乙肝病毒活跃复制与肝细胞癌发生的相关性研究

目的 前瞻性队列研究启东肝癌高发区人群HBV HBeAg、cccDNA的表达与肝细胞癌发生的相关性。方法 对1989--2002年启东地区377例HBV感染的男性患者进行随访，采集系列血清，监测肝细胞癌的发生，选取其中发生肝癌的32例患者与32例非肝癌慢性HBV患者作对照，组成巢式病例对照研究队列。采用ELISA法检测血清HBeAg，半巢式PCR扩增HBV cccDNA并经序列测定证实。结果 血清HBeAg在肝癌组和对照组的阳性率分别是53．1％和15．6％（OR=6．12，P＜0．01）。HBV cccDNA，在肝癌组和对照组的阳性率分别是62．5％和21．8％（OR=5．73，P〈0．01）。结论 慢性HBV感染的中年男性，HBeAg和ccc DNA反映的HBV复制的活跃程度与肝癌的发生密切关联，可作为预测肝癌发生的风险指标。     

原发性肝癌与乙型肝炎病毒基本核心启动子和前C区基因变异的相关性

目的 研究原发性肝癌（PLC）与HBV基本核心启动子（BCP）和前C区基因变异的相关性。方法对144例HBsAg（＋）PLC患者的血清进行HBV标志物和HBVDNA检测,对HBeAg（-）但HBVDNA（＋）的样本再采用实时荧光定量PCR进行前C区和BCP区基因变异检测。随机选取120例慢性乙型肝炎（CHB）患者作为对照组。结果PLC患者血清HBV标志物中HBeAg（＋）46例,占31．94％,HBeAg（-）98例,占68．06％。在98例HBeAg（-）患者的血清中,HBVDNA（＋）56例,占57．14％,其中前C1896变异43例,占76．79％,BCP1762／1764基因变异50例,占89．29％,共同变异38例,占67．86％。PLC患者中的前C1896和BCP1762／1764基因变异率高于CHB患者,且差异有统计学意义（X^2值分别为9．36和5．77,P值均〈0．05）。结论PLC的发生可能与前C区和BCP区基因变异有关。     

HBV基本核心启动子和前C区变异的深度测序分析

目的利用Ion Torrent PGM深度测序技术,探讨乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎（CHB）患者乙型肝炎病毒（HBV）基本核心启动子和前C区突变特征。 方法收集HBeAg阳性CHB患者血清样本25例,提取HBV DNA,采用巢式PCR方法扩增HBV基本核心启动子和前C区片段,构建深度测序文库,基于Ion Torrent PGM平台深度测序,生物信息学分析突变位点及其突变率;构建HBV基本核心启动子和前C区突变型和野生型参考质粒,作为深度测序质控品。 结果在25例HBeAg阳性CHB患者HBV基本核心启动子和前C区检出流行率达20%的突变位点10个：G1746A、A1752G/T、T1753C/G、A1762T、G1764A、C1817G/A、T1825C/A、A1846T、G1896A、G1899A;G1746A和T1825C/A的流行率分别达92%和100%。突变位点在HBV B基因型和C基因型感染者的分布情况显示,A1752G/T和G1896A主要流行于B基因型感染者（63.6% vs 0.0%,χ² = 12.374、P = 0.0007;72.7% vs 28.6%,χ² = 4.812、P = 0.0472）,A1762T和G1764A主要流行于C基因型感染者（27.3% vs 78.6%,χ² = 6.579,P = 0.0172）;C基因型感染者A1762T/G1764A突变率显著高于B基因型感染者,但差异无统计学意义（25.7% ± 28.4% vs 68.4% ± 42.7%,t = 1.614、P = 0.1326）。25例HBeAg阳性CHB患者中,32.0%患者仅有A1762T/G1764A突变,24.0%患者仅有G1896A突变,24.0%患者同时携带A1762T/G1764A和G1896A突变。 结论深度测序分析可用于定量检测HBV基本核心启动子和前C区突变,为HBV突变研究的临床应用提供了技术平台。     

乙型肝炎病毒大蛋白与HBeAg检测的临床意义

目的探讨HBeAg与乙型肝炎病毒（HBV）大蛋白（LHBs）、HBVDNA检测的临床意义。方法采集175例慢性乙型肝炎患者的空腹静脉血清,采用荧光定量PCR方法检测HBVDNA,采用ELISA法检测LHBs、HBeAg。结果116例HBeAg阴性患者中LHBs与HBVDNA的阳性率分别为64．66％（75／116）、58．62％（68／116）;59例HBeAg阳性患者中LHBs与HBVDNA的阳性率分别为98．31％（58／59）、94．92％（56／59）。两者比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。124例HBVDNA阳性乙型肝炎患者LHBs吸光度值与HBVDNA拷贝数对数呈正相关关系（r=0．989,P〈0．05）,不同HBVDNA拷贝数之间,LHBs含量差异有统计学意义（F=146．8,P〈0．01）。结论LHBs可以反映临床乙型肝炎病毒复制水平。能够反映HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒复制情况。     

广东汉族人群HBV基因型、基本核心启动子/前C区突变与肝癌易感相关性研究

目的研究广东汉族肝癌HBV基因型、基本核心启动子(BCP)/前C区突变与肝癌易感性的相关关系。方法按照病例对照研究设计方法,纳入HBV合并肝癌患者(病例组)100例和HBV携带者(对照组)100例,收集血清样本,提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV S区、BCP及前C区片段,双向测序,分析HBV基因型、BCP/前C区基因突变与HBV合并肝癌易感性的相关性。结果病例组BCP区A1762T/G1764A突变及前C区T1858C突变高于对照组,分别为92.0%和73.0%(P0.05)、52.0%和32.0%(P0.05);对照组A1775G突变发生率高于病例组,分别为31.0%和14.0%(P0.05)。多因素Logistic回归分析显示,HBV BCP区A1762T/G1764A突变和前C区T1858C突变与HBV合并肝癌发生独立相关[OR 6.508(95%CI:1.287~16.739,P0.05)和3.371(95%CI:2.268~8.163,P0.05)];而BCP区A1775G突变则为保护因素[OR=0.163(95%CI:0.043~0.489,P0.05)]。结论 HBV C基因型是广东深圳地区HBV合并肝癌的主要流行株,HBV BCP区A1762T、G1764A、A1775G、前C区T1858C基因多态性与HBV合并肝癌的易感性具有密切关系。     

阿德福韦酯治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎血清学应答的预测因素分析

目的探讨基线血清TNFα、ALT、HBVDNA载量及24周HBV血清学标志物等因素对阿德福韦酯（ADV）治疗HBeAg阳性慢性乙型肝炎（CHB）48周时患者血清学应答的预测价值。方法203例HBeAg阳性CHB患者口服ADV治疗48周,10mg/d。采用ELISA测定HBV血清学标志物和基线血清TNFα水平,荧光定量PCR检测HBVDNA,Logistic回归分析影响HBeAg阳性患者血清学应答的因素。结果203例患者治疗24周时HBV DNA转阴率为31．5％（64／203）,ALT复常率为59．1％（120／203）,HBeAg转阴率为15．8％（32／203）,HBeAg转换率为8．9％（18／203）,应答率为13．3％（27／203）;治疗48周时HBV DNA转阴率为58．6％（119／203）,ALT复常率为78．3％（159／203）,HBeAg转阴率29．6％为（60／203）,HBeAg转换率为16．7％（34／203）,应答率为25．6％（52／203）。Logistic回归分析发现,48周HBeAg转阴的患者较未转阴者的24周HBV DNA转阴率、HBeAg转阴率及转换率、基线TNFα水平高（P值分别为0．017、0．001、0．029和0．040）;48周HBeAg转换的患者较未转换者的24周HBeAg转换率高,而基线HBVDNA低（P值分别为0．000和0．004）。结论24周HBVDNA转阴率、HBeAg转阴率和转换率,及基线TNFα水平可以预测48周HBeAg转阴率,而24周HBeAg转换率和基线HBV DNA载量可以预测48周HBeAg转换率。     

C-myc基因扩增、p16基因变异和乙型肝炎病毒DNA整合与肝细胞癌的相关性研究

目的 探讨C－myc基因扩增、p16基因变异和乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合与肝细胞癌（HCC）的相关性。方法 应用差异聚合酶链反应（d-PCR)分析C－myc基因扩增,用聚合酶链反应（PCR）和单链构象多态（SSCP）分析p16基因变异,用PCR法检测整合型HBV－DNA。结论 （1）HCC组外周血、癌和癌旁肝组织中C－myc基因扩增阳性率分别为48％（14／29）、45％（13／29）和52％（15／29）,3者间差异无显著意义（x^2＝0．0008,P＞0．05,自由度ν＝2）,但明显高于肝硬化（LC）组外周血和LC组织阳性率[0(0/12)和8％（1／12）,P均小于0．05]。（2）29例癌组织中有3例p16基因纯合性缺失,未发现点突变。（3）正常肝、肝硬化和肝癌组织中整合型HBV－DNA阳性率分别为14／5（2／14）、67％（8／12）和97％（28／29）,3者间差异有显著意义（x^2＝29．4345,P＜0．01）。结论（1）HCC的发生与C－myc基因扩增密切相关;（2）HCC中p16基因的纯合性缺失发生频率为10％;（3）HBV－DNA整合与HCC的发生密切相关;（4）对外周血的检测能反映肝细胞（C－myc基因扩增和HBV－DNA整合情况。     

乙型肝炎病毒A1762T/G1764A突变与原发性肝细胞癌的关系

目的：对原发性肝细胞癌（HCC）、慢性乙型病毒性肝炎（CHB）及肝硬化（LV）患者肝组织中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）X基因基本核心启动子区（BCP）常见变异位点A1762T/G1764A进行检测分析,以探讨HBVX基因A1762T/G1764A变异与HCC发生发展的关系。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法检测67例患者（包括37例HCC,35例非HCC患者）肝组织中HBV X基因,并对PCR产物进行基因测序分析。结果：HCC组患者A1762T/G1764A突变率为85.7%（30/35）,非HCC组患者（包括CHB及LV）A1762T/G1764A突变率为40.6%（13/32）,HCC组双突变率明显高于非HCC组（P〈0.001）。结论：HBVA1762T/G1764A突变在HCC发生发展中可能起重要作用。     

PBMCs HBV逆转录酶mRNA表达与乙型肝炎的临床关系

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶mRNA存外周血单个核细胞（PBMCs）中的表达与乙型肝炎的临床关系。方法选择70例乙型肝炎患者（包括急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化）及10例HBsAg阴性的健康体检者。分别提取其PBMCs中的总RNA,经无RNA酶的DNA酶I消化去除残存的基因组DNA后,逆转录合成cDNA。以HBVP基因区设计合成逆转录酶引物进行PCR扩增,检测HBV逆转录酶的表达情况。对1例阳性标本进行了克隆和测序,将所得序列与Gen．Bank数据库中已知核苷酸序列进行同源性分析。结果所得基因序列为379个核苷酸,与实验设计相符。与HBVadw2亚型标准一级结构比较,同源性为93．7％。对照组无1例HBV逆转录酶mRNA阳性表达;急性乙型肝炎组阳性表达率较低,为5．3％（1／15）;慢性乙型肝炎组阳性表达率为33．3％（12／36）,两组阳性率差异有显著统计学意义（P〈0．05）;肝硬化组阳性表达率为26．7％（4／15）,与慢性乙型肝炎组比较,阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）。PBMCs中HBV逆转录酶mRNA表达阳性组与阴性组肝功能比较,大部分指标差异有显著统计学意义（P〈0．05）。PBMCs中HBV逆转录酶表达阳性率与血清HBeAg、HBVDNA阳性率之间无相关性（r=0．164、,=0．07）,其差异均无显著统计学意义（P〉0．05）。另外,乙型肝炎患者中,有家族史者的PBMCs逆转录酶mRNA阳性表达率占37．0％（10／27）,而无家族史者的仅占16．3％（7／43）,乙型肝炎患者的家族史与PBMCsHBV逆转录酶阳性表达有相关性（r=0．229）,差异有显著统计学意义（P〈0．05）。结论HBV逆转录酶在PBMCs中可独立复制,其表达与乙型肝炎的慢性化、重度化及家族聚集性有密切相关性,可为早期诊断指标之一。     

拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者的HBV逆转酶区突变模式

目的研究慢性乙型肝炎患者在拉米夫定（LAM）治疗过程中出现耐药后,HBV逆转录酶区基因的突变模式及临床特征。方法采用巢式PCR方法对2007年4月至2010年12月于沈阳市第六人民医院肝病门诊或住院诊治的共260例慢性乙型肝炎LAM耐药患者的HBV聚合酶基因逆转录酶区进行扩增,对PCR产物进行直接测序,回顾性分析LAM耐药时HBV聚合酶基因的不同突变模式及患者的临床特征。结果260例患者诊断为LAM耐药,215例患者检测到LAM相关的HBV聚合酶基因突变。患者血清HBVDNA为（5．41±1．29）log10拷贝／ml。98．1％（211／215）患者存在YMDD基序突变。其中3种主要突变类型分别为：单位点rtM204I突变占40．0％（86／215）;rtL180M＋rtM204V占37．2％（80／215）;rtL180M＋rtM204I占13．0％（28／215）。与rtM2041相比,rtM204V多以联合rtL180M突变的形式存在（P〈0．05）。LAM耐药时,单位点突变与联合突变类型患者的血清HBVDNA、ALT、年龄、HBeAgFH性与阴性,肝硬化与慢性乙型肝炎差异均无统计学意义（P〉0．05）。测出基因突变患者与伴生化学突破患者HBVDNA载量较高（P〈0．05）。结论YMDD基序突变是LAM耐药后HBV聚合酶基因突变的主要模式,LAM耐药后患者临床病情轻重可能与HBV聚合酶基因突变类型无关。     

不同HBVDNA水平乙型病毒性肝炎肝硬化患者的临床特征及HBeAg状态比较

目的研究乙型病毒性肝炎（乙肝）肝硬化活动期患者HBVDNA水平与HBeAg状态的分布和临床特点及意义。方法调查337例乙肝肝硬化住院患者,采用荧光定量PCR方法检测HBVDNA载量,MEIA法检测HBV血清标志物,常规方法检测肝功能,同时行超声检查。比较不同HBVDNA水平患者中HBeAg阳性和阴性、不同Child—Push分级和肝癌患者的比例,以及不同年龄患者中不同HBVDNA水平和HBeAg状态患者的比例。结果80．4％（271／337）患者HBVDNA阳性,31．5％（106／337）患者HBeAg阳性,68．5％（231／337）患者HBeAg阴性。HBVDNA水平越高者中HBeAg阳性者比例越高,HBeAg阴性者比例越低;不同HBVDNA水平患者中不同Child-Pugh分级患者比例差异无统计学意义,但HBVDNA3～41g拷贝／ml患者中肝癌的比例高于HBVDNA〈31g拷贝／ml患者（P=0．014）和≥71g拷贝／ml患者（P=0．009）;HBeAg阴性患者比例随年龄增大而增加,但HBeAg阳性患者与阴性患者的临床特征差异无统计学意义。结论绝大多数乙肝肝硬化患者HBVDNA阳性,且2／3患者HBeAg阴性。长期抗病毒治疗可能有助于改善乙肝肝硬化患者的病情和预后。     

慢性HBV感染者TNFα-308位点多态性与HBV C基因区突变的关系

目的 研究慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者肿瘤坏死因子α（TNFα）-308位点的基因多态性与HBV C基因区突变的关系.方法 对95例慢性HBV感染者进行研究,采用聚合酶链反应.限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）技术分析患者TNFα-308位点的多态性.对PCR产物直接测序,检测HBV C基因区nt1762/1764、nt1896、nt1899、nt1862、aa60、as87及aa97位点是否存在突变.采用Fisher＇s精确概率法比较TNFα-308位点不同基因型患者HBV C基因区常见突变的检出率.结果 TNFα-308位点共发现3种多态性,分别为G/G型63例（63/95,66.3%）,G/A型28例（28/95,29.5%）,A/A型4例（4/95,4.2%）.TNFα-308位点G/G、G/A、A/A基因型患者HBV C基因区aa87位点及as97位点突变型检出率均分别为39.3%（24/61）、11.5%（3/26）和50.0%（2/4）,差异有统计学意义（F=7.658,P〈0.05）;而nt1762/1764、nt1896、nt1899、nt1862以及aa60位点突变型检出率比较差异无统计学意义（F值分别为0.669、1.542、1.123、2.420和0.966,P值均〉0.05）.结论 慢性HBV感染者TNFα-308位点G/A基因型相对于G/G基因型不易发生HBV抗原性变异,有利于HBV的清除.     

肝移植术后HBV再感染患者HBV X区基因变异研究

目的 分析肝移植术后HBV再感染患者血清乙型肝炎病毒(hepatitis B viral,HBV)DNA X区基因的变异情况.方法 选择2002年6月至2003年12月期间因乙肝相关终末期肝病在本院行肝移植手术的320例患者,移植术后患者血清采用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBV DNA X区,并做直接测序分析.术后随访1.5～3年.结果 本组11例患者肝移植前、后HBV X区基因序列都有程度不等的点突变(5～39),有6例术前与术后同时具有nt1762(A→T)、ntl764(C→A)变异,11例患者同时存在ntl636～nt1741多处位点变异.结论 HBV DNA X区核苷酸nt1762、nt1764双位点变异在肝移植术后HBV再感染患者中是常见现象,免疫抑制剂不能改变该双位点变异.     

替比夫定治疗慢性乙型肝炎75例疗效及影响因素分析

目的：观察替比夫定治疗慢性乙型肝炎的疗效及不良反应并评估影响疗效的因素。方法采用替比夫定600 mg/日口服治疗75例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者,根据治疗24周时HBV DNA是否低于检测下限将所有患者分为A组和B组,根据基线ALT水平将所有患者分为2～5倍ULN组及＞5倍ULN组,根据基线HBD DNA水平将所有患者分为中低载量组（105拷贝/ml ≤ HBV DNA＜107拷贝/ml）及高载量组（≥107拷贝/ml）,分别计算治疗24周、48周、96周患者的ALT复常率、HBV DNA低于检测下限的比率、HBeAg血清转换率并进行比较分析。结果 A组和B组患者替比夫定治疗48周时的ALT复常率、HBV DNA低于检测下限的比率、HBeAg血清转换率分别为97.2% vs 66.7%、100% vs 33.3%、52.8% vs 12.1%（P ＜0.05）,治疗96周时A组与B组相比分别为94.4% vs 66.7%、97.2%vs 48.7%、55.6%vs 12.1%（P＜0.05）;基线ALT 2～5倍ULN组和＞5倍ULN组治疗96周时的ALT复常率、HBV DNA低于检测下限的比率、HBeAg血清转换率分别为77.8% vs 82.1%、58.3%vs 84.6%、19.4%vs 43.4%;基线HBV DNA中低载量组和高载量组治疗96周时的ALT复常率、HBV DNA低于检测下限的比率、HBeAg血清学转换率分别为75%vs 81.4%、87.5%vs 60.5%、53.1%vs 16.3%。结论替比夫定可迅速抑制HBV DNA复制,患者发生ALT复常、HBeAg血清学转换的比率较高,治疗24周HBV DNA下降幅度能较好预测治疗第48周、96周的疗效。     

肝癌患者术前HBV DNA定量水平与肝移植术后肝癌复发关系的探讨

目的 探讨肝癌肝移植患者术前乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA定量与肝移植术后原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)复发的关系.方法 回顾性分析2004年1月到2008年12月因同时合并HCC和HBV行肝移植手术并长期随访的148例患者,使用Kaplan-Meier生存分析统计患者生存率和无瘤生存率,根掘术后HCC是否复发将患者分成HCC复发组(43例)及未复发组(105例),使用COX多因素回归进行危险因素分析.结果 148例HCC肝移植患者1、3、5年生存率分别为86%,72%,72%,无瘤生存率分别为79%,71%,54%.肝移植术后HCC复发43例,复发率为29.1%(43/148),术后HCC平均复发时间为(13.16±14.17)个月(1～54个月).COX多因素回归分析表明超过米兰标准(HR=9.89;95%CI2.30～42.52;P=0.002)以及术前HBV DNA＞5log10 copies/ml(HR=2.26;95%CI1.01～5.04;P=0.047)是肝移植术后HCC复发的独立危险因素.结论 肝移植术前HBV DNA＞5log10 copies/ml和超过米兰标准是原发性肝癌患者肝移植术后HCC复发的高危因素.     

乙型肝炎病毒相关性肾炎的相关因素分析

目的 研究乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）的相关因素。 方法 采用回顾性病例对照研究。用Logistic回归对86例HBV-GN患者及135例非HBV-GN慢性HBV感染者进行比较。 结果 单因素分析结果显示,HBV-GN与男性（OR 2.79,95％CI 1.48～5.25,P = 0.001）、HBeAg阳性（OR 2.60,95％CI 1.49～4.53,P = 0.001）、HBV复制（OR 3.63,95％CI 1.80～7.33,P < 0.01）、肝硬化（OR 4.58,95％CI 1.41～14.91,P = 0.011)及谷丙转氨酶（ALT）升高（OR 2.53,95％CI 1.42～4.51,P = 0.002)相关。多因素分析结果显示,HBV-GN与男性（OR 2.21,95%CI 1.12～4.33,P = 0.022）、HBV复制（OR 2.77,95%CI 1.28～5.97,P = 0.01）、肝硬化（OR 4.55,95%CI 1.29～16.10,P = 0.019）及ALT升高（OR 1.96,95%CI 1.04～3.69,P = 0.037）相关。HBV-GN中,与IgA肾病型（HBV-IgAN）比较,单因素分析结果显示,经典型HBV-GN（膜性肾病或膜增生性肾炎型）与男性（OR 5.24,95％CI 1.64～16.81,P = 0.005）、HBV复制（OR 8.02,95％CI 2.15～29.84,P = 0.002）及ALT升高（OR 3.10,95％CI 1.00～9.67,P = 0.051）相关;多因素分析结果显示,仅与男性（OR 6.51,95%CI 1.76～24.11,P = 0.005）及HBV复制（OR 7.22,95%CI 1.68～30.97,P = 0.008）相关。结论 男性、HBV复制、肝硬化及ALT升高都可能是HBV-GN的易患因素。与HBV-IgAN比较,经典型HBV-GN与病毒复制及男性更相关,两者可能有不同的病理机制。