微囊化转心房肽基因细胞分泌心房肽近日节律的体外研究

目的 研究人心房肽 (hANP) cDNA转染细胞的微囊化技术中心房肽分泌的近日节律;通过人工调控,改变心房肽分泌的近日节律 ,达到有效治疗高血压或心力衰竭的目的. 方法 将人心房肽基因( cDNA)转染入中国仓鼠卵巢细胞( Chinese hamster ovary,CHO),然后将细胞包被在聚己内酯管内形成微囊,并检测转基因 CHO细胞长时间存活情况和分泌的心房肽.检测微囊化转基因细胞分泌心房肽的生物节律,并用褪黑素进行调整. 结果 在培养期间,长度 20 mm,直径 2 mm的聚己内酯管内转染 CHO细胞在 2 mL培养基中 24 h分泌的心房肽水平可达 210.3 ng/L;心房肽的分泌呈近日节律性变化,日间高,而夜间低;近日节律变化的时相是 415,用褪黑素处理,近日节律的时相移至 755. 结论 心房肽 cDNA转染的 CHO细胞包被在聚己内酯管内并能向管外分泌心房肽,将来可能适于植入人体.此项研究为心房肽治疗高血压或心力衰竭提供了一条新途径.     

人心房肽cDNA转染细胞微囊化及表达ANP的研究

目的探讨人心房肽(hANP)cDNA转染细胞的微囊化技术，测定其ANP的表达水平，以及研究ANP分泌的近日节律；通过人工调控，改变ANP分泌的近日节律，达到有效治疗高血压或心衰的目的。方法将人ANP基因(cDNA)转染入CHO细胞，然后将细胞包被在聚己内酯(PCL)管内形成微囊，并检测转基因CHO细胞长时间存活情况和分泌的ANP。检测微囊化转基因细胞分泌ANP的生物节律，并用褪黑素(melatonin)进行调整。结果在培养期间，长度20mm直径3mm的PCL管内转染CHO细胞在2ml培养基中24小时分泌的ANP水平可达210．3ng／L；ANP的分泌呈近日节律性变化，日间高，而夜间低；近日节律变化的时相是4：15，用melatonin处理，近日节律的时相移至7：55。结论ANP cDNA转染的CHO细胞包被在PCL管内并能向管外分泌ANP．将来可能话于植人人体．此项研奔为心房肽治疗高血压或心衰提供了一条新途径。     

心房压力缓慢增高过程中血管紧张素和心房利钠肽的分泌

心房压力缓慢增高过程中血管紧张素和心房利钠肽的分泌（｜｜ＬｏｈｍｅｉｅｒＴＥ，ｅｔａｌ．ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌ，１９９４；２６６：Ｒ９８９）本文研究的目的在于确定血管紧张素巨（ＡＮＧ’）对缓慢刺激心房引起心房利钠肽（ＡＮＰ）分泌是否具有直接作用，而不是...     

可分泌性胰高血糖素样肽1融合蛋白cDNA克隆的构建

目的：为了探讨体内分泌表达胰高血糖素样肽1（GLP—1）治疗2型糖尿病的可行性，构建可分泌表达胰高血糖素样肽1的cDNA克隆。 方法：实验于2005-09／2006-04在西安华广生物工程公司实验室进行。采用非对称互补引物／膜板法，体外合成两端含有酶切位点的胰高血糖素样肽1的cDNA片段，通过用NaeⅠ和XhoⅠ内切酶消化从NT4 cDNA克隆中获取NT4的信号肽和前导序列，通过T4连接酶连接构建分泌表达胰高血糖素样肽1的cDNA克隆。该克隆的特点是确保信号肽酶识别点的正确性。 结果：测序证实克隆的胰高血糖素样肽1的cDNA与GeneBank提供的序列完全一致；经限制性内切酶物理图谱方法证实已经成功地将胰高血糖素样肽1cDNA重组到含NT4的信号肽和前导序列下游。DNAsis软件分析结果表明该克隆编码具有信号肽酶识别点的NT4-GLP—1融合蛋白。 结论：成功构建了能够分泌表达胰高血糖素样肽1的融合蛋白的cDNA克隆。     

自发性高血压大鼠心房特殊颗粒超微结构的形态计量分析

目的：观察自发性高血压大鼠右心耳肌细胞心房特殊颗粒(ASG)的形态学变化。方法：实验动物分为两组，取每组动物右心耳，运用透射电镜观察ASG的形态并应用形态计量学方法进行定量分析。结果：成年自发性高血压大鼠的心肌细胞内，ASG数目增加，直径增大，高尔基复合体发达；线粒体肿胀，部分嵴溶解断裂，部分内质网扩张，糖原颗粒增多。结论：自发性高血压大鼠心房利钠肽(ANP)的合成和释放均增加。     

绿色荧光蛋白(GFP)融合于人整合蛋白αⅡb C端不影响αⅡbβ3复合物在CHO细胞正常表达

本研究选择αⅡb作为靶蛋白观察绿色荧光蛋白(GFP)标记对αⅡbβ3复合物生物合成过程和表达的影响。从人αⅡb表达载体p3．1—2b中经PCR扩增的αⅡb基因全长cDNA，插入表达载体pEGFP—N1中构建αⅡbGFP融合蛋白表达载体，测序正确后利用脂质体将重组质粒与表达人整合蛋白B，亚基的真核表达质粒p3．1—3a共转染CHO细胞，对转染后细胞用Western blot方法鉴定αⅡbGFP基因在CHO细胞中的表达并用激光共聚焦显微镜确定融合蛋白的细胞内定位，结果表明：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，Western blot证明转基因CHO细胞有人αⅡbGFP基因的表达，融合蛋白细胞内定位研究显示αⅡbGFP可以由内质网转运至高尔基体．．结论：成功构建了人αⅡbGFP融合蛋白真核表达载体；GFP融合于αⅡbC端不影响αⅡbβ3复合物在CHO细胞的正常表达。     

人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的：观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导人正常真皮成纤维细胞后，能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子，为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。 方法：实验于2001—06／2005—06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3．0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3．0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3．0-hVEGF165质粒大量制备（碱裂解法）-质粒纯化-质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EeoRⅠ和xbaⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只，无菌条件下取新生兔皮肤，尽量去除皮下组织，切成宽0．3cm小条块，Ⅰ型胶原酶消化，进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞，经G418筛选，获得阳性转染细胞克隆，并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平；原位杂交显示转基因细胞内VEGF165 mRNA的表达情况；流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况；透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。 结果：①质粒酶切鉴定结果：提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5．4kb和0．57kb两个片段，与原质粒图谱符合，表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3．0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况：共进行15次转染试验，35孔（皿）均有G418抗性集落形成，表明pcDNA3．0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达：pcDNA3．0-hVEGF165转染成纤维细胞后，24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋、白表达，高达（3280&;#177;2054）ng／L，并于48，72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果：转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGF mRNA。G418应用2-4周后，可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆，筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEG FmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测：转染后成纤维细胞S期细胞比例增加，G1和G2期细胞减少，表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高。转染前为1．26％，转染后2d为2．64％，至12代时高达17135％。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察：细胞表面有较多微绒毛，核呈不规则形，胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体，沿膜可见一些膜包被颗粒。 结论：真核表达质粒pcDNA3．0-hVEGF165成功导人家兔皮肤成纤维细胞，在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子，在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

脑钠肽诊断心力衰竭的研究进展

1988年，Sudoh等首先从猪脑中分离出脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP），随后发现人类心、肺、脑、脊髓等组织中广泛分布BNP。血浆中BNP主要由心室肌细胞分泌。当心室充盈压升高、心肌纤维被牵拉时可迅速表达、分泌BNP前体（pro-BNP）。目前发现BNP的主要生理作用有：抑制肾素分泌，提高肾小球滤过率，增加尿量；抑制醛固酮分泌；舒张血管平滑肌，扩张冠状动脉；抑制心肌纤维化等。近来对BNP诊断心力衰竭（heart failure，HF）进行了深入研究。     

转基因技术在组织工程体外软骨组织培养中的应用

目的：研究骨形态发生蛋白一2重组腺病毒(Ad-BMP-2)转基因对骨髓基质细胞(mesenchymal stem cell，MSC)与纤维蛋白凝胶构成的复合物体外培养的影响。方法：Ad-BMP-2转染原代培养的MSC，通过细胞生长曲线、免疫组化、甲苯胺蓝染色透射电镜观察转基因MSC的BMP-2和CollagenⅡ及蛋白多糖表达。结果：转基因MSC经纤维蛋白体外三维培养后免疫组化和甲苯胺蓝染色呈阳性；电镜显示细胞生长良好，有基质合成。结论：Ad-BMP-2能够通过促进MSC分泌BMP-2诱导CollagenⅡ和蛋白多糖的表达，在纤维蛋白三维支架中形成软骨基质。     

运动及降钙素基因相关肽对心血管系统的作用及其相关性研究

目的：系统介绍降钙素基因相关肽与心血管系统、心肌系统、心血管疾病及运动的关系。 资料来源：应用计算机检索Medline1980-01／2004-12关于降钙素基因相关肽相关的文章．检索词：“CGRP、cardiovascular、sports”．限定语言种类为英文；同时检索中国期刊全文数据库1994-01／2004—12关于降钙素基因相关肽的文章，检索词包括：“降钙素基因相关肽、心血管系统、运动”，限定语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，选择与降钙素基因相关肽相关的文章。纳入标准：有关降钙素基因相关肽与心血管分布、代谢、疾病的文章。排除标准：重复性研究。 资料提炼：共收集46篇关于降钙素基因相关肽的文献，排除重复性研究13篇，纳入33篇。其中关于降钙素基因相关肽及其受体在心血管系统的分布与代谢7篇，降钙素基因相关肽的心血管效应10篇，降钙素基因相关肽与心血管疾病的关系9篇，降钙素基因相关肽与运动的关系7篇。 资料综合：降钙素基因相关肽是一种生物活性肽，是调节心血管活动的一类重要的神经递质。几乎存在于所有的血管神经纤维内，降钙素基因相关肽的心血管系统效应包括：心脏的正性变时变力作用，血液动力学作者，舒血管效应，心肌细胞和心血管的保护作用。可参与防治高血压、充血性心力衰竭、心绞痛、心肌梗死，治疗休克。运动可促进降钙素基因相关肽的分泌增加。 结论：降钙素基因相关肽分布于中枢和外周神经系统，也广泛存在于心血管系统，是调节心血管活动的重要肽能神经递质。是体内已知最强的扩血管物质，有强大的舒张冠状动脉作用，并参与高血压及休克形成机制。能增加心肌收缩力，对心肌缺血有保护作用。运动可促进降钙素基因相关肽的分泌。     

骨保护素对破骨细胞分化和骨吸收活性的抑制作用

背景：骨保护素(osteoprotegerin，OPG)可抑制破骨细胞的分化，抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡，在骨质疏松、类风湿性关节炎、癌症骨转移的领域有潜在的应用价值。目的：鉴定在CHO细胞中表达的人骨保护素生物学活性。设计：随机对照的实验研究。地点和对象：实验在解放军第四军医大学西京医院骨科研究所完成，研究对象：人骨肉瘤细胞株MG63、中国仓鼠CHO细胞株、克隆质粒pUC19及真核表达质粒pcDNA3为本室保存，12只6～8周龄BABL／c雄性小鼠由本校动物中心提供。干预：RT-PCR法获得人OPG编码区cDNA并构建真核表达载体，在脂质体介导下转染CHO细胞，经Western blot鉴定筛选稳定表达OPG的细胞系。获取含有OPG蛋白的条件培养基浓缩液，实验组：体外培养的鼠破骨细胞培养基中加人含有OPG蛋白的条件培养基浓缩液。对照组1只加入转染pcDNA3空载体的CHO细胞培养基的浓缩液。对照组2只加入完全培养基。主要观察指标：观察人OPG对破骨细胞的分化和骨吸收的影响。结果：转染人OPG编码区基因的CHO细胞能分泌表达OPG。小鼠骨髓细胞在la，25(OH)zD3(1&;#215;10^-8mol／L)的存在下可稳定分化出具有骨吸收功能的破骨细胞样细胞，在该培养体系中加入含有OPG的CHO细胞培养上清浓缩液，TRAP染色阳性细胞数明显减少(t=5．547，p&;lt;0．01)，骨吸收陷窝的数量显著减少(t=3．409，P&;lt;0．01)。结论：人骨保护素可在CHO细胞中分泌表达，并对体外培养状态下的破骨细胞的分化和骨吸收功能有抑制作用。     

肿瘤的基因治疗前期研究：反转录病毒介导的肿瘤坏死因子α基因抗C6胶质瘤效应☆

目的：探讨反转录病毒介导的肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因对C6胶质瘤的抗瘤效应，从而为肿瘤的基因治疗提供基础研究数据。方法：将重组TNF-α反转录病毒载体PLJ+TNF转染大鼠C6胶质瘤细胞，ELISA法检测该细胞中目的基因的表达，MTT法检测体外增殖能力；将实验大鼠随机分为实验组和对照组，每组10只，实验组大鼠右股内侧接种转基因2&;#215;10^6C6细胞，对照组同法同部位接种未转基因C6细胞，常规饲养5周，每周测量肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线，比较两组皮下肿瘤大小并进行统计学分析。结果：C6胶质瘤细胞与C6细胞的体外增殖能力比较，差异无显著性意义(P&;gt;0．05)；转基因前后TNF-α分泌情况：1&;#215;10^6个C6细胞体外培养24h每毫升上清液分泌TNF-α(2．42&;#177;0．76)U；1&;#215;10^6个C6胶质瘤细胞体外培养24h每毫升上清液分泌TNF-α(1753&;#177;2．31)U，两者比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)；动态TNF-α检测显示：转基因C6细胞能稳定地表达高水平的TNF-α；大鼠皮下接种肿瘤细胞5周后，实验组3只未见肿瘤生长，其余肿瘤直径为(15&;#177;0．3)cm，对照组肿瘤直径为(2．4&;#177;0．2)cm，两组比较，差异有显著性意义(P&;lt;0．01)。结论：TNF-α基因转染大鼠C6胶质瘤细胞后能持续分泌高水平的TNF-α，对大鼠C6胶质瘤皮下肿瘤具有明显的抗瘤效应。     

蜂毒疏水性短肽增强聚乙烯亚胺的基因转染效率

本研究探讨使用蜂毒短肽疏水性尾部增加支链聚乙烯亚胺（BPEI）在HeLa细胞中的转染效率的可能性。合成蜂毒多肽melittin的疏水性尾部，使用红细胞溶血实验检测其穿透细胞膜的能力。将该片段与阳离子聚合物BPEI按一定比例混合，以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，检测其在HeLa细胞的转染效率；以M1Tr法检测基因转染后的细胞毒性。结果表明：在中性和酸性条件下，melittin的疏水性尾部均可穿透细胞膜导致红细胞溶血并显著增加BPEI在HeLa细胞系的基因转染效率，使用本方法转染后细胞毒性较单独使用PEI时为低。结论：melittin疏水性尾部是一种良好的增强剂，有可能在难以转染的细胞系的基因转染实验中起重要作用。     

降血压肽对人脐静脉内皮细胞增殖及内皮素表达的影响

背景：降血压肽是一类能够降低人体血压的多肽，可通过抑制人体血管紧张素Ⅱ的生成而达到降低血压的作用。目的：在细胞分子水平探讨降血压肽对人脐静脉内皮细胞生长及内皮素表达的影响，为进一步将降血压肽开发为降压保健食品提供实验依据。设计：重复测量设计。单位：华南理工大学生命科学与工程学院，深圳职业技术学院应用生物技术系。材料：实验于2004-09／2005-03在深圳职业技术学院应用生物技术研究所完成。降血压肽由深圳职业技术学院应用生物技术研究所制备，在一定条件下抑制血管紧张素转移酶活性一半时所需要的抑制剂浓度为15μmol／L。传至4代的人脐静脉内皮细胞用于实验，随机分为7组：空白对照组、降血压肽150mg／L组、降血压肽300mg／L组、降血压肽600mg/L组、卡托普利阳性对照组、去甲肾上腺素阴性对照组、降血压肽＋去甲肾上腺素组。方法：①脐静脉内皮细胞按一般细胞培养方法进行，培养液为M199＋体积分数为0．15的小牛血清＋青霉素10000U／mL＋链霉素100mg／L。细胞长满致融合状态后，按1：2比例传代，传至第4代的细胞用于实验。②空白对照组含体积分数为0．15小牛血清的M199；降血压肽150，300，600ms／L组在此基础上加入降血压肽至终浓度分别为150，300，600mg／L；卡托普利阳性对照组在此基础上加入卡托普利至终浓度为10^-5mol／L；去甲肾上腺素阴性对照组在此基础上加入去甲肾上腺素终浓度为100μg／L；降血压肽＋去甲肾上腺素组在此基础上加入降血压肽至终浓度300mg／L，去甲肾上腺素至终浓度100μg／L。（3）采用细胞计数法测定各组细胞生长状况，放免法测定不同培养时间各组细胞培养液中内皮素含量，反转录聚合酶链式反应法测定内皮素mRNA的表达，免疫组化测定细胞内皮素蛋白的表达。’主要观察指标：①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素的影响。②降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响。结果：①降血压肽对内皮细胞增殖、分泌内皮素影响：随着培养时间的延长，与空白对照组比较，卡托普利阳性对照组及降血压肽各剂量组均有抑制内皮细胞生长、降低培养液中内皮素含量的作用（P〈0．01或0．05）；去甲肾上腺素可促进内皮细胞的生长和分泌内皮素，但加入降血压肽后细胞密度和内皮素含量均接近空白对照组（P〉0．05）。（函降血压肽对内皮细胞内皮素mRNA、内皮素蛋白表达的影响：与空白对照组比较，阳性对照卡托普利组及降血压肽各剂量组均可下调内皮素mBNA和内皮素蛋白的表达（P〈0.01或0．05）；去甲肾上腺素可上调内皮素mRNA和内皮素蛋白的表达，加入降血压肽后各基因表达接近空白对照组俨〉0．05）。结论：不同剂量的降血压肽对内皮细胞均有抑制生长作用，可降低细胞释放内皮素的含量，下调内皮素基因的表达，且能够有效对抗去甲肾上腺素的促脐静脉内皮细胞生长及分泌作用。     

GDNF基因体内转染对大鼠面神经损伤后的修复作用

目的：探讨胶质细胞源神经营养因子（GDNF）基因体内转染对大鼠面神经损伤后的修复作用，为基因治疗周围神经损伤提供依据。方法：用脂质体介导pEGFP—GDNF cDNA基因转染受损面神经所支配的面肌，计算损伤侧面神经元的存活率。观察动物触须节律性拂动的恢复情况，检测修复神经的传导速度。结果：面神经损伤后第7d、14d、21d和28d时间段，对照组面神经运动神经元的存活率分别为93．06％、76．06％、72.38％和70．69％，转染组分别为94．00％、84．00％、79．25％和78．06％。转染组第10．4±1．3d鼠触须开始拂动，18．5±1．3d节律性拂动基本恢复正常；对照组13．5±1．2d触须开始拂动，27．3±1．0d节律性拂动基本恢复正常。转染组神经干传导速度恢复率快于对照组。结论：面神经损伤后经脂质体介导GDNF基因体内转染靶器官后，对受损面神经的修复有促进作用。     

关节软骨缺损修复的基因治疗实验 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染软骨细胞及其在软骨细胞中的表达

目的：探讨胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人软骨细胞的可能性及其在软骨细胞中的表达，并初步判断转基因细胞的生物学功能变化。方法：实验于2002-07／2003-06在中山大学附属第二医院医学研究中心完成。①构建pcDNA3.1-胰岛素样生长因子Ⅰ／GS质粒。将构建质粒在大肠杆菌DH10B中大量扩增后，抽提纯化质粒，并对质粒进行测序鉴定。②将鉴定的质粒用阳离子脂质体转染人关节软骨细胞，通过逆转录-聚合酶链反应、Westren-blot等方法检测胰岛素样生长因子Ⅰ基因在人关节软骨细胞中的表达。③分别将同代软骨细胞与转基因细胞的培养液、软骨细胞与转基因细胞裂解液和二甲基亚甲蓝共孵育后，检测各混合液的吸光度，以此判断同代软骨细胞、转基因细胞、软骨细胞培养液、转基因细胞培养液中的蛋白多糖含量。结果：①质粒鉴定结果：质粒抽提纯化后电泳可见3条DNA条带，符合质粒的电泳图谱；质粒的测序结果和胰岛素样生长因子Ⅰ基因序列完全吻合。②胰岛素样生长因子Ⅰ基因在软骨细胞中的表达：质粒转染软骨细胞后，反转录-聚合酶链反应能见到298bp的胰岛素样生长因子ⅠmRNA片断的表达；Western-blot可见7．6ku的胰岛素样生长因子Ⅰ蛋白表达条带。③转胰岛素样生长因子Ⅰ基因对软骨细胞分泌蛋白多糖的影响：转基因软骨细胞裂解液和同代的软骨细胞裂解液的蛋白多糖含量分别是（5．23&;#177;0．62）mg／L和（2．47&;#177;0．31）mg／L．两组比较，差异有显著性意义（t=2．88，P〈0．05）；转基因软骨细胞培养液和同代非转染软骨细胞培养液中的蛋白多糖含量分别为（9．92&;#177;1．04）mg／L和（4．56&;#177;0．51）mg／L，两组比较，差异有显著性意义（t=6．47，P〈0．05）。结论：胰岛素样生长因子Ⅰ基因转染人关节软骨细胞后能在软骨细胞中表达，并能促进软骨细胞分泌软骨基质蛋白多糖，具有促DNA合成和维持软骨细胞表型稳定的能力。转胰岛素样生长因子Ⅰ基因软骨细胞的研究为体外软骨组织工程和关节软骨病的基因治疗提供了直接的实验依据。     

增生性瘢痕血管形成抑制作用中色素上皮衍生因子的分子克隆与真核表达

目的：克隆人色素上皮衍生因子(Pigment Epitheium-Derived Factor，PEDF)全长cDNA，建立稳定表达人PEDF分子的哺乳动物细胞系。方法：RT-PCR获取人PEDF cDNA，序列测定后克隆人真核表达载体pCDNA3．0中，用脂质体转染入HepG2细胞，G418筛选出稳定表达细胞系，用RT-PCR与Westem blot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果：RT-PCR扩增得到预期大小的目的条带，序列分析表明成熟肽编码区与发表序列完全一致；克隆人pCDNA3．0中得到PEDF真核表达载体，G418筛选3周后得到稳定表达细胞系，RT-PCR与Westem blot显示PEDF在HepG2细胞中有高水平表达。结论：人PEDF全长cDNA成功克隆，并在哺乳动物细胞系HepG2中获得稳定表达，为进一步研究PEDF分子对增生性瘢痕血管形成的作用奠定了理论基础。     

八肽胆囊收缩素对游离脂肪酸损伤的胰岛β细胞的保护作用

目的：观察八肽胆囊收缩素对高浓度游离脂肪酸损伤的小鼠胰岛β细胞（NIT—1细胞）的保护作用，并观察同时应用胆囊收缩素受体非特异性拮抗剂丙谷胺对此作用的影响。 方法：实验于2004-03／12在河北省人民医院中心实验室进行。将体外培养良好的NIT—1细胞分为对照组、游离脂肪酸组（加入0．25mmol／L软脂酸）、八肽胆囊收缩素组（加入游离脂肪酸同时加入10pmol／L八肽胆囊收缩素）、丙谷胺组（八肽胆囊收缩素组同时加丙谷胺，终浓度32mg／L）。37℃、体积分数为0．05的CO2条件下分别培养48h和72h，放免法测定培养液上清中胰岛素水平；MTT法检测NIT—1细胞增殖情况；流式细胞术方法测定细胞凋亡率；免疫组化法观察bcl-2的表达。 结果：①培养上清中胰岛素水平：游离脂肪酸组48h和72h明显少于对照组（P〈0．01）；八肽胆囊收缩素组显著高于游离脂肪酸处理组（P〈0．01）；丙谷胺组与游离脂肪酸组无显著差异。②细胞增殖反应：游离脂肪酸组48h和72h明显低于对照组（P〈0．01）．八肽胆囊收缩素组则显著高于游离脂肪酸组（P〈0．01），丙谷胺组与游离脂肪酸组结果相仿。③细胞凋亡率：游离脂肪酸组48h和72h明显高于对照组（P〈0．01），八肽胆囊收缩素组则显著低于游离脂肪酸组（P〈0．01），丙谷胺组与游离脂肪酸组结果相仿。④bcl-2阳性表达水平：游离脂肪酸处理不同时间后其表达明显减少；八肽胆囊收缩素处理后表达增加，丙谷胺组较八肽胆囊收缩素组表达略少。 结论：①游离脂肪酸可导致胰岛β细胞明显损伤，表现在胰岛素分泌的减少、细胞增殖能力的降低、细胞凋亡率增加以及bcl-2基因表达减少。②八肽胆囊收缩素对游离脂肪酸损伤的胰岛β细胞具有明显的保护作用。③非特异性胆囊收缩素受体拮抗剂可以在一定程度上逆转八肽胆囊收缩素的保护作用；提示其保护作用可能是通过与胆囊收缩素受体结合实现的。     

房颤患者脑钠肽和基质金属蛋白酶2的变化及意义

目的：探讨心房颤动（房颤）患者血脑利钠肽（BNP）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）的变化及其意义。方法：房颤组：52例持续性心房颤动患者。窦律组：22例窦性心律患者。用酶联免疫吸附法（ELISA）测定房颤组和窦律组血浆BNP水平，同时测定血清MMP-2、并应用彩色多普勒超声心动图测量两组患者左心房内径的大小。结果：结论房颤组患者的血BNP，水MMP-2水平高于窦律组且随心功能恶化而升高；房颤组患者房颤组患者的左房内径较窦律组明显增大，房颤患者血清MMP-2水罩与左房内径成正直线相关关系，房颤组各病因RHD亚组、CHD亚组、DCM亚组和高血压亚组血浆BNP，MMP-2水平无差别房颤组血清MMP-2与血浆BNP水平呈正直线相关关系结论：研究提示血清MMP-2水平的升高，可能是导致持续性房颤患者左房内径扩大的原因之一。MMP-2与BNP呈正直线相关关系，提示在持续性房颤患者中BNP可能通过影响心房组织成纤维细胞MMP-2的分泌而在心房间质纤维化中起调控作用。     

肾小管上皮细胞来源包含miroRNA-21的微囊泡在心肌肥大中的作用

目的 探讨肾小管上皮细胞来源包含miroRNA 21（miR 21）的微囊泡(microvesicles, MVs)在心肌肥大中的作用及机制。方法 用转化生长因子 (transforming growth factor，TGF) β1刺激肾小管上皮细胞，采用差速离心的方法提取条件培养液中的MVs，Dil C18染料标记肾小管上皮细胞并用荧光显微镜观察受体心肌细胞，实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）检测miR 21含量，目镜测微尺测量心肌细胞长径，二喹啉甲酸（BCA）蛋白试剂盒及人心钠肽（ANP）试剂盒检测细胞蛋白含量及ANP水平。预先用miR 21 inhibitor转染受体心肌细胞，观察对细胞长径、蛋白含量及ANP水平的影响。结果 TGF β1可诱导供体肾小管上皮细胞产生MVs并进入受体心肌细胞，使心肌细胞长径、蛋白含量、ANP水平明显增加。TGF β1诱导供体肾小管上皮细胞产生的MVs中含有miR 21，并可诱导受体心肌细胞肥大，预转染miR 21抑制剂可抑制MVs诱导的细胞肥大效应。结论 肾小管上皮细胞损伤时分泌包含miR 21的MVs可诱导心肌细胞的肥大，其可能参与了慢性肾脏病并发心力衰竭的进展。