人非小细胞肺癌细胞EGFR基因启动子甲基化与吉非替尼敏感性之间的相关性研究

目的 探讨EGFR基因启动子甲基化水平与人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株对吉非替尼敏感性之间的相关性。方法 用不同浓度吉非替尼分别作用于NSCLC细胞株HCC827、H1650、H1975、H358、H1299、A549后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,DNA直接测序法、实时荧光定量PCR法、免疫印迹法和甲基化特异性PCR法分别检测上述NSCLC细胞株EGFR基因突变、EGFR mRNA、EGFR蛋白表达和启动子区甲基化状态。结果 CCK-8法检测结果显示,19外显子缺失突变的HCC827细胞对吉非替尼最敏感,而同为19外显子缺失突变的H1650细胞对吉非替尼不敏感;野生型的H358细胞对吉非替尼中度敏感,其敏感性甚至超过19外显子突变的H1650细胞,而同为EGFR野生型的H1299、A549细胞对吉非替尼敏感性较差。吉非替尼处理72h后,HCC827细胞与H358细胞相比、HCC827细胞和H358细胞与其他4株细胞相比,IC50值均有显著性差异（P＜0.05）。HCC827细胞EGFR启动子为未甲基化状态,其EGFR蛋白和mRNA表达最高;H358细胞为部分甲基化,其EGFR蛋白和mRNA为中等表达;其他4个细胞株均为高甲基化状态,EGFR蛋白和mRNA呈低表达;HCC827细胞的EGFR表达水平较H358细胞高,HCC827和H358细胞的EGFR表达较其他4个细胞株高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 EGFR基因启动子区高甲基化可能下调EGFR基因的表达水平,从而降低NSCLC对吉非替尼的敏感性;对该基因的甲基化检测可能对预测吉非替尼治疗NSCLC疗效有一定的临床指导意义。     

miR-34a调控肺癌EGFR耐药细胞株中MET信号通路探讨

[目地]研究肺癌耐药细胞株HCC827/GR中MET信号通路的调控,明确肺癌获得性耐药的分子机制。[方法]使用HCC827细胞[epidermal growth factor receptor（EGFR）基因19外显子缺少的肺腺癌细胞株],在此细胞的基础上培养吉非替尼耐药细胞株。检测耐药细胞株中MET的表达,并使用RT-PCR的方法检测miR-34a的表达;使用TargetScan等生物信息学软件预测miR-34a的下游靶点,并在细胞内验证miR-34a是否可以调控MET的表达。[结果]与HCC827细胞相比,HCC827/GR细胞株对吉非替尼明显耐药。在耐药HCC827/GR细胞株中,miR-34a低表达,MET高表达,而在HCC827细胞株中,miR-34a高表达,MET低表达。Target Scan生物信息学软件提示,MET是miR-34a的下游靶点之一。将携带荧光报告基团和MET 3′UTR的载体与miR-34a共转染入细胞后荧光度下降。[结论]miR-34a可能通过调控靶基因MET而参与EGFR-TKI的获得性耐药。     

MAPK/ERK通路及泛素连接酶c-Cbl调控埃克替尼抑制肺癌HCC827细胞增殖和诱导细胞凋亡的研究

目的:研究MAPK/ERK通路及泛素连接酶c-Cbl调控埃克替尼抑制HCC827细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用机制。方法:采用MTT法检测HCC827对埃克替尼的敏感性,AnnexinV-PI流式细胞术检测细胞凋亡,Westernblot检测相关蛋白表达,SPSS18.0进行统计学分析。结果:埃克替尼处理HCC827细胞24h的IC50为155.6μmol/L。埃克替尼诱导HCC827细胞早期凋亡并具有剂量依赖性。Westernblot结果显示埃克替尼可诱导p-EGFR和p-ERK下调并引起c-Cbl下调。结论:埃克替尼能够明显抑制HCC827细胞增殖,诱导细胞早期凋亡。其机制可能与c-Cbl参与的p-EGFR和p-ERK蛋白表达水平下调,从而抑制细胞增殖通路活化有关。     

miR-21促进肺癌EGFR-TKI耐药细胞株上皮—间质细胞转化的研究

[目的]研究miR-21是否可以调控上皮—间质转化（EMT）而参与肺癌获得性耐药。[方法]使用HCC827细胞（EGFR基因19外显子缺少的肺腺癌细胞株）,在此细胞的基础上培养吉非替尼耐药细胞株HCC827/GR。检测耐药细胞株中miR-21的表达,同时观察耐药细胞的形态变化,及在耐药细胞株中抑制miR-21表达后检测耐药细胞株的侵袭能力及EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin的表达。[结果]与敏感细胞株HCC827相比,HCC827/GR细胞株对吉非替尼的耐药倍数约为100倍;同时在耐药细胞株中我们发现miR-21较敏感株表达增高约5.3倍,同时细胞形态发生了明显变化。通过检测EMT相关蛋白,我们发现耐药细胞株中间质相关蛋白Vimentin明显高表达,而上皮相关蛋白E-cadherin明显低表达,当miR-21被抑制后,耐药细胞株侵袭能力下降,同时Vimentin表达量下降,而E-cadherin表达量增高。[结论]miR-21可能通过促进EMT参与肺癌EGFR-TKI的获得性耐药。     

安罗替尼联合吉非替尼对吉非替尼耐药非小细胞肺癌PC9/GR细胞增殖的影响及其可能的作用机制

目的 探讨安罗替尼联合吉非替尼对吉非替尼耐药的人非小细胞肺癌PC9/GR（gefitinib resistance）细胞增殖的影响及其可能的作用机制。 方法 依据不同给药情况将PC9/GR细胞分为安罗替尼单药组、吉非替尼单药组、安罗替尼和吉非替尼联合用药组及阴性对照组,用MTT法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的周期分布,Western blot检测p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表达水平。 结果 安罗替尼和吉非替尼作用于PC9/GR细胞72 h的半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC₅₀）分别为（1.91±0.18） μmol/L和（4.83±0.15） μmol/L,两药均呈剂量依赖性的抗增殖作用,且两药联合时表现出明显的协同效应,联合指数（combination index,CI）小于1。安罗替尼和吉非替尼单药均可将PC9/GR细胞阻滞于G0/G1期（均P<0.05）。与各单药组比较,联合用药组表现出更明显的G0/G1期阻滞（均P<0.05）,且下调p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表达水平（均P<0.05）。 结论 安罗替尼联合吉非替尼对非小细胞肺癌 PC9/GR细胞具有协同抗增殖作用,且可增强吉非替尼敏感性,其协同抗肿瘤机制可能与诱导细胞周期阻滞和下调p-ERK1/2和p-AKT蛋白的表达相关。     

TIP30逆转人非小细胞肺癌吉非替尼耐药的实验研究

  目的  本实验旨在研究TIP30能否逆转非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）的吉非替尼耐药,并探讨其可能的机制。  方法  慢病毒LV-TIP30转染NSCLC吉非替尼耐药株PC9/GR上调TIP30,以PC9/GR、PC9/GR-LVTIP30和PC9/GR-LVNC为研究对象,分别加或不加5 μmol/L吉非替尼处理共6组细胞。CCK8检测细胞增殖抑制率,划痕修复实验、Transwell实验检测细胞迁移侵袭能力,免疫印迹实验检测p-AKT、p-ERK、p-MEK以及核内EGFR蛋白表达水平。  结果  非吉非替尼处理组中,PC9/GR-LVTIP30细胞的增殖、迁移和侵袭能力与PC9/GR细胞相比均受到明显的抑制（P < 0.05）,吉非替尼处理组中PC9/GR-LVTIP30细胞较PC9/GR细胞抑制作用更明显（P < 0.05）;过表达TIP30后,蛋白p-MEK、p-ERK、p-AKT表达水平降低,核内EGFR表达水平较PC9/GR降低,差异均具有统计学意义（P < 0.05）。  结论  上调TIP30能够逆转人非小细胞肺癌PC9/GR细胞对吉非替尼的耐药性,其发挥作用的机制可能是通过抑制EGFR核内化,进而抑制下游信号通路相关蛋白p-AKT、p-ERK、p-MEK激活发挥作用。      

塞来昔布联合吉非替尼对HCC827细胞凋亡影响机制探讨

目的探讨Cox-2抑制剂塞来昔布联合吉非替尼对肺癌EGFR 19号外显子E746-A750缺失细胞株HCC827细胞凋亡的影响及其可能机制。方法 RPMI1640培养HCC827细胞,分为正常对照组、塞来昔布组、吉非替尼组、塞来昔布加吉非替尼组。塞来昔布与吉非替尼药物浓度均为5、10、20、40、80μmol/L。药物干预细胞48h后,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法检测细胞中Cox-2和p-EGFR蛋白表达。结果 MTT结果显示,塞来昔布和吉非替尼单独用药时HCC827细胞的增殖受到明显的抑制,且随着药物浓度的增加,抑制作用逐步增强,药物剂量与细胞增殖抑制率呈正相关;塞来昔布与吉非替尼联合用药时对HCC827细胞呈现出更强的抑制作用,与单独用药相比差异有统计学意义,P<0.001;对照组细胞凋亡率为(0.26±0.09)%,塞来昔布组为(4.86±0.37)%,吉非替尼组为(8.53±0.78)%,塞来昔布+吉非替尼组为(23.28±1.63)%,组间比较差异有统计学意义,F=111.291,P<0.001,且两药联合时具有交互效应,F=90.440,P<0.001;蛋白质印记法结果显示,用药组较对照组Cox-2(F=185.351,P<0.001)和p-EGFR(F=61.328,P<0.001)蛋白水平均有不同程度的下调,其中两药联合组下调最为明显。结论塞来昔布与吉非替尼具有良好的协同作用,其机制可能与诱导凋亡、抑制EGFR的活化和下调Cox-2蛋白的表达有关,在治疗非小细胞肺癌中联合用药可能会具有较大的应用潜力。     

洛伐他汀克服非小细胞肺癌PC9细胞株吉非替尼耐药的体外研究

目的:研究联合洛伐他汀(lovastatin)和吉非替尼(gefi tinib)对体外诱导吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌细胞株PC9细胞凋亡以及相关蛋白表达的影响,并探讨其可能的机制。方法:应用洛伐他汀联合吉非替尼处理耐吉非替尼的非小细胞肺癌PC9细胞株后,采用WST-1法检测不同药物处理对PC9细胞增殖的影响,Hoechst33342荧光染色法观察细胞凋亡形态,FCM法观察细胞凋亡状况,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果:洛伐他汀联合吉非替尼可在体外诱导耐吉非替尼的PC9细胞凋亡,抑制其细胞增殖;洛伐他汀联合吉非替尼可诱导耐吉非替尼的PC9细胞中磷酸化表皮生长因子受体(phosphorylated epidermal growth factor receptor,p-EGFR)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)和磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-ERK1/2)蛋白表达水平明显下调。结论:在体外诱导吉非替尼获得性耐药的非小细胞肺癌细胞株PC9中,洛伐他汀可以克服吉非替尼耐药,两者具有良好的协同作用,提示两药联合对于出现吉非替尼耐药的非小细胞肺癌的临床治疗可能具有很大的应用潜力。     

顺铂联合吉非替尼对鼻咽癌细胞生长抑制及其机制的探讨

目的:探讨在鼻咽癌细胞中顺铂(DDP)是否能通过改变表皮生长因子受体(EGFR)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化蛋白水平以及对吉非替尼疗效的影响,寻找能够预测两者联合效应的分子指标。方法:MTT法分别测定CNE1、CNE2和SUNE1细胞中单药DDP和吉非替尼以及两药三种顺序联合的生长抑制率。蛋白质印迹法检测DDP、吉非替尼不同浓度对CNE1、CNE2细胞内EG-FR、p-EGFR、AKT以及p-AKT表达的影响。结果:DDP和吉非替尼单药在一定作用浓度内对CNE1、CNE2和SUNE1细胞生长抑制作用呈时间和剂量依赖性。随吉非替尼浓度增加,可以使CNE1、CNE2细胞中的p-EGFR、p-AKT表达下调。在CNE1细胞中,DDP与吉非替尼相互拮抗,且先用DDP后用吉非替尼较先用吉非替尼后用DDP拮抗效应更明显,P=0.039;DDP可以诱导CNE1细胞的p-EGFR和p-AKT表达水平下调。而在CNE2细胞中,DDP与吉非替尼相互协同,DDP可以诱导p-EGFR和p-AKT表达水平上调。结论:DDP与吉非替尼联合在CNE1和CNE2细胞中分别显示拮抗和协同效应。DDP对吉非替尼效应的影响可能是通过改变p-EG...     

吉非替尼敏感性不同的非小细胞肺癌中miRNA-7表达的差异及临床意义

目的检测吉非替尼敏感性不同的非小细胞肺癌中miR-7的表达差异,并探讨其临床意义。方法采用吉非替尼(Gefitinib)药物大剂量冲击法诱导H827,建立耐吉非替尼肺癌细胞亚系H827-7/GR,有限稀释法将H827-7/GR细胞单克隆化,CCK-8法检测耐药前后细胞株及各单克隆细胞对吉非替尼的敏感性;RT-PCR方法检测H827、H827-7/GR和耐药单克隆细胞株以及其他对吉非替尼敏感性不同的肺癌细胞株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的表达差异。结果 H827/GR耐药指数大于100;获得的6株耐药单克隆细胞株对吉非替尼的半生长抑制浓度(the half growth inhibition concentration,IC50)值不同;和吉非替尼敏感株H827相比,诱导的耐药细胞株H827/GR、耐药单克隆细胞株和吉非替尼耐药株A549、H358、H1299、H1650和H1975中miR-7的相对表达水平均降低(P<0.05)。结论在非小细胞肺癌中,耐药细胞中miR-7的相对表达水平均较敏感细胞系降低,提示miR-7的低表达可能与非小细胞肺癌耐药性相关,其可能是潜在的肺癌药物敏感性预测分子标志物。     

MicroRNA-214 regulates the acquired resistance to gefitinib via the PTEN/AKT pathway in EGFR-mutant cell lines

Patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) who have activating epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations derive clinical benefit from treatment with EGFR-tyrosine kinase inhibitors ((EGFR-TKIs)- namely gefitinib and erlotinib. However, these patients eventually develop resistance to EGFR-TKIs. Despite the fact that this acquired resistance may be the result of a secondary mutation in the EGFR gene, such as T790M or amplification of the MET proto-oncogene, there are other mechanisms which need to be explored. MicroRNAs (miRs) are a class of small non-coding RNAs that play pivotal roles in tumorigenesis, tumor progression and chemo-resistance. In this study, we firstly successfully established a gefitinib resistant cell line-HCC827/GR, by exposing normal HCC827 cells (an NSCLC cell line with a 746E-750A in-frame deletion of EGFR gene) to increasing concentrations of gefitinib. Then, we found that miR-214 was significantly up-regulated in HCC827/ GR. We also showed that miR-214 and PTEN were inversely expressed in HCC827/GR. Knockdown of miR-214 altered the expression of PTEN and p-AKT and re-sensitized HCC827/GR to gefitinib. Taken together, miR-214 may regulate the acquired resistance to gefitinib in HCC827 via PTEN/AKT signaling pathway. Suppression of miR-214 may thus reverse the acquired resistance to EGFR-TKIs therapy.     

Effects of Src inhibitors on cell growth and epidermal growth factor receptor and MET signaling in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer cells with acquired MET amplification

The efficacy of epidermal growth factor receptor (EGFR)–tyrosine kinase inhibitors such as gefitinib and erlotinib in non-small cell lung cancer (NSCLC) is often limited by the emergence of drug resistance conferred either by a secondary T790M mutation of EGFR or by acquired amplification of the MET gene. We now show that the extent of activation of the tyrosine kinase Src is markedly increased in gefitinib-resistant NSCLC (HCC827 GR) cells with MET amplification compared with that in the gefitinib-sensitive parental (HCC827) cells. In contrast, the extent of Src activation did not differ between gefitinib-resistant NSCLC (PC9/ZD) cells harboring the T790M mutation of EGFR and the corresponding gefitinib-sensitive parental (PC9) cells. This activation of Src in HCC827 GR cells was largely abolished by the MET-TKI PHA-665752 but was only partially inhibited by gefitinib, suggesting that Src activation is more dependent on MET signaling than on EGFR signaling in gefitinib-resistant NSCLC cells with MET amplification. Src inhibitors blocked Akt and Erk signaling pathways, resulting in both suppression of cell growth and induction of apoptosis, in HCC827 GR cells as effectively as did the combination of gefitinib and PHA-665752. Furthermore, Src inhibitor dasatinib inhibited tumor growth in HCC827 GR xenografts to a significantly greater extent than did treatment with gefitinib alone. These results provide a rationale for clinical targeting of Src in gefitinib-resistant NSCLC with MET amplification. ( Cancer Sci 2009)     

磷酸化AKT与磷酸化EGFR在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的:评价磷酸化表皮生长因子受体(phosphorylated epidermal growth factor receptor,p-EGFR)及其信号转导通路下游分子AKT的活化形式磷酸化AKT(phosphorylated AKT,p-AKT)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达及其意义.方法:免疫组织化学法检测95例NSCLC组织中p-AKT和p-EGFR蛋白的表达,并分析2种蛋白表达之间的关系及与预后的相关性.结果: p-EGFR的阳性表达率为57.89%(55/95),在低年龄组(33/46)、女性组(24/30)和腺癌组(35/52)的表达率较高,差异有统计学意义(P=0.008, P=0.003, P=0.009).p-AKT的阳性表达率为66.32%(63/95),在低分化组(20/23)、有淋巴结转移组(29/37)和肿瘤较小(≤3 cm)组(36/46)的表达率较高,差异有统计学意义(P=0.036,P=0.047,P=0.017).单因素分析显示,p-AKT和p-EGFR蛋白表达与预后无关(P=0.854,P=0.729).多因素分析显示,2种蛋白表达与生存时间也无关(P=0.497,P=0.731).p-AKT表达与p-EGFR表达呈正相关性(r=0.204,P=0.047).结论:p-EGFR和p-AKT的阳性表达率对NSCLC患者预后无提示意义,二者均不能成为预后指标.     

瑞香狼毒提取液逆转EGFR-TKI耐药肺腺癌H1975细胞的作用及其机制

目的:探讨瑞香狼毒(stellera chamaejasme L,SCL)乙醇提取液逆转表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI)耐药肺腺癌H1975细胞的作用及其机制.方法:用MTT法检测SCL、吉非替尼(gefitinib)及两药联用对H1975细胞的抑制率,细胞划痕实验检测药物对H1975细胞迁移的影响,流式细胞术测定药物对细胞凋亡的影响,Western blotting检测不同药物处理后各组肿瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及细胞通路关键分子p-EGFR的表达.观察SCL联用gefitinib后裸鼠移植瘤的体积和总生存期(OS),ELISA检测荷瘤裸鼠血清中Bcl-2、p-EGFR含量.结果:SCL对H1975细胞IC50为(21.35±2.11)mg/ml,gefitinib的IC50为(11.21±1.68) μmol/L.SCL联用gefitinib后H1975细胞抑制率明显高于gefitinib(1 μmol/L)和SCL(5 mg/ml)两组单独应用[(49.78±7.09)％ vs (8.45±2.57％)、(12.88±3.64)％,均P＜0.01],两药联用H1975细胞迁移指数明显低于gefitinib和SCL两组单独应用[(22.4±6.5)％ vs (70.3±4.9)％、(67.1±10.5),均P＜0.01],流式细胞仪检测显示两药联用细胞凋亡率明显高于两者单用[(51.68±6.56)％ vs(9.88±2.71)％、(9.48±2.45)％,均P＜0.01],Western blotting检测H1975细胞凋亡相关蛋白发现,联用组可明显降低Bcl-2和p-EGFR的表达(P＜0.01).抑制移植瘤实验显示,联用药组荷瘤小鼠肿瘤生长缓慢,OS明显延长(P＜0.01).结论:SCL可逆转肺腺癌H1975细胞对EGFR-TKI的耐药,其机制可能与降低EGFR的磷酸化、下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达有关,从而为EGFR-TKI耐药肺腺癌治疗提供了新思路.     

非小细胞肺癌中ARL4C的表达及其在EGFR-TKI耐药中的作用

目的 探讨非小细胞肺癌中ARL4C的表达及其与临床病理特征的关系以及在EGFR-TKI耐药中的作用。方法 收集63例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织，qRT-PCR法检测ARL4C的表达并分析其与临床病理特征之间的关系。qRTPCR和Western blot法检测ARL4C在各细胞株中的表达，MTS检测细胞活性及IC50的变化，Transwell侵袭实验检测ARL4C表达变化对细胞侵袭能力的影响。结果 非小细胞肺癌组织中ARL4C表达水平低于癌旁组织（P<0.05），其表达水平与淋巴结转移、TNM分期和肺膜侵犯密切相关（P<0.05）。TKI耐药细胞株HCC827/ER中ARL4C在mRNA以及蛋白表达水平相较对照细胞株HCC827显著下调（P<0.05）；ARL4C过表达细胞株HCC827/ER/ARL4C-OEIC50显著下降（P<0.05），Transwell分析结果显示过表达ARL4C后肺癌细胞的侵袭能力受到抑制（P<0.05）。结论 ARL4C异常表达与非小细胞肺癌淋巴结转移、TNM分期和肺膜侵犯密切相关。过表达ARL4C能提高非小细胞肺癌细胞对EGFR-TKI药物的敏感度并抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭能力。