内源性胰岛素替代疗法中葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体的构建

背景：由于胰岛细胞分离技术难度较大，目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的：构建葡萄糖激酶(Glucokinase，GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系，为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础，可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计：非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预：本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZl)经EcoR1／BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN，构建逆转录病毒表达载体PLX-GK，用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317，筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系，PCR鉴定。主要观察指标：①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果：成功构建GK基因逆转录病毒表达载体，经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变；产毒细胞系的平均病毒滴度为6．8&;#215;10^8CFU／L，筛选出一株病毒滴度为I．8&;#215;10^9CFU／L稳定产毒细胞系PA317／GK，PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论：成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。     

携带同源盒基因HOXA9的逆转录病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带同源盒基因(homeobox gene)HOXA9的逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。方法 PCR扩增HOXA9基因编码区全长序列克隆至逆转录病毒载体MSCVneo,经酶切、测序鉴定。将重组载体脂质体转染包装细胞系PT67,以G418筛选稳定产毒细胞株。收集病毒悬液并测定病毒滴度。结果重组逆转录病毒载体MSCVneo经酶切、测序鉴定正确。将筛选所得的高效产毒细胞株命名为PT67/MSCVneo-HOXA9,测定病毒滴度为5×105CFU/ml。结论成功构建了携带HOXA9基因的逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、准确产生逆转录病毒的细胞株。     

EB病毒LMP2A和EB病毒BZLF1融合基因反转录病毒表达载体的构建

目的:将LMP2A和BZLF1基因进行融合同时可发挥LMP2A诱导特异性CTL和BZLF1基因诱导潜伏期EBV进入裂解期复制的作用,协同杀伤EBV阳性肿瘤细胞。实验拟构建含EB病毒潜伏膜蛋白2A编码基因和即刻早期基因融合基因的反转录病毒表达载体,并筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:实验于2006-08/2007-08在济宁医学院微生物教研室和青岛大学医学院微生物教研室进行。应用反转录-聚合酶链反应分别获得潜伏膜蛋白2A和即刻早期基因编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸技术将两段基因通过多肽接头(Gly_4Ser)_3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro,形成重组质粒pMSCVpuro-Z2A,脂质体法将pMSCVpuro-Z2A转染反转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒进行滴度测定,RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实Z2A正确插入逆转录病毒表达载体,筛选获得了稳定产毒的嘌呤霉素抗性细胞克隆,收获病毒的滴度为7.8×10~6 CFU/L,且重组逆转录病毒在PT67细胞能有效转录。结论:携带Z2A基因的重组反转录病毒表达载体pMSCVpuro-Z2A构建成功,转染PT67细胞后包装出重组反转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Z2A的产毒细胞系PT67-Z2A。     

重组逆转录病毒pLNCX2-TH的构建及鉴定

目的：构建并鉴定重组逆转录病毒载体pLNCX2-TH,建立稳定的PT67产病毒细胞系,并观察其对NIH3T3细胞的感染效率,为基因调控干细胞分化治疗帕金森病奠定基础。方法：采用基因工程技术,将酪氨酸羟化酶（TH）基因片段克隆至逆转录病毒载体pLNCX2-MCS上,鉴定后用脂质体法转染PT67细胞进行病毒包装、扩增,最后通过感染NIH3T3细胞,测定病毒滴度。结果：酶切、测序结果与TH基因重组逆转录病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1.6×106pfu/mL,对NIH3T3细胞有较高的感染效率。结论：应用基因工程技术可成功构建重组逆转录病毒pLNCX2-TH,建立PT67产病毒细胞系,为帕金森病的基因治疗创造了条件。     

同源盒基因HoxA10的重组逆转录病毒载体及稳定包装细胞株的建立和鉴定

本研究构建携带同源盒基因hoxA10的重组逆转录病毒载体,并建立稳定产毒的包装细胞株。通过PCR扩增获得hoxA10基因编码区全长序列,克隆至逆转录病毒载体MSCVneo,并测序鉴定插入的hoxA10基因。将重组载体及空载体经脂质体分别转染包装细胞系PT67,以G418筛选稳定产毒细胞株。收集病毒悬液并测定病毒滴度。结果表明：重组逆转录病毒载体MSCVneo插入的hoxA10基因序列正确。将筛选所得的高效产毒细胞株命名为PT67／MscVneo、PT67／MSCVneo—hoxA10。测定病毒滴度分别为5×10^5CFU／ml、4×10^4CFU／ml。结论：成功构建了同源盒基因hoxA10的重组逆转录病毒载体,建立了稳定、高效、准确产生逆转录病毒的细胞株,为探讨hoxA10基因在造血干细胞的增殖和分化功能提供了实验基础。     

HA1重组慢病毒载体的构建与鉴定

本研究旨在构建ha1基因慢病毒载体并获得稳定的产毒细胞,为进一步研究异基因造血干细胞移植后ha1介导的GVHD和GVL的分离机制奠定基础。将已构建好的T-ha1质粒酶切获得目的基因后,将目的基因定向克隆入慢病毒表达质粒pRRLSIN、cPPT、PGK/GFP、WPRE,构建含有ha1基因的重组慢病毒载体,经PCR、酶切及测序鉴定其正确性,并将成功构建的pLenti-ha1质粒与包装质粒一起共转染293T细胞,通过实时定量PCR测定病毒滴度。结果表明：含有ha1基因的重组慢病毒载体经PCR、酶切和测序鉴定构建正确,且测定的病毒滴度为2.0×108TU/ml。结论：本研究成功地构建了ha1的慢病毒载体。     

HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5的构建与鉴定

目的构建HPV16型E5基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据HPV16型E5基因已知序列,用PCR方法扩增E5片段,利用逆转录病毒载体pLEGFP-N1构建重组质粒pLEGFP-E5。酶切电泳验证重组质粒pLEGFP-E5后,利用脂质体将重组质粒pLEGFP-E5转染入包装细胞PA317。收集PA317病毒上清转染NIH3T3细胞。结果 PCR结果显示扩增片断大小约252bp,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约7300bp。pLEGFP-E5成功转染检测细胞。结论重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-E5基因构建成功,能有效感染靶细胞。     

逆转录病毒载体介导PIG—A基因在突变型K562细胞中的表达

目的应用逆转录病毒载体将PIG-A cDNA转导至突变型K562细胞中,观察是否能够逆转K562细胞CD59的表达。方法采用PCR方法从质粒pEBPIG-A中扩增PIG-A基因片断,BamH I及Xho I双胁切后连接至逆转录病毒载体pLEGFP-C1相应位点。脂质体法转染PA317包装细胞,收集病毒上清感染突变型K562细胞,流式细胞仪测定感染前后CD59的表达情况。结果重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,24～48h荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。G418筛选后,病毒滴度测定达(1．6±0．2)×10~4CFU/mL。感染K562细胞前后测定CD59的表达率分别为4．5％±0．7％及21．3％±0．3％(P＜0．01)。结论成功构建了PIG-A基因逆转录病毒载体,感染突变型K562细胞后可以提高其CD59的表达。     

稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系的建立

为了建立稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞系,从重组克隆载体pGEMbcr-abl中酶切出bcr-abl融合基因片段,并将其亚克隆进逆转录病毒载体pLXSN中。脂质体介导重组逆转录病毒载体pLXSNbcr-abl转染包装细胞PT67,采用G418筛选后获得稳定产病毒的包装细胞。收集病毒感染NIH/3T3细胞,加G418筛选后进行逆转录病毒滴度的测定,计算病毒效价为2×107CFU/ml。结果表明,收集病毒上清感染SP2/0细胞(H-2d),经G418筛选获得了稳定表达bcr-abl融合基因片段的SP2/0细胞株。经特异性PCR扩增和RT-PCR反应扩增,从基因组整合和基因表达水平证实获得了能稳定表达bcr-abl融合基因片段的鼠SP2/0细胞系。结论:成功建立了表达bcr-abl融合基因的鼠SP2/0细胞系,这一肿瘤细胞模型可作为研究bcr-abl基因疫苗的有效实验工具,为检验bcr-abl基因疫苗激发小鼠CTL应答的研究奠定物质基础。     

携带人Ⅸ因子基因逆转录病毒载体的构建及其在小鼠骨髓细胞中的表达

构建携带人Ⅸ因子。cDNA的逆转录病毒载体MFGⅨ,并观察其在造血细胞中的表达。应用DNA重组技术将人Ⅸ因子cDNA构建入MFG载体,转导入包装细胞系PA317细胞,应用病毒上清转染造血细胞,并用PCR,ELISA及免疫组化方法检测其表达。研究结果表明,酶切鉴定成功构建MFGⅣ逆转录病毒载体,转入HT1080细胞系及小鼠骨髓细胞后,用PCR,ELISA及免疫荧光染色和免疫细胞化学染色证实Ⅸ因子的表达,且ELISA结果显示应用MFGⅨ转染Ⅸ因子蛋白及活性均高于LNCⅨ。结论提示MFGⅨ载体能较好转染造血细胞。     

重组人造血干细胞因子基因在人造血干／祖细胞的转移和表达

目的：拓展造血干细胞因子（ＳＣＦ）的研究和基因治疗途径。方法：利用基因重组技术，构建了编码可溶性人ＳＣＦ基因的逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ－ＳＣＦ，应用脂质体ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ基因转移法将重组质粒导入Ψ２和ＰＡ３１７病毒包装细胞，经Ｇ４１８选择性培养基筛选，获得产重组病毒的包装细胞ＰＡ３１７／ＳＣＦ，其病毒效价为（２．４～８．５）×１０５ＣＦＵ／ｍｌ，继而感染人造血干／祖细胞。应用多聚酶链反应、ＡＰＡＡＰ免疫组化染色和化学发光－直接酶标法检测人ＳＣＦ基因在细胞中转移和表达。结果：逆转录病毒载体介导的ｒｈＳＣＦ基因在人造血干／祖细胞中获得有效转移和表达。结论：为进一步研究ＳＣＦ的生物学特性及开展干细胞移植等提供了一定的途径。     

人红细胞生成素基因在哺乳动物细胞内的稳定表达

通过构建pN_2-EPO逆转录病毒载体,转染PA317包装细胞,收集病毒上清液,转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO),经G-418筛选及克隆建立了三株能稳定分泌人红细胞生成素(EPO)的细胞系。     

携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究

为了构建含绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力，利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子（phosphoglycerate kinase promoter，PGK）基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN，采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞，G418筛选出抗性克隆，收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞，在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明；重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后，可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后，含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论：逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞，可作为介导T细胞基因转移的重要工具。     

反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞

背景:为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的:观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。结果与结论:①病毒滴度为1.9×108CFU/L。②对照组 BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。     

反转录病毒载体转染小鼠骨髓细胞

背景：为方便、准确检测外源细胞在体内的存活情况,需在外源细胞转移标记基因。目的：观察多种细胞因子联合刺激下反转录病毒载体对BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因转移效率的影响。方法：以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过干细胞因子、白细胞介素3、白细胞介素6预培养刺激后的BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞,实验组实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。阴性对照组不做基因转移。阳性对照组为PA317-GCGPXSN细胞株。结果与结论：①病毒滴度为1.9×108CFU/L。②对照组 BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞测定的荧光强度数值为0.63%,实验组为76.04%,两组相比差异有显著性意义（P〈0.01）。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断,结果证实细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入BALB/C×C57BL F1代小鼠骨髓细胞基因组中。     

γ-干扰素基因对大鼠脑胶质瘤细胞生长及生存期的影响

背景反转录病毒载体介导细胞因子杀伤恶性肿瘤细胞为目前肿瘤科研领域的热点,逆转录病毒介导γ-干扰素是否抑制大鼠脑胶质瘤细胞的生长及延长其生存期的作用尚无肯定性结论.目的观察反转录病毒载体介导的γ-干扰素对大鼠脑胶质瘤细胞的生长抑制作用,探讨与生存期的关系.设计以动物为研究对象,完全随机设计.单位一所大学附属医院的神经外科.材料实验于2002-07/2004-07在哈尔滨医科大学神经外科研究所完成,选择哈尔滨医科大学附属第一临床医学院动物实验中心提供的60只Wistar雄性大鼠.随机分为C6对照组、C6/PA317neo对照组及C6/PA317γ-干扰素治疗组,每组20只.干预应用反转录病毒载体将鼠γ-干扰素基因转入反转录病毒包装细胞PA317,通过G418抗性筛选,得到高滴度产毒PA317 γ-干扰素细胞株.3组大鼠右侧基底核区接种1×106C6细胞.C6对照组接种后不做其他处理;C6/PA317neo对照组接种4 d后原位注射1×106PA317neo细胞;C6/PA317 γ-干扰素治疗组接种4 d后原位注射1×106 PA317 γ-干扰素细胞.实验观察①各组大鼠生存期≤60 d的情况.②每组动物C6细胞接种后11 d及20 d后随机取5只处死,取出整个脑组织制备冰冻组织切片,采用SABC免疫组化方法检测肿瘤组织CD4和CD8 T淋巴细胞浸润情况.③显微镜下借助图像分析软件测量肿瘤体积.主要观察指标①各组大鼠生存时间.②肿瘤体积测量.③CD4,CD8淋巴细胞浸润情况.结果60只大鼠进入实验分析.C6对照组及C6/PA317neo对照组大鼠平均生存时间分别为(27.10±0.82)d及(26.60±0.93)d,治疗组平均生存时间为(49.30±4.17)d,有5只大鼠存活期超过60 d.两对照组间生存期差异P＞0.05,治疗组较对照组生存期明显延长,P＜0.01.C6对照组及C6/PA317neo对照组肿瘤体积差异P＞0.05,治疗组肿瘤体积显著小于对照组,P＜0.01.计数肿瘤组织CD4及CD8 T淋巴细胞浸润情况发现治疗组CD4+及CD8+T淋巴细胞显著多于对照组,P＜0.01,两对照组之间差异P＞0.05.免疫组化检测Brdu阳性细胞,结果移植后7 d发现有Brdu阳性细胞,移植后16 d未发现Brdu阳性细胞,对照组均未发现阳性细胞.结论PA317 γ-干扰素细胞瘤内注射能够诱导大鼠产生抗肿瘤免疫反应,反转录病毒介导的γ-干扰素抑制肿瘤细胞生长,可明显延长生存期.     

应用IRES序列研究人FL与Tpo基因在转染HFCL细胞中的表达

目的　探讨应用内部核糖体进入位点（ＩＲＥＳ）序列对逆转录病毒介导的人Ｆｌｔ３ 配基（ＦＬ）与血小板生成素（Ｔｐｏ） 基因在骨髓基质细胞系ＨＦＣＬ中的表达。方法　利用基因重组技术将ＩＲＥＳ序列与ＦＬ和Ｔｐｏ 基因构建到逆转录病毒载体中,脂质体法将重组质粒ｐＬＦＴＳＮ 和空载体ｐＬＸＳＮ转染ＰＡ３１７细胞,经Ｇ４１８ 筛选。用抗性克隆培养上清感染ＨＦＣＬ细胞,ＲＴＰＣＲ和基因组ＤＮＡＰＣＲ分析ｍＲＮＡ的表达及基因组整合情况,ＣＦＵＧＭ 集落法和Ｔｐｏ 依赖株法测定生物学活性。结果　成功构建出含ＩＲＥＳ序列的ＦＬ与Ｔｐｏ 基因逆转录病毒载体,ｍＲＮＡ水平及基因组中整合有ＦＬ与Ｔｐｏ 基因,生物学活性测定表明转染的骨髓基质细胞同时分泌ＦＬ与Ｔｐｏ。结论　ＩＲＥＳ序列调控ＦＬ与Ｔｐｏ 双基因在骨髓基质细胞中同时独立表达,为进一步研究转基因骨髓基质细胞对造血调控的影响奠定了基础。