IL-24对卵巢癌SKOV3细胞侵袭和迁移影响的研究

[目的]探讨IL-24对人卵巢癌细胞株SKOV3侵袭和迁移的影响.[方法]将pcDNA3.1(-)-IL-24真核表达载体用脂质体转染法转染SKOV3细胞,用RT-PCR检测IL-24 mRNA表达情况,用24孔的膜滤器来测定侵袭和迁移细胞数,同时为了排除IL-24的抑制侵袭和迁移能力是由于其介导凋亡的结果,采用台盼蓝排除法测定细胞成活力.[结果]RT-PCT检测表明,IL-24于mRNA水平在SKOV3细胞中获得稳定表达,IL-24能抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移,其抑制作用并不是其介导凋亡的结果.[结论]IL-24能抑制卵巢癌细胞的侵袭和迁移.     

上皮性卵巢癌患者血和组织miR-200b表达水平及其与肿瘤侵袭程度的相关性分析

目的分析上皮性卵巢癌患者血浆和卵巢组织中微小RNA-200b(miR-200b)的表达水平及其与肿瘤侵袭程度的相关性。方法回顾性选取解放军第九七医院44例经手术病理确诊的上皮性卵巢癌患者为上皮性卵巢癌组,另同期选取32例因子宫腺肌病、子宫肌瘤和其它非卵巢病变行手术切除者为对照组。通过实时荧光定量PCR法对两组患者血浆和卵巢组织中miR-200b mRNA的表达水平进行检测;将人卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞分为空白对照组(未转染任何质粒)、阴性对照组(转染非特异序列siRNA)及实验组(转染miR-200b抑制物)。采用transwell细胞侵袭实验以观察肿瘤细胞的侵袭能力,并采用Western blot法测定基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平,并用实时荧光定量PCR法对MMP-9 mRNA相对表达量进行检测。结果上皮性卵巢癌组血浆中miR-200b mRNA的表达水平较对照组明显升高,且卵巢组织中miR-200b mRNA的表达水平较对照组亦明显升高(P 0. 01)。miR-200b抑制物经人卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞转染后,实验组miR-200b mRNA表达水平较空白对照组、阴性对照组明显下降(P 0. 01)。Transwell细胞侵袭实验结果发现,miR-200b抑制物经人卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞转染后,实验组transwell小室下层细胞数量较空白对照组、阴性对照组明显减少(P 0. 01)。相比空白对照组、阴性对照组,干扰miR-200b基因表达后实验组SK-OV-3细胞中MMP-9蛋白和mRNA的表达水平均显著下降(P 0. 01)。结论 MiR-200b高表达于上皮性卵巢癌患者血浆和卵巢组织中,其可能通过调节MMP-9蛋白和mRNA的表达水平以诱导上皮性卵巢癌细胞的迁移和侵袭。     

过表达上皮剪接调控蛋白1抑制胃癌细胞SGC-7901迁移能力的研究

目的探讨上皮剪接调控蛋白1(ESRP1)对胃癌SGC-7901细胞迁移能力的影响及其作用机制。方法利用脂质体介导法转染ESRP1真核表达载体于SGC-7901细胞后,采用划痕实验检测细胞迁移能力的变化;实时荧光定量PCR检测上皮间充质转化(EMT)过程相关标志物E-cadherin、N-cadherin分子的表达情况,采用t检验分析。结果与转染空载体对照组相比,过表达ESRP1后SGC-7901细胞迁移能力下降;伴随ESRP1表达增加,N-cadherin表达下调为对照组0.25倍、E-cadherin表达上调为对照组2.42倍。结论过表达ESRP1可能通过抑制EMT进程降低胃癌细胞SGC-7901的迁移能力。     

长链非编码RNA X失活特异转录物调控miR-340-5p对卵巢癌细胞上皮间质转化的影响

目的 探讨长链非编码RNA X失活特异转录物（lncRNA XIST）通过调控miR-340-5p对卵巢癌细胞上皮间质转化（EMT）的影响。方法 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测卵巢癌组织和细胞系中lncRNA XIST和miR-340-5p表达水平。A2780细胞分为Control组、si-NC组、si-lncRNA XIST组、si-lncRNA XIST+NC inhibitor组、si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor组。双荧光素酶实验证实lncRNA XIST和miR-340-5p的调控关系；划痕实验和Transwell法检测迁移和侵袭能力；RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色分析EMT标志蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）的mRNA和蛋白表达。结果 在卵巢癌组织和细胞系中，lncRNA XIST高表达，miR-340-5p低表达（P <0.05）。选择lncRNA XIST表达最高的A2780细胞作为转染对象。lncRNA XIST能够直接靶向下调miR-340-5p表达（P ...     

YB-1对卵巢癌细胞EMT标志蛋白表达及黏附能力的影响研究

目的研究Y-box结合蛋白(YB-1)对卵巢癌细胞上皮间质转化(EMT)标志蛋白表达及细胞黏附能力的影响。方法在卵巢癌细胞中转染p Genesil-1.1/YB-1 shRNA和p Genesil-1.1/shRNA control,筛选稳定转染的细胞记为YB-1 shRNA组和shRNA-NC组,把没有转染的细胞作为对照组。以Realtime PCR和Western blot方法检测细胞中YB-1表达水平。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)方法分别检测细胞增殖和黏附能力,用Western blot检测EMT标志蛋白上皮钙黏附素(E-cadherin)、神经型钙粘素(N-cadherin)和迁移侵袭相关蛋白基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移情况。结果 YB-1 shRNA组细胞中的YB-1表达水平明显低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞增殖率和黏附率低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞中E-cadherin蛋白水平高于对照组和shRNA-NC组,N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白水平低于对照组和shRNA-NC组,差异具有统计学意义(P0.05)。YB-1 shRNA组细胞侵袭和迁移数目低于对照组和shRNA-NC组(P0.05)。结论下调YB-1促进卵巢癌细胞E-cadherin表达,抑制N-cadherin表达,抑制细胞EMT,降低细胞黏附、侵袭、迁移能力。     

甲基双加氧酶对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的影响及机制

目的探讨甲基双加氧酶(TET2)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法通过在线数据库分析TET2与NSCLC患者预后的相关性;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot检测人正常支气管上皮细胞及非小细胞肺癌系中TET2的表达;瞬时转染si-TET2干扰序列,运用CCK8、克隆形成法检测细胞的增殖; Transwell法检测细胞的迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞周期变化; Western blot检测上皮间质转化(EMT)标志物以及N-cadherin、E-cadherin、Vimentin、Cyclin D1蛋白水平。结果 TET2高表达的患者总体生存率差,相比于人正常肺上皮细胞,TET2在NSCLC细胞株中高表达。敲低TET2可显著抑制A549、H1299细胞的增殖、迁移和侵袭(P 0.001),并将细胞周期阻滞于G_0/G_1期。Western blot结果显示,N-cadherin、Vimentin和Cyclin D1蛋白表达显著下调,E-cadherin表达显著上调(P 0.05或P 0.01或P 0.001)。结论 TET2可能通过影响细胞周期以及EMT的关键蛋白促进NSCLC的增殖、迁移和侵袭。     

慢病毒介导的赖氨酰氧化酶基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞上皮间质转化及转移潜能的影响

目的探讨慢病毒介导的赖氨酰氧化酶(LOX)基因对子宫内膜癌Ishikawa细胞上皮间质转化及转移潜能的影响及其机制。方法采用RT-PCR和Western blot检测人正常子宫内膜KLE细胞和子宫内膜癌Ishikawa细胞中LOX mRNA和蛋白的表达。将Ishikawa细胞随机分为对照组(未转染)、NC组(转染阴性对照慢病毒LV-NC载体)和LOX干扰组(转染慢病毒干扰LV-shRNA-LOX载体)。采用RT-PCR检测细胞中LOX mRNA表达,Western blot检测LOX、E-钙粘附蛋白(E-cadherin)、N-钙粘附素(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞的迁移能力。结果与KLE细胞相比,Ishikawa细胞中LOX mRNA和蛋白的表达水平均明显升高(P0.05)。与对照组相比,LOX干扰组细胞中LOX mRNA表达、LOX蛋白、N-cadherin蛋白、Vimentin蛋白、MMP-2蛋白和MMP-9蛋白表达均显著降低(P0.05),细胞侵袭和迁移能力减弱(P0.05),而E-cadherin蛋白表达升高(P0.05);NC组和对照组间以上指标均无显著差异(P0.05)。结论下调LOX表达可通过引起N-cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9表达下降、E-cadherin表达升高,降低子宫内膜癌Ishikawa细胞上皮间质转化及转移潜能。     

整合素连接激酶对鼻咽癌细胞系迁移及上皮-间充质转化的影响

目的:探讨整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)对鼻咽癌细胞迁移及上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)转化的影响及其作用机制。方法:通过脂质体介导将ILK SiRNA转染CNE2鼻咽癌细胞系,细胞分为siILK组、siGAPDH阳性对照组及siControl阴性对照组。RT-PCR和Western印迹检测鼻咽癌细胞系CNE2中ILK的RNA水平和蛋白水平表达的变化。Transwell实验和划痕试验观察ILK SiRNA对细胞迁移能力及侵袭能力的影响,RT-PCR法检测了与EMT过程中的相关基因mRNA的表达水平。结果:转染ILK SiRNA后,CNE2细胞中ILK mRNA和蛋白表达水平均明显下降;ILK SiRNA可明显抑制CNE2细胞的迁移及侵袭能力;上调E-cadherin的表达,下调OCLN,Vimentin,Twist1,FN1的表达,抑制EMT过程的发生。结论:ILK在鼻咽癌细胞系CNE2中高表达,降低ILK表达可诱导鼻咽癌细胞间充质-上皮细胞转型的发生,并因此而显著降低其侵袭和转移潜力。     

MiRNA-92a靶向PTEN通过PI3K/AKT信号通路促进卵巢癌细胞转移

目的:探讨miRNA-92a对卵巢癌细胞侵袭与迁移能力变化的影响和可能的作用机制。方法:RTqPCR检测卵巢癌组织和卵巢癌细胞miRNA-92a的表达水平;转染miRNA-92ainhibitor/mimic后,Transwell小室法检测SKOV3与A2780细胞的侵袭与迁移能力;蛋白质印迹法检测SKOV3与A2780细胞中p-PI3k,p-Akt和PTEN蛋白水平的变化;预测miRNA-92a靶基因并经双荧光素酶报告基因验证。结果:MiRNA-92a在卵巢癌组织和卵巢癌细胞中高表达(P0.05);转染miRNA-92a inhibitor后,SKOV3与A2780细胞的侵袭和迁移能力明显受到抑制,同时p-PI3k和p-Akt蛋白水平均显著降低,PTEN蛋白水平显著升高(均P0.05);转染miRNA-92a mimic后,以上指标相反;miRNA-92a靶基因为PTEN,且过表达PTEN能逆转过表达miRNA-92a诱导的侵袭转移与p-PI3k,p-Akt表达(均P0.05)。结论:MiRNA-92a直接结合靶基因PTEN,通过激活PI3k/Akt通路活性,促进卵巢癌细胞SKOV3的侵袭与迁移能力。     

钙敏感受体逆转子宫内膜癌细胞上皮-间充质转化

目的:探讨钙敏感受体(calcium-sensing receptor,CaSR)在缺氧环境下对子宫内膜癌细胞发生上皮-间充质转化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)的影响。方法:将子宫内膜癌Ishikawa细胞分别转染相应腺病毒,并分为空白组、空载组、沉默CaSR组和过表达CaSR组。将各组细胞进行缺氧后细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)法观察细胞骨架的变化;蛋白质印迹法及IF法检测钙黏附蛋白E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、CaSR蛋白表达变化;荧光染料Fura-2/AM示踪监测细胞内钙离子的浓度变化;Transwell迁移试验检测细胞侵袭迁移能力变化。结果:缺氧后,子宫内膜癌细胞的细胞骨架呈梭形样改变;同时E-cadherin表达降低,Vimentin和CaSR表达增加;子宫内膜癌细胞转染沉默及过表达CaSR腺病毒后细胞内钙离子内流分别减少及增加,而与Vimentin表达和细胞侵袭迁移能力呈负相关。结论:缺氧后子宫内膜癌细胞发生EMT及CaSR表达增加,而CaSR的表达增加抑制EMT发生,其机制可能与调控细胞钙离子有关。     

沉默缺氧诱导因子-1α对卵巢癌化疗敏感性的影响

目的观察沉默缺氧诱导因子HIF-1α对卵巢癌细胞化疗敏感性的相关影响并探讨其机理。方法构建HIF-1α基因短发夹RNA真核表达质粒,并转染卵巢癌细胞SKOV3（人卵巢浆液性囊腺癌细胞株）。实验可分为空白组,非特异对照组（转染pNonspecific-siRNA,即SKOV3NS）,目的siRNA组（转染pHIF-siRNA,即SKOV3siRNA）3组,用RT-PCR及Western Blot法分别检测各组HIF-1α基因的mRNA和蛋白的表达水平。细胞经过20μmol/L顺铂作用后,用MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术（FCS）检测细胞凋亡率。结果 SKOV3siRNA转染组HIF-1α基因在mRNA水平和蛋白水平表达均明显降低,SKOV3siRNA组肿瘤细胞的生长抑制率和细胞凋亡率均明显增高（P〈0.05）。结论 RNA干扰技术沉默HIF-1α能够有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞HIF-1α基因表达,增强其对化疗药物顺铂的敏感性。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷联合紫杉醇与氟尿嘧啶对人胃癌细胞系MKN-45裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza)联合临床化疗药物紫杉醇与氟尿嘧啶对于胃癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用和抑癌基因RUNX3 mRNA以及肿瘤转移相关蛋白E-cadherin与Vimentin表达的影响。方法建立胃癌细胞株MKN-45的裸鼠移植瘤模型,分为0.9%氯化钠注射溶液对照、5-Aza(2 mg/kg,每天1次)、化疗药物(1 mg/kg紫杉醇与5 mg/kg氟尿嘧啶,分别于治疗周期第1、8天用)以及5-Aza与紫杉醇及氟尿嘧啶联合用药,采用腹腔注射方法给药3周。观察各组裸鼠移植瘤的生长速度变化,并用RT-PCR方法检测肿瘤RUNX3基因的mRNA表达水平,免疫组织化学方法检测E-cadherin与Vimentin表达情况。结果胃癌细胞MKN-45裸鼠移植瘤模型经药物治疗3周后,与空白对照组相比,5-Aza组或T+F组的移植瘤生长速度明显减慢(P<0.05),而且5-Aza与T+F联合治疗组比单独处理组的肿瘤生长速度下降更为显著(P<0.05)。通过作用机制分析发现,与对照组相比,化疗药物T+F组RUNX3 mRNA及E-cadherin与Vimentin蛋白表达水平无明显变化;5-Aza处理组RUNX3 mRNA与E-cadherin蛋白表达水平有明显升高,Vimentin表达水平有明显下降;药物联合组RUNX3 mRNA与E-cadherin蛋白表达水平升高明显,而Vimentin表达水平下降更为显著。结论 5-Aza具有抑制胃癌裸鼠移植瘤生长与转移的能力,联合化疗药物紫杉醇与氟尿嘧啶处理效果更显著。5-Aza发挥肿瘤抑制功能可能是通过提高抑癌基因RUNX3基因表达实现的。     

RNA干扰核糖核苷酸还原酶M2对耐药卵巢癌细胞凋亡及侵袭性的影响

目的探讨RNA干扰核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)对耐药卵巢癌细胞凋亡及侵袭性的影响。方法将RRM2基因的特异性小干扰(siRNA)转染SKOV3/DDP设为干扰组,SKOV3/DDP细胞、SKOV3/DDP-RRM2非特异性阴性细胞设为空白组、阴性组。检测细胞增殖抑制率,计算RI、耐药转染率,荧光PCR技术检测RRM2基因mRNA表达,并分析siRNA转染对SKOV3/DDP耐药指数、RRM2蛋白的影响,采用Transwell观察SKOV3/DDP细胞侵袭能力。结果空白组、阴性组及干扰组转染率均90%。DDP对SKOV3/DDP细胞属低度耐药,吉西他滨对SKOV3/DDP细胞仍较为敏感。DDP、吉西他滨对干扰组、阴性组、空白组的DDP对细胞的半数抑制浓度(IC50)值比较,差异有统计学意义(P0.05),DDP、吉西他滨对干扰组细胞的IC50值显著低于阴性组、空白组(P0.05)。SKOV3/DDP细胞、SKOV3细胞RRM2蛋白的相对表达量比较,差异有统计学意义(P0.05),且转染Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组相对表达量均显著低于阴性组、空白组,其中以转染Ⅰ组细胞的RRM2蛋白相对表达量下降最显著(P0.05)。干扰组细胞凋亡率显著高于空白组、阴性组,穿膜细胞数显著低于空白组、阴性组(P0.05)。结论 siRNA可有效抑制RRM2基因在卵巢癌中的增殖与侵袭性,增加耐药细胞的药物敏感性,尤其是促进DDP诱导的耐药细胞凋亡。     

Soluble CD40 ligands sensitize the epithelial ovarian cancer cells to cisplatin treatment

ObjectiveCD154 (CD40L) is a protein that is primarily expressed on activated T cells and is a member of the TNF superfamily of molecules. It binds to CD40 on antigen-presenting cells (APC), which leads to many effects depending on the target cell type. Being an activator of immune cells, CD40L has also been shown to directly induce apoptosis in tumor cells by multiple mechanisms. To understand the role of sCD40L in regulating the proliferation of epithelial ovarian cancer cells treated or untreated with cisplatin.MethodsEpithelial ovarian cancer cells: SKOV3 and its cisplatin-resisitant strain SKOV3/DDP cells were used to test the effect of sCD40L and cisplatin. The proliferation of SKOV3 and SKOV3/DDP cells were measured by MTT. Cell cycle was assessed by flow cytometry. The mRNA expressions of targeted genes were detected by qRT-PCR. The protein expressions were detected by Western blotting.ResultssCD40L showed a significant dose-dependence inhibitory effect on the proliferation of ovarian cancer cell lines. sCD40L in combination with cisplatin could sensitized SKOV3/DDP cells to cisplatin treatment and reversed the drug resistance of SKOV3/DDP cells. The reversal ratios of 1 μg/ml sCD40L combined with cisplatin in SKOV3 and SKOV3/DDP cells were 2.11, 2.71, while the reversal ratios of 2 μg/ml sCD40L combined with cisplatin in SKOV3 and SKOV3/DDP cells were 3.78, 5.20, respectively. sCD40L or sCD40L combined cisplatin increased tumor cells in G0/G1 phase. sCD40L in combination with cisplatin decreased the expression levels of GST-π, LRP, Survivin, p53 and Bcl-2 in both epithelial ovarian cancer cell lines. The protein expression level of GST-π, LRP and P53 protein was also decreased upon sCD40L in combination with cisplatin although the expression level of Bcl-2 and survivin protein had no significant difference.ConclusionsCD40L inhibits the proliferation of SKOV3 and SKOV3/DDP cells. The combined application of sCD40L and cisplatin can strength the inhibitory effect of cisplatin, and to a certain extent, reversing the resistance to cisplatin in SKOV3/DDP cells. sCD40L could lead a cell block in G0/G1 phase and make the cell growth restrained. sCD40L could induce SKOV3 and SKOV3/DDP cells apoptosis and reverse drug resistance through cutting GST-π mRNA, LRP mRNA, survivin mRNA, p53 mRNA and Bcl-2 mRNA and decreasing the expression of GST-π, LRP and P53 protein in SKOV3 and SKOV3/DDP cells, which provides in-vivo experiment basis to the application of sCD40L as a drug improving ovarian cancer cells sensitivity to cisplatin.     

胃癌患者组织中EMT相关蛋白、TGF-β1 mRNA相对表达水平与淋巴结转移的相关性分析

目的观察胃癌患者组织中上皮间质转化(EMT)相关蛋白、转化生长因子(TGF)-β1 mRNA表达与淋巴结转移的相关性。方法将该院2016年1月至2020年11月收治的51例胃癌合并淋巴结转移患者纳入淋巴结转移组,另将该院同期收治的51例胃癌未合并淋巴结转移患者纳入无淋巴结转移组,收集患者资料,并进行回顾性分析。采用回归分析检验患者肿瘤分化程度,TNM分期,脉管内癌栓,EMT相关蛋白[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-链蛋白(β-catenin)],TGF-β1 mRNA相对表达水平与淋巴结转移的关系,并分析患者胃癌组织中EMT相关蛋白、TGF-β1 mRNA相对表达水平对淋巴结转移的预测效能。结果初步比较两组的基线资料后,经回归分析检验结果显示,胃癌患者肿瘤分化情况、病理分期、脉管内癌栓情况、胃癌组织内E-cadherin表达、Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相对表达水平均与患者淋巴结转移有关,肿瘤低分化、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有脉管内癌栓,胃癌组织中E-cadherin相对表达水平降低,Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相对表达水平升高均可能是胃癌患者淋巴结转移的风险因子(P<0.05);绘制受试者工作特征曲线发现,胃癌组织中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、TGF-β1 mRNA相对表达水平预测淋巴结转移的曲线下面积均>0.800,均有一定预测效能。结论胃癌患者组织中EMT相关蛋白、TGF-β1 mRNA相对表达水平与淋巴结转移密切相关,癌组织中E-cadherin相对表达水平降低,Vimentin、β-catenin及TGF-β1 mRNA相对表达水平升高可增加淋巴结转移风险,并可用于预测淋巴结转移。     

5-氮-2’脱氧胞苷对人卵巢癌细胞RUNX3基因启动子区甲基化状态的影响

目的研究抑癌基因RUNX3启动子区在人卵巢癌细胞系（3AO、SKOV3）及正常卵巢细胞系（NOEC）中的甲基化状态,以及5-氮-2’脱氧胞苷（5-aza-2＇-deoxycytidine）对人卵巢癌细胞3AO及SKOV3增殖与凋亡及RUNX3mRNA表达的影响,探讨RUNX3基因甲基化与卵巢癌发生及发展的关系。方法用甲基化特异性PCR（MSP）法检测经特异性甲基转移酶抑制剂5-氮-2’脱氧胞苷处理前后卵巢癌细胞3AO、SKOV3以及NOEC中RUNX3基因启动子区的甲基化状态;并用0．5、5、50μmol／L 5-氮-2’脱氧胞苷处理人卵巢癌细胞株3AO及SKOV3共3d,继续常规培养5d后,采用四唑盐（MTT）比色观察细胞经药物处理前后的生长活性,以半定量RT-PCR检测细胞经药物处理前后抑癌基因RUNX3mRNA的表达,应用流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测。结果正常卵巢细胞中未见RUNX3启动子甲基化,卵巢癌细胞3AO及SKOV3均发现RUNX3启动子甲基化现象;卵巢癌细胞3AO、SKOV3均可见RUNX3mRNA表达,但与正常卵巢细胞比较表达较弱,经药物处理癌细胞后其RUNX3mRNA的表达较前明显增强,且其表达强度与5-氮-2’脱氧胞苷的浓度存在剂量依赖关系;与加药前比较,5-氮-2’脱氧胞苷在0．5、5、50μmol／L浓度时均能明显抑制肿瘤细胞生长,随5-氮-2’脱氧胞苷浓度增加,细胞生长速率下降,加药前细胞凋亡率SKOV3为（2．71±0．81）％;3AO为（3．23±0．68）％,经5-氮-2’脱氧胞苷0．5、5、50μmol／L处理细胞后,细胞凋亡率SKOV3为（2．71±0．81）％、（15．43±1．33）％、（25．55±1．61）％;3AO为（10．66±2．09）％、（16．51±1．42）％、（25．46±1．55）％。与加药前比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）,且凋亡率与5-氮-2’脱氧胞苷浓度呈剂量依赖关系（F=138．7;142．3,均P〈0．05）。结论特异性甲基转移酶抑制剂5-氮-2’脱氧胞苷可逆转、恢复并增强人卵巢癌细胞系3AO及SKOV3中RUNX3基因表达,抑制癌细胞生长及诱导部分癌细胞凋亡。     

RMP 通过AMPK 通路调节线粒体稳态和氧化应激诱导卵巢癌细胞增殖与凋亡的机制研究

目的 探讨 RPB5调节蛋白（RPB5-mediating protein,RMP）对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响以及通过腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK）通路调节线粒体稳态和氧化应激的作用机制。方法 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)法检测人输卵管上皮永生化细胞 FTE-187与人卵巢癌细胞系 SKOV3, A2780和 HO8910中 RMP基因的表达。以 SKOV3细胞作为研究对象,利用 siRNA技术敲低 SKOV3细胞中 RMP的表达,再通过 qRT-PCR法验证 RNAi效率。通过平板克隆形成实验和流式细胞技术观察敲低 RMP表达后对 SKOV3细胞增殖能力、周期分布及凋亡能力的影响。通过激光共聚焦显微镜观察敲低 RMP表达后 SKOV3细胞中线粒体形态的变化。 Western blot进一步证实 RMP调控线粒体稳态相关蛋白 AMPK和 p-AMPK以及凋亡蛋白 Bcl-2和 Bax的表达。采用 ROS荧光法检测敲低 RMP表达后对 SKOV3细胞内 ROS水平的影响。结果 RMP在 FTE-187细胞中的表达水平为 1.00±0.13,在 A2780,HO8910和 SKOV3细胞中的表达水平分别为 1.58±0.19,1.88±0.17,2.15±0.10,较 FTE-187中的表达显著上升,差异有统计学意义（F=72.035,P＜ 0.001）。SKOV3细胞转染后, RMP-siR组 RMP表达水平为 0.86±0.20,较 control组（2.06±0.11）和 NC-siR组（1.92±0.23）显著下降,差异有统计学意义（F=90.220, P＜ 0.001）。平板克隆形成实验和流式细胞检测结果表明,敲低 RMP可以通过引起 G2/M期阻滞导致卵巢癌细胞增殖障碍,促进卵巢癌细胞凋亡。通过激光共聚焦显微镜观察到敲低 RMP表达后, SKOV3细胞中点状的线粒体明显增多,线粒体的碎片化也增多,导致线粒体稳态失衡。 Western blot结果表明, control组和 NC -siR组 p-AMPK表达水平分别为 0.75±0.12,0.77±0.17,敲低 RMP表达后, p-AMPK表达水平为 1.39±0.33,较 control组和 NC-siR组升高,差异有统计学意义（F=46.550,P＜ 0.001）。control组和 NC-siR组凋亡相关蛋白 Bax/Bcl-2比值分别为 0.55±0.11和 0.56±0.08,敲低 RMP表达后, Bax/Bcl-2比值增加为 1.57±0.22,差异亦有统计学意义（F=62.027,P＜ 0.001）。荧光显微镜观察到, control组和 NC-siR组荧光强度分别为 100.24%±8.76%和 103.07%±7.93%,敲低 RMP后其荧光强度为 295.14%±12.10%,显著高于 control组和 NC-siR组,差异有统计学意义（F=392.708,P＜ 0.001）。结论 RMP在卵巢癌细胞中呈高表达,敲低 RMP表达后可以通过激活磷酸化 AMPK通路导致卵巢癌细胞线粒体稳态失衡和氧化应激,诱导卵巢癌细胞在 G2/M期发生阻滞,进而抑制卵巢癌细胞增殖,促进其凋亡。     

Gli1表达抑制对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的 抑制Glioma-associated oncogene homoglog（GLI）基因在卵巢癌SKOV3细胞中的表达,探讨GLI1表达抑制对SKOV3细胞增殖的影响.方法 构建并筛选GLI1基因的RNAi表达质粒,转染SKOV3细胞,CCK-8法比较转染前后卵巢癌细胞增殖变化,流式细胞仪检测紫杉醇诱导转染前后细胞凋亡比例,流式细胞仪检测转染前后SKOV3的细胞周期情况.Westem blot检测cyclinD、Bcl-2及Capase3蛋白表达的影响.结果 转染48 h后,在SKOV3细胞中Control组、N-Control组、GLI1 shRNA-1组、GLI1 shRNA-2组、GLI1shRNA-3组、GLI1 shRNA-4组的GLI1 mRNA水平分别为1.00±0.00、1.03 ±0.02、0.73±0.07、0.98 ±0.08、0.53±0.08、0.68±0.04,与Control组相比,GLI1 shRNA-1、GLI1 shRNA-3、GLI1 shRNA-4组GLI1 mRNA表达量均下降（P＜0.05）,转染GLI1 shRNA-3的SKOV3细胞中GLI1蛋白表达水平低于GLI1 shRNA-1、GLI1shRNA-2、GLI1 shRNA-4组（P＜0.05）,具有显著的干扰效果.转染GLI1 shRNA-3的SKOV3细胞增殖受到明显抑制（P＜0.05）,在紫杉醇的诱导下细胞凋亡比例明显增加,细胞周期主要阻滞在G1/S期.Western blot检测发现Bcl-2蛋白表达下降（P＜0.05）,Capase3蛋白表达升高（P＜0.05）,细胞周期蛋白CyclinD1蛋白表达下降（P＜0.05）.结论 GLI1 shRNh对SKOV3细胞增殖抑制作用明显,促进细胞凋亡,GLI1信号可通过抑制cyclinD1活化抑制细胞恶性增殖.     

Role of TLR4 for paclitaxel chemotherapy in human epithelial ovarian cancer cells

Background  Paclitaxel has been reported to be a ligand to Toll like receptor 4 (TLR4). Myeloid differentiation factor 88(MyD88) was described as a myeloid differentiation primary response gene. TLR4 signalling owns two pathways: MyD88-dependent and MyD88-independent pathways. XIAP is a key member of the inhibitor of apoptosis protein family. Akt is a major downstream target of growth factor receptor tyrosine kinases, which negatively regulates apoptotic pathways through phosphorylation (pAkt). The aim of the present study is to investigate the role of TLR4 in paclitaxel resistance of ovarian cancer cells.
Materials and methods  We reconstructed the RNA interference expression vector, pGenesil-1-U6 specifically targeting TLR4 mRNA, which was stable transfected into the human ovarian cancer cell line SKOV3 (MyD88-positive expression) and A2780 (MyD88-negative expression). Cell proliferation, cell cycle distribution and cell apoptosis were assessed in the cells transfected with scramble control shRNA (SKOV3/shControl, A2780/shControl) and TLR4 shRNA (SKOV3/shTLR4, A2780/shTLR4) to explore the possible functions of TLR4 in ovarian cancer cells growth. The expression of TLR4, MyD88, XIAP, Akt and pAkt was analysed by Western blot analysis.
Results  A knockdown of TLR4 levels down-regulated the expression of XIAP and pAkt. And it restored the inhibitory effect of paclitaxel on cell proliferation and impeding cell cycle progression in SKOV3 cells.
Conclusions  It suggests that TLR4 negatively regulates paclitaxel chemotherapy and MyD88 is an essential downstream factor to TLR4 signalling for this resistance. Knockdown of TLR4 induces paclitaxel chemosensitivity which might depress the Akt pathway. The TLR4-MyD88 signalling represents an important source to promote tumour growth.