKLF2、pcDNA3.1/NC和pcDNA3.1/KLF2质粒,pcDNA3.1/KLF2+3-MA组在转染前加入10μmol/L 3-MA预处理6 h。qRT-PCR和Western Blotting检测沉默KLF2在VSMCs中的表达;Edu实验检测沉默KLF2对VSMCs增殖能力的影响;Transwell细胞迁移实验检测沉默KLF2对VSMCs迁移能力的影响;Western Blotting检测沉默KLF2对VSMCs中微管相关蛋白1A/1B-轻链3(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)蛋白比例和表型调节相关蛋白水平的影响。结果与正常组织比较,颅内动脉瘤组织KLF2表达升高(P<0.001);与shNC组比较,shKLF2组VSMCs中KLF2表达水平降低(P<0.001),Edu阳性细胞比例下降(P<0.01),细胞迁移数量减少(P<0.001),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平比例下降(P<0.001);与pcDNA3.1/NC组比较,pcDNA3.1/KLF2组VSMCs中人平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin),人平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)蛋白表达水平下调(P<0.001),基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达水平上调(P<0.001)。与pcDNA3.1/KLF2组比较,pcDNA3.1/KLF2+3-MA组VSMCs中SM-α-actin、SM-MHC蛋白表达水平上调(P<0.01),MMP-3、TNF-α蛋白表达水平下调(P<0.05)。结论KLF2在颅内动脉瘤组织中高表达;沉默KLF2抑制VSMCs增殖、迁移和自噬,进而可能抑制VSMCs的表型调节。     

Platelet-derived growth factor-BB-induced suppression of smooth muscle cell differentiation.

Previously, we demonstrated that treatment of postconfluent quiescent rat aortic smooth muscle cells (SMCs) with platelet-derived growth factor (PDGF)-BB dramatically reduced smooth muscle (SM) alpha-actin synthesis. In the present studies, we focused on the expression of two other SM-specific proteins, SM myosin heavy chain (SM-MHC) and SM alpha-tropomyosin (SM-alpha TM), to determine whether the actions of PDGF-BB were specific to SM alpha-actin or represented a global ability of PDGF-BB to inhibit expression of cell-specific proteins characteristic of differentiated SMCs. SM-MHC and SM-alpha TM expression were assessed by one- or two-dimensional gel electrophoretic analysis of proteins from cells labeled with [35S]methionine, as well as by Northern analysis of mRNA levels. Synthesis of both SM-specific proteins was decreased by 50-70% in PDGF-BB--treated cells as compared with cells treated with PDGF vehicle. Treatment of cells with 10% fetal bovine serum, which produced a mitogenic effect equivalent to that of PDGF-BB, decreased SM-MHC synthesis by 40% but increased SM-alpha TM synthesis. SM-MHC and SM-alpha TM mRNA expression was decreased by 80% at 24 hours in PDGF-BB--treated postconfluent SMCs, whereas treatment with 10% fetal bovine serum did not decrease the expression of SM-alpha TM mRNA but did inhibit SM-MHC mRNA expression by 36%. Consistent with the absence of detectable PDGF alpha-receptors on these cells, PDGF-AA had no effect on either mitogenesis or expression of SM-MHC or SM-alpha TM.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)     

结核性气道狭窄中SIRT1对气管成纤维细胞增殖速度及分化的影响研究

目的观察沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)在结核性气道狭窄气道增生肉芽组织中的表达及对气管成纤维细胞增殖速度与分化的影响。方法免疫组化染色检测气道增生肉芽组织与正常组织中SIRT1与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达水平。CCK-8法和流式细胞术分别检测细胞增殖活性与周期分布,免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表达,蛋白质印迹法(Western blot)检测增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen I,CoL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ,CoL-Ⅲ)蛋白表达水平,qRT-PCR检测CoL-Ⅰ、CoL-ⅢmRNA表达水平。结果结核性气道狭窄组中SIRT1与TNF-α阳性表达率较正常对照组升高(P<0.05)。与TGF-β1组比较,siRNA-SIRT1+TGF-β1组气管成纤维细胞增殖水平下降(P<0.05),G0/G1期细胞比例减少而S期细胞比例增加(P<0.05),α-SMA阳性染色减弱,PCNA、TNF-α、CoL-Ⅰ、CoL-Ⅲ蛋白表达均下降(P<0.05), CoL-Ⅰ、CoL-ⅢmRNA表达也下降(P<0.05)。结论 SIRT1在结核性气道狭窄患者的气道增生肉芽组织中表达增加,沉默SIRT1可抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞的增殖速度与分化,并阻滞细胞周期。     

蛋白激酶Cβ_2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤

目的 研究蛋白激酶C(PKC)β_2、PPARα在高糖诱导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系.方法 将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照(L,NG+20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖卒载体转染(NN,NG+Ad5-null)组、高糖PKCβ_2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ_2)组、高糖+非诺贝特(HF,HG+40 μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ_2转染+非诺贝特(HBF,HB+40μmol/L非诺贝特)组,另以非诺贝特共孵育20 min作为HF20组,以上各组细胞均培养6 d.以RT-PCR 检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果 (1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(均P<0.05);HB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达较HG组进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(均P<0.05).HF组VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(均P<0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义.(2)HG组PPARa蛋白表达较NG组减少了20%,HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%,与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%(P<0.05).(3)HG诱导PKCβ_2核转位激活,定量分析示HG组浆/核荧光强度比值较NC组降低37%(P<0.05),HB组PKCβ_2核转位与HG组相比更加明显.结论 高糖通过诱导HUVECs PKCβ_2核转位,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达.     

法舒地尔抑制大鼠肝纤维化组织ROCK-Ⅰ、α-SMA、p-MBS Thr-697表达

目的 探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase,ROCK)-Ⅰ选择性阻断剂法舒地尔对大鼠肝纤维化组织ROCK-Ⅰ、α-SMA和p-MBS Thr-697表达及细胞骨架变化的影响.方法 应用Western blot方法测定肝组织...     

人双突变型低氧诱导因子α促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的 探讨人双突变型低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因(HIF-1α-402-564)对与心肌细胞共培养的骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化的影响.方法 实验分为4组:HIF-1α组(MSC+心肌细胞+Ad-HIF-1α)、LacZ组(MSC+心肌细胞+Ad-Lacz)、Sham组[MSC+心肌细胞+胎牛血清(PBS)]、MSC+HIF-1α组(MSC+Ad-HIF-1α),前三组中MSC与心肌细胞按1:2比例共同培养,各组细胞培养24 h后分别感染不同病毒(MOI=100)或加入PBS液.病毒感染后7 d,免疫细胞化学分析共培养的MSC表达心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)的情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析各组细胞HIF-1α、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad4、NKx2.5、GATA结合蛋白4(GATA-4)的mRNA表达量.结果 HIF-1α组MSc心肌细胞分化率为(32.68±6.52)%,显著高于LacZ组[(8.28±0.09)%]和Sham组[(10.25±2.20)%],P均<0.05,MSC±HIF-1α组仅为(0.32±0.05)%.LacZ组和Sham组间差异无统计学意义.MSC+HIF-1α组与Sham组比较,差异有统计学意义(P<0.05).HIF-1α组TGFβ1及Smad4 mRNA表达水平明显高于其余各组,P均<0.05.HIF-1α组NKx2.5和GATA-4 mRNA表达水平明显高于Sham组,P均<0.05.结论 HIF-1α能够促进与心肌细胞共培养的MSC向心肌细胞分化,TGF-β1/Smad4信号通路参与了该过程.     

基质交感分子1对大鼠内皮祖细胞细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰技术沉默基质交感分子1(STIM1)基因后对内皮祖细胞(EPC)细胞周期的影响.方法 实验分为腺病毒阴性对照组(NSC组)、大鼠STIM1干扰腺病毒载体转染组(si/rSTIM1组)及大鼠STIM1干扰腺病毒载体与人重组STIM1腺病毒载体共转染组(si/rSTIM1+hSTIM1组).分离培养大鼠骨髓源性EPC,用构建好的STIM1干扰腺病毒载体和人重组STIM1腺病毒载体进行转染后,采用逆转录PCR检测细胞基质交感分子1表达,流式细胞技术检测细胞周期,激光共聚焦测量钙离子浓度,免疫共沉淀检测STIM1与瞬时受体电位通道1(TRPC1)之间的相互作用.酶联免疫吸附测定法检测大鼠1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)含量.结果 细胞转染后48 h,si/rSTIM1组细胞内STIM1 mRNA表达明显低于NSC组 (0.37±0.02比1.00±0.02,P<0.05),钙离子浓度低于NSC组(34.07±4.10 比86.51±14.12,P<0.05),EPC的细胞周期停止在G1期[si/rSTIM1组:(90.91±1.10)%,NSC组:(77.10±0.56)%,P<0.05],而si/rSTIM1+hSTIM1组细胞STIM1 mRNA表达、钙离子浓度及分布在G1期的细胞数均恢复到NSC组水平.免疫共沉淀实验显示STIM1与TRPC1蛋白分子在EPC上相互作用,IP3浓度在三组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 STIM1基因沉默通过降低EPC的钙离子浓度,导致细胞周期停滞在G1期,调控EPC细胞增殖,TRPC1的钙库操纵性钙通道参与STIM1对EPC钙离子浓度的调节.

Abstract：

Objective To investigate the effect of stromal interaction molecule 1 (STIM1) silencing on EPCs cell cycle. Methods Rat bone marrow derived endothelial progenitor cells (EPCs) were isolated and cultured in L-DMEM with 20% FBS. Ad-si/rSTIM1 and Ad-hSTIM1 were then transfected into EPCs and the expression of STIM1 mRNA was detected by RT-PCR. The cell cycle was determined using flow cytometry analysis and intracellular free Ca2+ was measured using LSCM. Co-immunoprecipitation was performed to examine the interaction between STIM1 and TRPC1. Protein levels of inositol 1, 4, 5-trisphosphate were analyzed with ELISA assay. Results Forty-eight hours after transfection, the expression of STIM1 mRNA was significantly downregulated (0.37±0.02 vs.1.00±0.02, P<0.05) and intracellular free Ca2+ level was significantly reduced (34.07±4.10 vs. 86.51±14.12,P<0.05) in Ad-si/rSTIM1 group compared with control group. The cell cycle was arrested at G1 phase[(90.91±1.10)% vs. (77.10±0.56)%, P<0.05]and the store-operated channel entry was strikingly inhibited in EPCs after treatment with Ad-si/rSTIM1. However, cotransfection of Ad-hSTIM1 with Ad-si/rSTIM1 significantly reversed these responses. Interestingly, co-immunoprecipitation study showed that STIM1 co-precipitated with TRPC1, and IP3 levels measured by ELISA were similar among three groups (P>0.05). Conclusion siRNA-mediated knockdown of STIM1 inhibited EPCs proliferation by reducing intracellular free Ca2+ through TRPC1-SOC signaling pathway.