人抑瘤素M基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人Oncostatin M（OSM，抑瘤素M）基因的逆转录病毒载体。方法用DNA重组技术，以pcDNA3．1finyc-his（-）A-hOSM重组质粒为模板PCR扩增人OSM基因，酶切连接到带有GFP标记的逆转录病毒载体pEGZ／MCS．HA上，连接产物转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，抽提质粒，用PCR法、限制性内切酶EeoRI和BamHI双酶切法及测序鉴定。然后以脂质体转染法，将重组的逆转录病毒载体与辅助质粒HIT456、HIT60共同转染入包装细胞系293T以包装病毒。结果构建了重纽人抑瘤素M基因逆转录病毒载体，PCR产物电泳可见约750bp处有特异性条带，EcoRI和BamH，双酶切，电泳出现两个条带，约750bp处亦有相应条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人抑瘤素M基因的CDS序列完全一致。转染293T细胞在倒置荧光显微镜下可见绿色荧光，且细胞有病变。提示构建携带人OSM基因的逆转录载体成功。结论携带人抑瘤素M基因的重组逆转录病毒载体pEGZ／MCS-HA-hOSM成功构建为此基因的临床应用和实验研究奠定了基础。     

人YPEL5基因真核表达载体的构建及在食管癌细胞中的表达

目的构建人YPEL5基因真核表达重组质粒并在食管癌细胞EC9706中表达。方法以人正常组织的cDNA为模板,扩增得到长366bp的YPEL5基因编码序列,将此序列插入到真核表达载体pCDHCD513B的多克隆位点区域中,得到真核表达载体pCDH-CD513B-Flag-YPEL5,经菌落聚合酶链反应(PCR)鉴定后送公司测序。将构建成功的重组质粒转染到人食管癌细胞系EC9706中,利用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测YPEL5基因的表达情况。结果成功扩增出YPEL5基因片段,大小为366bp,经双酶切、连接、转化和筛选得到pCDH-CD513B-Flag-YPEL5重组质粒,通过基因测序鉴定显示重组质粒中插入的基因序列与GenBank中的序列一致,转染EC9706细胞2d后,荧光定量PCR和Western Blot显示YPEL5基因的表达明显上调。结论成功构建了pCDH-CD513B-Flag-YPEL5真核表达载体并在食管癌细胞株EC9706中得到表达,从而为进一步研究其在食管癌进展中的功能奠定了基础。     

hVPS4A 基因克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆人细胞空泡蛋白分选因子4A（human vacuolar protein sorting 4A,hVPS4A）基因,构建其真核表达质粒。方法以 Huh7细胞 cDNA 为模板,设计引物扩增全长 hVPS4A 基因,再将目的基因插入到真核载体 pRK5中。重组质粒经PCR、酶切和 DNA 测序确认。结果从 Huh7细胞 cDNA 中扩增得到约1350 bp 大小的目的片段,经回收、纯化、酶切后与载体pRK5连接,转化 DH5α大肠杆菌。选择 PCR 鉴定阳性的重组质粒,经 EcoRⅠ单酶切可见约一条5900 bp 片段;经 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切可得到4600 bp 和1350 bp 两个片段,分别与载体 pRK5和目的片段 hVPS4A 预期大小一致;DNA 测序结果显示插入片段与 hVPS4A 参考序列一致。结论成功构建了含 hVPS4A 基因的真核表达载体,为进一步研究 hVPS4A 的生物学功能提供了条件。     

内源性胰岛素替代疗法中葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体的构建

背景由于胰岛细胞分离技术难度较大,目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的构建葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础,可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZ1)经EcoR1/BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建逆转录病毒表达载体PLX-GK,用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317,筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系,PCR鉴定。主要观察指标①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果成功构建GK基因逆转录病毒表达载体,经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;产毒细胞系的平均病毒滴度为6.8×108CFU/L,筛选出一株病毒滴度为1.8×109CFU/L稳定产毒细胞系PA317/GK,PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。     

重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

目的 构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法 聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pcDNA3．1（＋）/Tat中扩增tat基因,利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ,获得正向插入克隆（pSecT at ）和反向插入克隆（pSecTat-AS）,经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带,与预期的324 bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100％同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×10^3蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT 表达量高于反向克隆质粒转染细胞（P＜0．05）。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高（P＜0．05）。结论 成功构建 HIV-1 tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的T at蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。     

Ad-vcam-1-gfp重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究

本研究探讨血管细胞黏附分子（vcam-1）修饰的人脐血源基质细胞（human umbilical cord blood derived strom cells，CBDSC）在造血调控中的作用。采用DNA重组技术，将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒；在BJ5183细胞中与pAdeasy—1质粒进行同源重组，产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定。结果表明：vcam-1基因与pAdTrack—CMV载体成功连接，经NotⅠ／XhoⅠ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2kb左右条带，经PCR法扩增后电泳可见1个600bp左右条带，证明pAdTrack—CMV—vcam-1重组质粒构建成功。pAdTrack—CMV—vcam-1质粒与pAdeasy—1质粒同源重组后，产物经PACⅠ酶切后电泳可观察到2个大小约为31kb、4kb左右条带，与预期结果相符。腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT—PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达。结论：构建ad—vcam-1-gfP重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高。     

人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人Shh基因过表达慢病毒载体,转染293T细胞,建立稳定转染人Shh基因的293T的细胞系。方法设计引物引入AgeI酶切位点,使用PCR方法从质粒中扩增Shh基因的编码区序列,对所扩增出的目的片段回收纯化。将AgeI内切酶消化后目的片段交换连接人pGC-FU载体,构建Shh慢病毒表达载体pGC-FU-Shh。酶切验证并测序正确后,将质粒pGC-Fu-Shh与携带GFP的慢病毒辅助包装载体共转染293T细胞,荧光显微镜检测慢病毒载体转染细胞的结果,重组质粒pGC-Fu-Shh的测序,Westernblotting验证Shh在转染293T细胞中表达。结果转染293T细胞后荧光显微镜,24h后观察到绿色荧光蛋白的表达,基本判断Shh表达,说明转染成功。重组质粒pGC-FU-Shh的测序Shh基因片段大小1386bp。通过Westernblotting检测转染293T的样品,可以观察到72～95KDa处条特征带与Sbh融合蛋白相吻合,判断Shh表达。通过PCR扩增获得了Shh基因,将Shh克隆到慢病毒转移质粒pC-C-FU中,并在293T细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了pGC-FU-Shh-GFP慢病毒过表达载体,获得了稳定转染的细胞株。     

内源性胰岛素替代疗法中葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体的构建

背景：由于胰岛细胞分离技术难度较大，目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的：构建葡萄糖激酶(Glucokinase，GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系，为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础，可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计：非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预：本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZl)经EcoR1／BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN，构建逆转录病毒表达载体PLX-GK，用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317，筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系，PCR鉴定。主要观察指标：①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果：成功构建GK基因逆转录病毒表达载体，经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变；产毒细胞系的平均病毒滴度为6．8&;#215;10^8CFU／L，筛选出一株病毒滴度为I．8&;#215;10^9CFU／L稳定产毒细胞系PA317／GK，PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论：成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。     

心脏转录因子Nkx2．5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2．5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2．5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx25为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2．5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx25的PCR产物分别在双酶切后用,T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2．5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2．5基因编码区约1000bp的目的片段。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2．5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2．5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

pEGFP-HPV16 E6重组质粒的构建及其在Hela细胞中的表达定位

目的 构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescen ceprotein，GFP）为报告基因的重组表达质粒pEGFP—HPV16 E6。方法 利用脂质体转染体外培养的Hela细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP—HPV16 E6融合蛋白在细胞中的分布和定位，用Western blot方法验证其蛋白的表达。结果 表明在空载体pEGFP—C2转染组中，Hela细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒pEGFP—HPV16 E6转染组中，绿色荧光集中在细胞核中。Western blot的结果确证了pEGFP—HPV16 E6融合蛋白的表达。结论 提示pEGFP—HPV16 E6融合基因真核表达载体在真核细胞Hela中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有HPV16 E6和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及业细胞定位，为HPV16 E6的功能研究提供了线索。     

SARS-CoV S蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

sox4不同结构域的真核表达质粒的构建和鉴定

目的：构建并鉴定sox4四段不同结构域的重组真核表达质粒。方法：以HL-60细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增出sox4基因cDNA,将产物克隆进真核载体pCMV—Flag质粒内,构建含sox4不同结构域的重组真核表达质粒。将pCMV—Flag—sox4重组质粒转染293T细胞,Westernblot检测sox4蛋白表达。结果：核酸序列分析sox4已成功插入pCMV—Flag载体中,转染pCMV—Flag-sox4的293T细胞中检测到表达的sox4蛋白。结论：成功构建了含sox4基因的重组真核表达质粒。     

人乳头瘤病毒18型E6蛋白真核表达载体的构建及其在子宫颈癌细胞株Hela细胞中的表达

目的构建并鉴定p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体,并转染Hela细胞后,检测其在Hela细胞中的表达。方法用RT-PCR法从Hela细胞中扩增出带HindⅢ、SalⅠ酶切位点的HPV18E6基因片段,将HPV18E6基因片段连接到pMD-18T载体上,通过限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ酶切,T4连接酶连接到含有上述酶切位点的p3×flag-myc-CMV-24真核表达载体上,通过脂质体将p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6转染入Hela细胞48h后,Western-blot检测HPV18E6及3×flag表达情况。结果p3×flag-myc-CMV-24-HPV18E6真核表达载体构建成功,构建的真核表达载体可以被限制性内切酶HindⅢ、SalⅠ切开,电泳可显示相应条带,经测序其序列与设计的一致,转染到Hela细胞48h后经Western-blot检测可见HPV18E6的高表达及flag的表达。结论p3×flag-myc-CMV-24HPV18E6真核表达载体的成功构建为进一步研究HPV18E6的致癌机制奠定了基础。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建

背景：脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoRⅠ、xhoⅠ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。结果与结论：RT-PCR产物为749bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生749bp和5446bp的片段,DNA测序证实749bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

在HeLa细胞中表达人βIVS—Ⅱ—nt—654C→突变基因

OBJECTIVE: To establish a cell model expressing human betaIVS- II -nt 654C --> T allele (beta654 mutant). METHODS: DNA fragment of entire beta-globin gene encompassing the codon region and poly(A) signal of the allele was amplified by long PCR from the genomic DNA of a homozygote with beta65.4 mutation. The amplified fragments were cloned into the Hind III and Xba I sites of the pcDNA3.1 vector. After reidentification of the clone with beta654 mutant by DNA sequencing, the recombinant plasmid was transfected into HeLa cell using liposome method. The expression of the beta654 mutant gene in the transfected cells was detected by RT-PCR. RESULTS: Both the normally processed beta globin mRNA (183bp) and aberrant processed beta globin mRNA (256bp) were identified in the transfected HeLa cells, while no RT-PCR product was detected in the controls. CONCLUSION: The transfected HeLa cells can express human beta654 allele.