人血管内皮细胞生长因子基因体外转染皮肤成纤维细胞后的表达效应

目的:观察外源性人血管内皮细胞生长因子基因导入正常真皮成纤维细胞后,能否表达及分泌血管内皮细胞生长因子,为进一步构建转VEGF165基因组织工程皮肤在创伤修复中的应用提供新移植物。方法:实验于2001-06/2005-06在长春吉林大学完成。①真核表达载体pcDNA3.0-hVEGF165的扩增、纯化和鉴定过程为大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备→pcDNA3.0-hVEGF165质粒DNA细菌转化→pcDNA3.0-hVEGF165质粒大量制备(碱裂解法)→质粒纯化→质粒含量纯度测定。提取的质粒载体用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定。②选取清洁级新生日本大耳白兔2只,无菌条件下取新生兔皮肤,尽量去除皮下组织,切成宽0.3cm小条块,Ⅰ型胶原酶消化,进行真皮成纤维细胞的分离与培养。脂质体介导真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165转染体外培养的兔皮肤成纤维细胞,经G418筛选,获得阳性转染细胞克隆,并进行传代扩增。③酶联免疫吸附法检测转染后不同时间段的血管内皮细胞生长因子蛋白表达水平;原位杂交显示转基因细胞内VEGF165mRNA的表达情况;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡情况;透射电子显微镜观察转染后真皮成纤维细胞的超微结构。结果:①质粒酶切鉴定结果:提取的质粒经双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定后可得到5.4kb和0.57kb两个片段,与原质粒图谱符合,表明所提取的质粒为重组质粒pcDNA3.0-VEGF165。②pcDNA3-hVEGF165基因转染真皮成纤维细胞情况:共进行15次转染试验,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165经脂质体介导可有效转染正常皮肤成纤维细胞。③血管内皮细胞生长因子蛋白的表达:pcDNA3.0-hVEGF165转染成纤维细胞后,24h即有较高水平的血管内皮细胞生长因子蛋白表达,高达(3280±2054)ng/L,并于48,72h呈下降趋势。④血管内皮细胞生长因子cDNA原位杂交检测结果:转染后成纤维细胞可见散在的阳性细胞表达hVEGFmRNA。G418应用2～4周后,可成功筛选出转基因成纤维细胞克隆,筛选后可见大量阳性的转染细胞表达hVEGFmRNA。⑤成纤维细胞的细胞周期分布及凋亡检测:转染后成纤维细胞S期细胞比例增加,G1和G2期细胞减少,表明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。但细胞凋亡率逐渐升高,转染前为1.26%,转染后2d为2.64%,至12代时高达17.35%。⑥转染后成纤维细胞超微结构观察:细胞表面有较多微绒毛,核呈不规则形,胞质内可见较多的粗面内质网、线粒体,沿膜可见一些膜包被颗粒。结论:真核表达质粒pcDNA3.0-hVEGF165成功导入家兔皮肤成纤维细胞,在短时期内可高水平地表达分泌血管内皮细胞生长因子,在治疗缺血性疾病和促进创伤修复及以其作为种子细胞构建转基因组织工程皮肤治疗皮肤缺损等方面显示出较好的应用前景。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的：用基因工程方法改造成纤维细胞，使其分泌血管内皮细胞生长因子，观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。 方法：实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后，将培养14d细胞融合约80％的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染，细胞随机分为3组，每组10孔，分别为PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组．空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染的敏感性。 结果：①PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示：小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物，对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果：小鼠NIH3T3细胞转染14d后，PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346&;#177;23，0，0ng／L（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测结果：PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性（依次为0．96&;#177;0.11，0．91&;#177;0．10，0．98&;#177;0．16，P〉0．05）。PcDNA3．1（-）／VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。 结论：小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞，用于基因治疗。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

血管内皮细胞生长因子基因体外转染小鼠NIH3T3细胞的生物活性

目的:用基因工程方法改造成纤维细胞,使其分泌血管内皮细胞生长因子,观察成纤维细胞作为基因转染的靶细胞的可行性。方法:实验于2005-11在解放军第四军医大学西京医院全军整形外科研究所完成。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的扩增、提取、纯化和鉴定后,将培养14d细胞融合约80%的小鼠NIH3T3细胞在24孔板中进行转染,细胞随机分为3组,每组10孔,分别为PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组。采用免疫组织化学化学检测血管内皮细胞生长因子表达。ELISA方法检测血管内皮细胞生长因子外分泌。四甲基偶氮唑盐法检测小鼠NIH3T3细胞对PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染的敏感性。结果:①PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒的基因测序结果显示序列正确。②免疫组织化学染色显示:小鼠NIH3T3细胞转染4d后胞浆内可观察到阳性表达产物,对照组呈阴性结果。③ELISA检测结果:小鼠NIH3T3细胞转染14d后,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组3组培养上清中血管内皮细胞生长因子浓度分别346±23,0,0ng/L(P<0.05)。④四甲基偶氮唑盐法检测结果:PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组、空质粒转染组和不转染质粒组所测的490nm的A值比较差异均无显著性(依次为0.96±0.11,0.91±0.10,0.98±0.16,P>0.05)。PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染对小鼠NIH3T3细胞增殖无影响。结论:小鼠NIH3T3细胞可作为血管内皮细胞生长因子基因转染的靶细胞,用于基因治疗。     

人瘢痕疙瘩成纤维细胞中P53蛋白对血管内皮细胞生长因子表达的影响

目的：观察人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的P53蛋白对血管内皮细胞生长因子表达的影响作用。 方法：实验于2005-05／11在哈尔滨医科大学第二临床医学院实验室完成。成纤维细胞来源哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容激光中心收治的烧伤患者的瘢痕疙瘩组织（临床病理证实）。将瘢痕疙瘩切成1mm&;#215;1mm组织块，用含体积分数为0．2的胎牛血清的1640培养液，置于37℃，体积分数为0．05的CO2条件下培养，取3-6代细胞。采用腺病毒介导法将野生型p53基因转染至人瘢痕疙瘩成纤维细胞中，非转染细胞为对照组。应用间接免疫荧光法和western blott法检测P53蛋白；应用酶联免疫吸附法检测血管内皮细胞生长因子表达。 结果：①间接免疫荧光法检测P53蛋白：P53蛋白表达在细胞核内，转染组和非转染组细胞中均有P53蛋白表达，转染组细胞内P53蛋白表达明显高于非转染组细胞。②Westem blot法检测P53蛋白：转染组和非转染组细胞中均有P53蛋白表达，但非转染组细胞内P53蛋白表达量很少；转染组细胞在转染48h后，细胞中P53蛋白表达量高；明显高于非转染组细胞。③酶联免疫吸附法测定血管内皮细胞生长因子：转染组和非转染组细胞中均检测出血管内皮细胞生长因子表达，但转染组细胞血管内皮细胞生长因子表达显著低于非转染组细胞（P〈0．01）。 结论：P53蛋白能够明显抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞血管内皮细胞生长因子表达。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞绿色荧光蛋白的表达

背景：血管内皮生长因子是一种有效的血管形成和通透性诱导因子,其中在体内以血管内皮生长因子165和血管内皮生长因子121表达为主,具有强烈的促血管新生作用。目的：观察以血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞,继而分化为血管内皮细胞的可行性。方法：分离提取50gSD大鼠骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪鉴定,将携有血管内皮生长因子165基因的质粒pGLV．EFla,采用慢病毒转染骨髓间充质干细胞,转染后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果与结论：转染后12h可见细胞内有绿色荧光蛋白表达,48h后表达增多,72h后达到高峰,其后部分细胞荧光开始减退。结果证明血管内皮生长因子165基因转染骨髓间充质干细胞后,骨髓间充质干细胞内有绿色荧光蛋白表达,提示细胞转染成功,骨髓间充质干细胞定向分化为血管内皮细胞具有可行性。     

体外培养条件下人骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因的转染与鉴定

背景:骨髓间充质千细胞的定向分化需要合适生长因子的调控,利用细胞因子基因转染促进其生长,定向分化和加速骨缺损修复是近年来研究热点.目的:探讨在体外培养条件下转染碱性成纤维细胞生长因子基因对人骨髓间充质干细胞生物学特性的影响.方法:将含人pcDNA3.1-bFGF真核表达载体DH-5α菌扩增,用EndoFree质粒抽提纯化试剂盒抽提质粒,并对所提取的pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒进行酶切鉴定和测序.利用脂质体将pcDNA3.1-bFGF质粒转染到生长良好的P3代骨髓间充质干细胞,G418筛选获得抗性克隆.采用荧光定量PCR、免疫组化、免疫荧光、Westem-blot检测转染后骨髓间充质干细胞碱性成纤维细胞生长因子基因及其产物的表达,流式细胞仪检测细胞增殖周期.结果与结论:脂质体介导pcDNA3.1-bFGF重组表达质粒转染骨髓间充质干细胞后,转染细胞确实表达碱性成纤维细胞生长因子,且表达部位丰要位干胞浆.转染细胞增殖活力加强,处于增殖周期的细胞比例更高(P<0.05).提示采用脂质体转染法能将pcDNA3.1-bFGF成功导入体外培养的骨髓间充质干细胞,碱性成纤维细胞生长因子基因转染后可改善骨髓间充质干细胞的生存状态,促进其增殖.     

再生丝素膜对Ad-VEGF165转基因成纤维细胞基因表达的影响

背景：前期实验已证实再生丝素膜可促进pcDNA3．0-VEGF165转染的L929细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）。目的：进一步观察再生丝素膜对经腺病毒介导的人VEGF（Ad—VEGF165）转基因成纤维细胞基因转录表达的影响。设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007-11／2008—04在苏州大学细胞与分子生物实验室完成。材料：再生丝素膜由苏州大学材料工程学院李明忠教授提供。方法：将Ad—VEGF165腺病毒感染培养在再生丝素膜、聚氯乙烯膜及聚乙烯膜上的QBI-293A人胚肾和WI-38人胚肺成纤维细胞，以空载体Ad-GFP腺病毒和未接种病毒的PBS组为对照。主要观察指标：通过实时定量RT-PCR法检测不同材料对成纤维细胞VEGF mRNA转录的影响；ELISA法检测其对VEGF、血管生成素1、碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子表达的影响。结果：再生丝素膜组成纤维细胞VEGF mRNA呈高水平表达，但聚氯乙烯膜组转录水平明显下降（P〈0．05）。再生丝素膜组Ad—VEGF165转基因293A细胞及WI-38细胞不仅目的基因VEGF细胞因子的分泌呈高水平表达，并可促使血管生成素1基因表达水平明显提高（P〈0．05），而且再生丝素膜还可使成纤维细胞自身分泌的碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子呈现正常表达水平。结论：再生丝素膜不仅利于VEGF目的基因在成纤维细胞中呈现高效表达，并促进血管生成素1基因的表达，而且能维持成纤维细胞自身分泌的与组织损伤修复相关基因碱性成纤维细胞生长因子、血小板衍化生长因子的正常表达。