共聚比不同的两种聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物材料生物相容性观测

背景近年来,α-羟基酸及其衍生物合成的脂肪族聚酯,如聚乳酸、聚羟基乙酸等已广泛用于周围神经组织工程的支架材料研究,这种支架有可能克服因自体神经移植缺乏及供区的永久性失神经支配以及供受区神经匹配等问题,提高神经诱导作用.目的对共聚比为(8515)及(5050)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物材料的生物相容性及神经再生诱导作用进行对比观测.设计分组观察对比实验.单位解放军第三军医大学附属新桥医院骨科.材料清洁级健康成年Wistar大鼠66只,雌雄不拘,体质量180～200 kg;共聚比为(8515)及(5050)的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物.方法实验于2001-11/2002-12在第三军医大学大坪医院野战外科研究所6室,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.①许旺细胞的培养及与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜的共培养观察将培养的许旺细胞接种于聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜上,应用扫描电镜观察细胞在共聚物膜上的生长情况.②聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜材料肌肉包埋组织学观察取Wistar大鼠15只,实验动物按随机数字法分以1,2,4,8和12周为时相点分为5组,每组3只.将共聚物材料(8515)裁剪成10 mm×5 mm×0.3 mm的膜,植入大鼠椎旁肌内,各时相点切取包含聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜在内的周围组织进行苏木精-伊红染色.③聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管材料样品桥接大鼠坐骨神经缺损预实验取Wistar大鼠51只,分为共聚物8515管组、共聚物5050管组和硅胶管组,各组以2,4.6,8和12周为观察时相点,除12周为5只大鼠外,其余各时相点均为3只大鼠.于各时相点对各组材料进行大体观察及12周对大鼠进行再生神经运动传导速度测定,并取材桥接管中新生神经中段进行甲苯胺蓝染色,光镜观察.主要观察指标主要结局①大鼠肌肉包埋条件下聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物组织学观察.②坐骨神经缺损桥接大鼠实验模型应用组织学及神经电生理学检测聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管神经诱导作用.次要结局许旺细胞和共聚物共培养条件下许旺细胞的生长行为观察.结果66只大鼠均进入结果分析.①大鼠肌肉包埋条件下聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物组织学观察结果聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物早期诱发以淋巴细胞及成纤维细胞为主的轻度的非特异性炎性反应,持续到10～12周时基本消退.②许旺细胞的培养及与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜的共培养观察结果许旺细胞在聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物膜上能良好的生长并发生增殖.③大鼠体内神经桥接实验结果大体观察硅胶管促发有明显的纤维组织增生,而形成包囊包裹于管壁,而两种聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管组未见类似现象;12周再生神经运动传导速度聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物8515管组与硅胶管组无显著差别[(17.03±0.66),(17.15±0.76)m/s,P＞0.05];共聚物8515管组髓鞘厚度、神经纤维直径、轴突数及神经组织面积比与硅胶管组均无显著差别[(0.45±0.16)μm,(3.96±1.73)μm,(10 135±1 053)个/mm2,(23.4±2.7)%比(0.45±0.19)μm,(4.07±1.86)μm,(9 879±1 491)个/mm2,(23.6±3.1)%,P＞0.05];而聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(5050)管体内神经桥接4周时即出现破裂,不能为坐骨神经桥接提供良好的支持作用.结论与硅胶管及聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(5050)相比,聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(8515)是一种异物反应小、生物相容性佳,生物降解速率合适的周围神经组织工程材料.     

阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰许旺细胞与基质凝胶桥接损伤的坐骨神经

背景：周围神经损伤后给予外源性神经营养因子3对促进神经再生及保护肌萎缩均有作用。目的：观察阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞与细胞外基质凝胶桥接修复坐骨神经损伤的效果。方法：取80只成年Wistar大鼠制作左侧坐骨神经缺损模型,随机分组,以不同材料进行修复：细胞外基质凝胶组、许旺细胞-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组、神经营养因子3基因-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组、神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组。结果与结论：①腓肠肌肌肉组织学检查：术后8,12周神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组腓肠肌横截面积结构清晰、肌纤维粗大,呈基本正常肌肉结构,纤维组织较少,肌横截面积明显大于其他3组（P〈0.05,P〈0.01）。②肌细胞凋亡检测：术后4,8,12周神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组肌细胞凋亡数低于其他3组（P〈0.05）。表明阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞与细胞外基质凝胶可较好修复损伤神经,防止失神经肌萎缩细胞凋亡。     

许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的：观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤舯促进作用，为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。 方法：实验于2004-04／2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只，体质量180-220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组，每组8只。分笼饲养。另纳入5-8d龄spmgue-Dawley乳鼠40只，取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞；许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后，应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。 结果：Wistar大鼠24只全部进入结果分析，没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀，轴索略粗，髓鞘厚度有差别，部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构，许旺细胞包绕神经纤维，轴索内微丝微管结构较清晰，无髓神经纤维直径较小，不均匀分布在有髓神经纤维之间，由一层纤维结缔包裹形成纤维束，实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄，自体移植组再生神经纤维均较粗，许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘，髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形，并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率（有髓纤维总面积／神经干总面积）接近自体移植对照组，差异无显著性意义[（5344&;#177;592），（5514&;#177;373）；（3．13&;#177;0．16），（3．19&;#177;0．25）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（57．11&;#177;2．28）％；P〉0．05]；与空白对照组比较差异有显著性意义[（5344&;#177;592），（3191&;#177;236）；（3．13&;#177;0．16），（1．28&;#177;0．33）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（31．05&;#177;4．19）％；P〈0.05]。 结论：与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生，促进神经损伤修复，是临床修复神经缺损的可行办法。     

阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰许旺细胞与基质凝胶桥接损伤的坐骨神经☆

目的:观察阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞与细胞外基质凝胶桥接修复坐骨神经损伤的效果. 背景:周围神经损伤后给予外源性神经营养因子3对促进神经再生及保护肌萎缩均有作用. 方法:取80只成年Wistar大鼠制作左侧坐骨神经缺损模型,随机分组,以不同材料进行修复:细胞外基质凝胶组、许旺细胞-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组、神经营养因子3基因-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组、神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组. 结果与结论:①腓肠肌肌肉组织学检查:术后8,12周神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组腓肠肌横截面积结构清晰、肌纤维粗大,呈基本正常肌肉结构,纤维组织较少,肌横截面积明显大于其他3组(P <0.05,P <0.01).②肌细胞凋亡检测:术后4,8,12周神经营养因子3基因修饰许旺细胞-聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞外基质凝胶组肌细胞凋亡数低于其他3组(P <0.05).表明阳离子脂质体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞与细胞外基质凝胶可较好修复损伤神经,防止失神经肌萎缩细胞凋亡.     

组织工程人工神经诱导管的制作及其生物相容性观测

目的：观测聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[Poly(DL-lactide-co-glycolide)，PLGA]管生物相容性及其神经再生诱导作用。方法：采用肌肉包埋、雪旺细胞直接接种以及坐骨神经缺损桥接预实验的方法观察两种构成比不同的PLGA管[(85：15)或(50：50)]的生物相容性及其神经再生诱导作用。结果:①肌肉包埋条件下。PLGA早期诱发以淋巴细胞及成纤维细胞为主的轻度的非特异性炎性反应，持续到10-12周时基本消退。②采用细胞直接接种的方法，观察到雪旺细胞在PLGA膜上能良好的生长并发生增殖。③体内神经桥接情况下，硅胶管促发有明显的纤维组织增生，而形成包囊包裹于管壁，而两种PLGA管组未见类似现象。④与硅胶管组相似。PLGA(85：15)管能够顺利完成坐骨神经缺损桥接作用，再生神经电生理及组织学评价显示两组无明显差异，PLGA(50：50)管体内神经桥接4周时即出现破裂，不能为坐骨神经桥接提供良好的支持作用。结论：与硅胶管及PLGA(50：50)相比，PLGA(85：15)是一种异物反应生物相容性佳，生物降解速率合适的周围神经组织工程材料。     

神经营养因子和许旺细胞在脊髓损伤修复中的作用

目的：观察局部注射给予神经营养因子和许旺细胞，对大鼠脊髓损伤的修复作用。 方法：实验于2004-07／12在深圳第二人民医院完成。68只大鼠被分为正常对照组4只、空白对照组16只、神经营养因子组16只、许旺细胞组16只和神经营养因子复合许旺细胞组16只，空白对照组、神经营养因子组、许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组大鼠脊髓半横断手术后损伤部位分别给予生理盐水、神经生长因子和大鼠原代培养的许旺细胞，28d后考察大鼠运动能力和脊髓损伤节段背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平。 结果：68只大鼠均进入结果分析。①大鼠协调运动行为评价结果：脊髓半横断后损伤大鼠后肢运动明显受损，驻杆时间减少超过30％，单独的神经营养因子和单独许旺细胞处理能够在一定程度上恢复大鼠后肢协调运动能力，分别为对照的36％和65％，神经营养因子和许旺细胞协同作用效果理想，可达到正常对照的93％以上。②背根节中神经元降钙素基因相关肽表达水平检测结果：许旺细胞组和神经营养因子复合许旺细胞组阳性神经元数量和平均吸光度明显多于神经营养因子组[阳性神经元数量：（22．7&;#177;1．9），（31.3&;#177;5．3），（12．9&;#177;3．0）个／视野；平均吸光度：0．035&;#177;0．02l，0．075&;#177;0．033，0．023&;#177;0．011，P均〈0．01]。 结论：外源性给予神经营养因子的同时给予许旺细胞，能够更加优化神经修复微环境，有利于神经损伤后修复。     

构建神经再生室培养成年SD大鼠许旺细胞

目的：探讨从成年SD大鼠坐骨神经分离培养获得大量许旺细胞的有效手段。方法：实验于2005-05／1在解放军第四军医大学口腔医学院组织病理教研室和组织工程实验中心完成。①取成年SD大鼠1只截断坐骨神经5mm，缝接入20mm硅胶管中，形成神经再生室。7d后重新打开伤口，刨开硅胶管，截取再生室内神经段置离心管中作为实验组。②取SD仔鼠5只，无菌条件下取双侧坐骨神经混合于离心管中作为对照组。③将两组坐骨神消化培养。通过相差显微镜活细胞计数和S-100细胞化学标记相结合鉴定了许旺细胞增殖和纯化程度。结果：①两组培养的细胞光镜观察结果：实验组的许旺细胞密度高于对照组，特别是在培养4d后细胞的密度差别尤为显著。实验组的许旺细胞密度大于600个／mm^2，而对照组密度不足200个／mm^2。②两组许旺细胞免疫组织化学染色：实验组衬染后计数许旺细胞的纯度为（98．0&;#177;1.2）％，而对照组许旺细胞的纯度为（93．0&;#177;2．1）％（P〈0．05）。③两组细胞的生长曲线：培养7d，实验组细胞数量较对照组明显增加，达到（49．6&;#177;3．5）&;#215;10^7L^-1，远高于对照组的（31．7&;#177;3．9）&;#215;10^7L^-1。结论：从成年SD大鼠坐骨神经分离培养方法能获得大量高纯度的许旺细胞，为自体许旺细胞在修复周围神经缺损中的应用提供了可能。     

不同浓度许旺细胞与聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物修复损伤周围神经的比较

背景：有研究表明,许旺细胞神经移植复合体具有极强修复自体神经缺损作用,并且许旺细胞在神经再生过程中发挥至关重要的作用。目的：比较不同浓度许旺细胞神经移植复合体修复自体神经缺损时周围神经的再生效果。方法：建立坐骨神经缺损模型大鼠。原代培养大鼠许旺细胞,构建聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物管-细胞外基质凝胶-许旺细胞神经移植复合体修复坐骨神经缺损模型大鼠。按许旺细胞浓度的不同分为105,106,107,108,109 L-1结果与结论：建模后3,6和12周,含许旺细胞各浓度的神经移植复合体组各时间点神经传导速率均高于对照组（P 〈0.01）,其中10浓度组,对照组不含许旺细胞。分别于建模后3,6和12周,行运动神经传导速度的测定。建模后12周各组胫骨前肌湿质量测量和组织学观察。8 L-1组运动神经传导速度优于其他各浓度组（P 〈0.05）。建模后12周,大鼠胫骨前肌苏木精-伊红染色显示,各浓度许旺细胞神经移植复合体组正常肌纤维数均多于对照组（P 〈0.05）。其中许旺细胞浓度108,109 L-1浓度组胫骨前肌形态恢复较好,肌纤维细条样、波浪状,同向而行,长短、粗细及疏密大致一致。结果证实,108 L-1许旺细胞神经聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物移植复合体对缺损坐骨神经再生的促进作用较好。     

聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物复合膜修复坐骨神经损伤

背景：聚乳酸和聚羟基乙酸复合膜具有良好的生物相容性,稳定的机械强度,无毒副作用,可控的降解速率等特点。目的：观察聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物膜对大鼠坐骨神经损伤的修复作用。方法：手术显露36只Wistar大鼠坐骨神经,随机分成3组：假手术组游离坐骨神经后不作任何处理,对照组切断坐骨神经后行神经断端直接吻合,实验组于神经吻合断端包裹聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物膜。结果与结论：①神经电生理学检测：术后4,6周神经传导速度及波幅比较,对照组〈实验组〈假手术组（P均〈0.05）。②组织学检测：对照组神经与周围组织粘连严重,实验组吻合口光滑平整,聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物膜明显降解吸收,与周围组织无粘连,对照组有髓神经数量较假手术组、实验组明显减少,且轴突再生率和再生轴突成熟度较低。③辣根过氧化物酶逆行示踪检测：对照组被辣根过氧化物酶标记的阳性有髓神经纤维数量较假手术组、实验组明显减少。表明聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物膜能减轻神经术后粘连,促进神经再生。     

聚乳酸-聚羟乙酸／磷酸三钙薄膜预防屈肌腱粘连的实验

目的：探讨在屈肌腱损伤修复后应用和不应用聚乳酸-聚羟乙酸／磷酸三钙薄膜包裹两种情况下，术后不同时期屈肌腱的粘连情况和聚乳酸-聚羟乙酸／磷酸三钙薄膜在肌腱愈合过程中的作用。方法：实验于2004-03／10在东南大学修复重建外科研究所实验室进行。选取健康成熟的三黄鸡40只，以右足第2，3趾深屈肌腱横断后修复作为肌腱粘连的动物模型，取右足第2趾为实验趾、第3趾为对照趾。聚乳酸-聚羟乙酸／磷酸三钙薄膜包裹，术后3，4，8周分别取材。通过生物力学、大体观察、组织学及扫描电镜检查，观测肌腱愈合情况、与周围组织的粘连情况、屈趾功能及假鞘结构。结果：进入结果分析的实验鸡39只。①实验趾肌腱的屈趾功能明显优于对照趾[术后3周：（10．53&;#177;1．07），（7．78&;#177;0．37）mm，术后4周：（14．96&;#177;1.51），（9．37&;#177;1．35）mm，术后8周：（19．93&;#177;0．81），（11．47&;#177;0．15）mm，P〈0．05]。②大体观察实验趾在各时间段肌腱与腱周组织的粘连均较对照趾轻，肌腱为内源性愈合，并形成具有正常滑膜A、B型细胞的假鞘结构，与肌腱间有间隙。结论：聚乳酸-聚羟乙酸／磷酸三钙薄膜通过刺激周围组织形成假鞘，阻止来自腱周的粘连，且不影响肌腱正常愈合，是较理想的预防肌腱粘连材料。     

许旺细胞源神经营养因子对脊髓背根节感觉神经元的保护作用

背景：许旺细胞源神经营养因子是从许旺细胞胞浆中分离纯化出的一种活性蛋白质，能明显的维持脊髓前角运动神经元的存活和促进周围神经的再生。目的：观察许旺细胞源神经营养因子对周围神经高位损伤所致脊髓背根节感觉神经元死亡的保护作用。 设计：随机对照动物实验。 单位：深圳市第二人民医院。 材料：选用清洁级出生3周SD幼鼠30只，雌雄不拘。随机分为营养因子组和生理盐水对照组，各15只。两组动物均以左侧为正常侧，右侧为损伤侧。方法：实验于2003—05／2003—07在中山大学医学院实验动物中心完成。①两组大鼠均建立L4.5，神经根高位离断动物模型，并将近侧神经残端与硅胶管吻接。根据分组，胶管内分别注入许旺细胞源神经营养因子（60mg／L）或生理盐水各20μL，凡士林封固硅胶管两端。②术后4周处死动物取材，观察损伤神经根背根节感觉神经元的存活率和形态学变化。 主要观察指标：①两组鼠损伤侧坐骨神经再生情况大体观察。②两组鼠背根节神经元存活情况。②背根节神经元形态学变化。 结果：30只鼠全部进入结果分析。①两组鼠坐骨神经再生情况大体观察：营养因子组神经新生轴突沿硅胶管生长，长度达1cm；对照组新生轴突较细少，长度约0．8cm。②两组鼠背根节神经元存活情况：营养因子组背根节内有少量纤维组织增生，神经元丢失不明显，存活率是91．8％，对照组背根节内纤维组织增生明显，神经元大量丢失，存活率是58．6％，营养因子组神经元存活率较对照组高33．2％（P〈0．01）。③背根节神经元形态学变化：对照组背根节神经元的直径和面积显著低于营养因子组和正常侧[（21．8&;#177;1．4）μm，（373．1&;#177;50．9）μm^2（24．8&;#177;1．1）μm，（482．8&;#177;42．2）μm^2（24．5&;#177;1．3）μm，（471．5&;#177;51．4）μm2P〈0．01]，而营养因子组神经元直径和面积与正常侧相比差异无显著性（P〉0．05）。 结论：许旺细胞源神经营养因子对受损的背根节感觉神经元有明显的神经营养活性。     

肌筋膜管桥接修复面神经缺损的作用

目的：观察肌筋膜管替代神经材料对面神经缺损的修复作用，为进一步提高面神经功能提供理论依据。 方法：实验于2005-02／07在咸宁医学院神经组化研究室进行，选择日本大耳白兔24只，切去其双侧面神经上颊支0．5cm作为动物模型。肌筋膜管桥接组：以肌筋膜管桥接右侧面神经颊支的缺损：外膜直接缝合组：左侧面神经颊支被直接缝合，分别于术后5和8周进行大体观察，神经传导速度检测，组织学观察等，以比较两组（侧）面神经颊支的再生情况。 结果：实验白兔24只均纳入结果分析。①术后5和8周形态及组织学观察显示肌筋膜管桥接组瘢痕明显少于神经直接缝合的对照组。②术后5周时组织图像分析显示桥接段再生有髓轴突数目和再生（恢复）率，肌筋膜管桥接组明显优于神经直接缝合组[肌筋膜管桥接组：（1032&;#177;234）根／片和（23．72&;#177;7．26）％，外膜直接缝合组：（678&;#177;193）根／片和（15．70&;#177;5．23）％，t=2．52，P〈0．01]。③术后8周时电生理检测两组桥接段再生轴突的电传导速度显示肌筋膜管桥接组明显快于神经直接缝合组[肌筋膜管桥接组：（17．69&;#177;0．14）m／s；外膜直接缝合组：（14．82&;#177;0．12）m／s，t=2．390．P〈0．01]。 结论：在面神经损伤修复术中，肌筋膜管桥接治疗神经缺损的效果好于神经张力下直接缝合。     

组织工程人工神经诱导管的制作及其生物相容性观测

目的观测聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物[Poly(DL-lactide-co-glycolide),PLGA]管生物相容性及其神经再生诱导作用。方法采用肌肉包埋、雪旺细胞直接接种以及坐骨神经缺损桥接预实验的方法观察两种构成比不同的PLGA管[(85∶15)或(50∶50)]的生物相容性及其神经再生诱导作用。结果①肌肉包埋条件下,PLGA早期诱发以淋巴细胞及成纤维细胞为主的轻度的非特异性炎性反应,持续到10～12周时基本消退。②采用细胞直接接种的方法,观察到雪旺细胞在PLGA膜上能良好的生长并发生增殖。③体内神经桥接情况下,硅胶管促发有明显的纤维组织增生,而形成包囊包裹于管壁,而两种PLGA管组未见类似现象。④与硅胶管组相似,PLGA(85∶15)管能够顺利完成坐骨神经缺损桥接作用,再生神经电生理及组织学评价显示两组无明显差异,PLGA(50∶50)管体内神经桥接4周时即出现破裂,不能为坐骨神经桥接提供良好的支持作用。结论与硅胶管及PLGA(50∶50)相比,PLGA(85∶15)是一种异物反应生物相容性佳,生物降解速率合适的周围神经组织工程材料。     

兔坐骨神经电损伤后许旺细胞的增殖变化

目的：观察成年兔坐骨神经受到75V电压损伤后受损区域许旺细胞的变化。方法：实验于2004-10／2005-01在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成。选择中国本兔12只，随机分2组：损伤组9只，正常对照组3只，损伤组观察点为损伤后第3天，第7天，第10天，每个时间点3只。建立兔坐骨神经电损伤实验模型，应用双酶消化法分离受损区域神经许旺细胞，应用细胞计数和同位素^3H掺入胸腺嘧啶核苷观察许旺细胞的增殖变化情况。结果：12只中国本兔均进入结果分析。与正常对照组的细胞数（1．0&;#177;0．15）&;#215;10^4个／mL比较，成年兔在受到损伤后第3天细胞逐渐增多，为（3．2&;#177;0．85）&;#215;10^4个／mL，第7天明显增殖，达到（12&;#177;2．40）&;#215;10^4个／mL，第10天增殖情况较前下降，为（5．4&;#177;0．70）&;#215;10^4个／mL。相应的^3H掺人实验结果表现出同样的变化特征。结论：许旺细胞在神经的溃变和再生过程中，大量增殖，在第7天左右达到其生长和增殖的高峰，而后呈下降趋势。证明许旺细胞在受到一定程度的电压损伤后，依然具有分裂增殖的能力，而它的增殖是受损神经结构和功能恢复的基础。     

自体变性骨骼肌-神经束复合体修复大鼠坐骨神经缺损的实验

目的：观察自体变性骨骼肌-神经束“并联”复合体桥接大鼠坐骨神经缺损的修复效果及可行性。 方法：实验于2005—06／12在咸宁医学院神经组化研究室完成，将Wistar大鼠36只随机分为3组：复合桥组，神经桥组和肌桥组，每组12只。①模型制作：采用2％戊巴比妥钠溶液（0．1mL／50g）经腹膜腔注射麻醉后，显露并切去鼠的右侧坐骨神经一段使形成10mm缺损。另在复合桥组和肌桥组，切取股二头肌外缘纵行肌束，置于60℃水浴变性5min。②分组处理：复合桥组：将缺损远端神经行“束间分离”，等分为两束，切取10mm长的一束与自体变性骨骼肌束“并联”桥接于坐骨神经缺损处并用筋膜包裹；神经桥组：以自体神经原位桥接于神经缺损处；肌桥组：以自体变性骨骼肌束桥接于神经缺损处。③指标测试：术后24周，用肉眼观察桥接体及吻合口外形，取称大鼠双侧胫前肌湿质量，以术侧（右侧）与正常侧（左侧）湿质量百分比作为胫前肌湿质量恢复率；取移植体，以Bielschowsky镀银染色后，石蜡包埋，作纵、横切片，苏木精-伊红复染，光镜下观察和用彩色图像分析仪测量再生神经纤维的数目（密度）、平均直径及髓鞘厚度。 结果：实验大鼠36只均进入结果分析，术后24周时，①大体观察：复合桥组和神经桥组的桥接段均有完整的神经外膜和清晰的神经折光横纹，与周围组织粘连轻，吻合处质软，表面光滑，而肌桥组则无完整的神经外膜和神经折光横纹，与周围组织粘连较重，吻合口处质硬，表面粗糙；胫前肌（湿质量）恢复率：复合桥组和神经桥组均较肌桥组高，其差异有显著性[复合桥组（72．19&;#177;7．23）％，神经桥组：（75．01&;#177;6．21）％，肌桥组：（63．98&;#177;6．41）％，P〈0．05]。②再生神经纤维的数目（密度）：复合桥组和神经桥组均较肌桥组多（密）[复合桥组：（77．78&;#177;6．76）&;#215;10^4根／μm^2，神经桥组：（78．43&;#177;4．56）&;#215;10^4根／μm^2，肌桥组：（68．88&;#177;2．39）&;#215;10^4根／μm^2，P〈0．05]。③再生神经纤维直径和髓鞘厚度：复合桥组和神经桥组也较肌桥组粗厚[复合桥组：（6．56&;#177;1．58）μm和（1．21&;#177;0．25）μm，神经桥组：（7．22&;#177;1．57）μm和（1．34&;#177;0．22）μm，肌桥组：（6．22&;#177;1．57）μm和（1．10&;#177;0．17）μm，P〈0．05]。④复合桥组与神经桥组间各项检查指标比较差异均无显著性（P〉0．05）． 结论：缺损周围神经远段“束间分离”所得的自体神经与自体变性骨骼肌束“并联”复合桥体修复大鼠神经短距离缺损，其效果接近单纯的自体神经桥体而优于单纯的自体变性骨骼肌桥体，具有一定的临床应用价值。     

脊髓损伤大鼠后肢功能恢复与内源性神经营养素表达之间的关系

目的：观察随着脊髓不完全损伤后大鼠后肢功能恢复，内源性神经营养因子表达的变化。 方法：实验于1998-04／09在解放军第三军医大学野战外科研究所完成。Wistar大白鼠44只，脊髓功能观测组12只；脊髓形态观察组32只，随机分为正常组2只、手术假伤组15只和脊髓腹侧损伤组15只。脊髓功能观测组12只和脊髓腹侧损伤组15只造脊髓损伤模型；手术假伤组15只进行造模处理，但不损伤脊髓。脊髓功能观测组于脊髓受压前及脊髓受压迫损伤后6，24，72h，7，14，21d对受试动物进行后肢行为功能评定。脊髓形态观察组32只实验动物进行免疫组织化学染色．随机计数50个细胞，观察神经营养素脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子、神经营养素3的表达。 结果：44只实验大鼠均进入结果分析。①脊髓致伤后受试动物后肢出现明显瘫痪，随着时间的延长，脊髓功能得到逐步恢复。其中以伤后3-14d脊髓功能恢复最快，以后恢复较缓慢。②自伤后3h开始，脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子、神经营养素3的表达开始增加，并于伤后72h达到高峰；1周内神经营养素维持在相对较高的表达水平，2周后这几种神经营养素的表达明显减弱[伤后3h：（14．82&;#177;4．93），（9．77&;#177;4．97），（2．27&;#177;1．85），（10．35&;#177;5．56）；伤后72h：（45．22&;#177;15．61），（34．54&;#177;12．56），（13．89&;#177;7．58），（33．2&;#177;11．53）；伤后1周：（31．94&;#177;12，82），（15．69&;#177;11．53）．（7．17&;#177;4．92），（16．74&;#177;13．2）；伤后2周：（14．02&;#177;7．36），（6．97&;#177;4．05），（2．27&;#177;1．87），（9．7&;#177;5．62）]。 结论：伤后脊髓组织内源性神经营养因子的过度表达参与了伤后2周内脊髓功能的快速恢复，但内源性神经营养因子的表达是短暂的．延续内源性神经营养因子的表达有望进一步促进脊髓功能恢复。     

神经生长因子对胎兔许旺细胞培养的影响

目的：应用神经生长因子培养胎兔许旺细胞，观察许旺细胞生长的情况。方法：实验于2002-02／2004-05在河北医科大学第三临床医学院中心实验室和细胞培养室完成。怀孕28d的新西兰白兔，剖腹取出胎兔，取胎兔坐骨神经，剥干净外膜，用植块加差速贴壁联合法培养胎兔许旺细胞，纯化传代后的胎兔许旺细胞分成2组培养，一组加含神经生长因子的培养液，即实验组，另一组加常规培养液，即对照组。细胞传代后24h在每个培养皿中随机选取3个视野。开始初次细胞计数，以后在统一视野每天进行许旺细胞计数。增殖指数=各次观察细胞数／初次观察细胞数。结果：实验用剖腹取出胎兔8只，坐骨神经16根。60个观察视野，均进入结果分析。①在第6天见细胞从胎兔神经组织块周围爬出。②第8天细胞沿组织块向外生长，可见大量梭形的胎兔许旺细胞；第14天植块周围细胞长势最好。③有两种细胞，一种为细胞形态梭形，有突起，多为双极，偶尔可见3个细长突起，胞核呈椭圆形，胞体周围有光晕，即生长晕，为许旺细胞。偶尔可见另一种细胞，胞体大，呈扁平状，外形不规则，突起短而多，细胞核较浅，核仁明显，有2-3个核仁，为成纤维细胞。④根据许旺细胞特有的特征性形态以及细胞免疫组化染色可证实为许旺细胞。⑤实验组许旺细胞的分裂增殖速度明显比对照组加快[传代培养后第3天：（1．41&;#177;0．12），（1．05&;#177;0．10）；第4天：（1．85&;#177;0．26），（1．21&;#177;0．22）；第5天：（2．36&;#177;0．43），（1．23&;#177;0．32）；第6天：（3．52&;#177;0．11），（1．94&;#177;0．33）；第7天：（6．25&;#177;0．38），（3．14&;#177;0．27）。P〈0．0011。结论：用神经生长因子可促进胎兔许旺细胞生长分裂，能够获得大量的胎兔许旺细胞，满足组织工程对许旺细胞的需求；此外胎兔许旺细胞作为组织工程的种子细胞也可以减轻免疫排斥反应的发生。     

神经营养因子3纳米微球载体基因工程转染许旺细胞

背景：纳米微球基因转染技术携带或增强种植细胞可持续稳定延长其释放,保持其活性和作用时间。目的：观察纳米微球载体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞对坐骨神经缺损的促进和修复作用。方法：采用纳米微球载体将神经营养因子3基因转染入体外培养的新生Wistar大鼠许旺细胞。取Wistar成年大鼠80只制作坐骨神经缺损模型,将4种不同的移植物注入细胞外基质凝胶一聚乳酸聚羟基乙酸共聚物管桥接管内：空白对照组未注入其他任何物质,细胞组注入许旺细胞,基因组注入神经营养因子3基因,实验组注入神经营养因子3基因修饰的许旺细胞。结果与结论：术后坐骨神经及肌纤维横截面积染色比较,实验组优于细胞组、基因组（P〈0．01）,细胞组、基因组均优于空白对照组（P〈0．01）,细胞组、基因组组间比较差异无显著性意义（P〉0．05）。表明神经营养因子3基因转染许旺细胞移植,可相互促进,再造神经再生的微环境,促进并修复缺损坐骨神经缺损。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的：观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法：实验于2005-07／12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠，体质量（250&;#177;20）g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组，对照组6只，仅进行至椎板切除，即行切口关闭，不损伤脊髓。损伤组18只，3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，T10处椎板切开后，在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫，刺激无反应后，关闭切口。分别于伤后3，7，21d不同时间点取材，每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片，运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果：①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆，神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3，7，21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[（15．48&;#177;3．20）。（12．59&;#177;2．03），（11．33&;#177;1．92），（7．31&;#177;1．54）；（16．73&;#177;3．30），（11．15&;#177;2．85）。（13．20&;#177;3．39）。（6．00&;#177;1．50），（P〈0．01）1，术后3d时达高峰，随伤后时间的延长进行性减少。⑧损伤后3，7，21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[（10．63&;#177;2．90），（14．07&;#177;2．37），（9．35&;#177;3．50），（4．00&;#177;0．63）。（P〈0．01）]，术后7d时达高峰，3d与21d比较差异无显著性意义。结论：脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加，提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

三种脾虚泄泻证模型大鼠消化系统功能改变的比较

目的：运用番泻叶法、乙酸法和番泻叶加乙酸法分别制作三种大鼠中医脾虚泄泻证模型，比较所受损伤对消化及免疫系统功能等的影响，以期从中选择出与中医临床脾虚泄泻证较为吻合的动物模型来评价相关的治疗药物。 方法：实验于2005-08在解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室完成。健康SD大鼠48只，随机分为对照组、番泻叶组、乙酸组和番泻叶加乙酸组，每组12只。番泻叶组灌服20％番泻叶浸剂4g／（kg&;#183;d），连续7d；乙酸组在实验第5天起禁食不禁水32h.由肛门（深入8cm）注入8％的乙酸0．5mL，捏紧大鼠肛门，倒提20s。番泻叶加乙酸组同番泻叶组灌服番泻叶浸剂7d；并在实验第5天注入8％的乙酸，余同乙酸组。对照组灌服、注入均为生理盐水，操作同番泻叶加乙酸组。观察各组大鼠一般症状，测定稀便率、体质量、脾脏指数、胸腺指数、血清D-木糖含量、血清淀粉酶活性、血清琥珀酸脱氢酶比活性等指标。 结果：实验大鼠48只均进入结果分析。①三种大鼠脾虚泄泻证模型均出现腹泻、体质量下降、畏寒、倦怠等类似临床脾虚泄泻证一般症状的表现。②各组大鼠造模后体质量：对照组大鼠造模后体质量与造模前比较有显著增长；三个模型组造模后明显低于对照组[对照组（202.99&;#177;13．15）g，番泻叶组（143．84&;#177;5．66）g，乙酸组（157．07&;#177;11．83）g，番泻叶加乙酸组（127.64&;#177;14．32）g，P＜0．01]。③各组大鼠胸腺质量、胸腺指数、脾质量、脾脏指数变化：各模型组胸腺质量和胸腺指数变化与对照组比较均有显著差异，脾质量和脾脏指数变化与对照组相比，只有番泻叶加乙酸组两者差异都有显著性[胸腺指数：对照组（0．0021&;#177;0．0005）、番泻叶组（0．0010&;#177;0．0002）、乙酸组（0．0013&;#177;0．0006）和番泻叶加乙酸组（0．0006&;#177;0．0003）；脾脏指数：番泻叶加乙酸组（0．0013&;#177;0．0007），P＜0．011。④各组大鼠肠道病理：肉眼观察和病理切片均可见三种脾虚泄泻证模型大鼠肠道损伤，其中番泻叶加乙酸组最明显。⑤各组大鼠血清指标：各模型组血清D-木糖含量、淀粉酶活性、琥珀酸脱氢酶比活性均比对照组低[对照组、番泻叶组、乙酸组、番泻叶加乙酸组D-木糖含量分别为（04078&;#177;0．0632），（0．1993&;#177;0．0608），（0．2232&;#177;0．0338），（0.1947&;#177;0．0454）mmol／L；淀粉酶活性分别为（21．48&;#177;3．65），（16．74&;#177;3．06），（18．63&;#177;2．42），（14．00&;#177;1．47）μkat／L；琥珀酸脱氢酶比活性分别为（466．93&;#177;90．18），（221．38&;#177;42．51），（290．56&;#177;67．18），（215．54&;#177;69．51）μkat／L，P＜0．01或，P＜0．05] 结论：与对照组比较，番泻叶加乙酸组所有指标变化最明显，并与临床上脾虚泄泻证的证候及客观指标变化吻合，可用这种复合造模模型来评价相关治疗药物。