siRNA抑制PPARγ表达对绒癌细胞JEG-3侵袭力的影响

目的: 采用小分子干扰RNA(siRNA)技术特异性地抑制绒癌细胞株JEG-3中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的表达,研究PPARγ影响JEG-3细胞侵袭力的机制。方法: 将实验设为实验组(转染 PPARγ 基因的特异性siRNA)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)和空白对照组(不转染任何siRNA片段,其它试剂与另两组相同),采用实时定量PCR技术从mRNA水平检测PPARγ及黏蛋白-1(MUC1)的表达;利用Transwell侵袭实验观察siRNA转染JEG-3细胞后细胞侵袭力的变化。结果: siRNA使PPARγ mRNA的表达水平下调了(75.0±0.8)% (P<0.05),MUC1mRNA的表达水平下调了(65.0±1.3)% (P<0.05),JEG-3细胞侵袭Matrigel的能力显著增强(P<0.05)。结论: PPARγ表达水平的下降能相应下调MUC1的表达水平,并增强滋养细胞的侵袭能力,推测PPARγ可能通过调节 MUC1 基因影响滋养细胞的侵袭能力,从而参与了子痫前期等病理妊娠的发生。     

针对HLA-G的siRNA的载体构建与表达及效应检测

目的构建针对HLA-G的siRNA的表达载体,研究其对NK细胞杀伤效应的影响。方法构建针对HLA-G的siRNA真核表达质粒pSuppressor-U6-neo-HLA-G,转染JEG-3滋养细胞系。采用RT-PCR、Western blot检测转染的JEG-3细胞中HLA-G的表达水平。将NK-92MI细胞(效应细胞)与滋养细胞(靶细胞)共同培养,以LDH释放法观察不同效靶比例时NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤效应。结果NK-92MI细胞对转染针对HLA-G的siRNA的JEG-3细胞的杀伤作用较未转染细胞明显升高(P<0.001)。结论针对HLA-G的SiRNA增加NK细胞对滋养细胞的杀伤,HLA-G具有保护滋养细胞免受NK细胞杀伤的作用。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Slug基因对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术沉默Slug基因,观察对结肠癌HCT116细胞增殖和周期的影响。方法:构建Slug基因特异性siRNA慢病毒载体,感染结肠癌HCT116细胞,设立空白对照组、阴性对照组及SlugsiRNA三组,应用Real-time PCR和Western blot方法分别从基因和蛋白质水平检测各组干扰质粒对Slug基因的干扰效果,MTT法检测Slug基因在siRNA作用下的细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡周期变化情况。结果:转染Slug siRNA后,结肠癌HCT116细胞中Slug基因mRNA和蛋白表达明显受到抑制(P<0.05);MTT检测,干扰组细胞增殖水平明显低于阴性对照组;流式细胞仪检测细胞G1期细胞百分比(52.3±0.6)高于阴性对照组(45.1±0.3,P<0.05)。结论:Slug siRNA能明显下调靶基因Slug的表达,在体外可抑制结肠癌HCT116细胞的生长并促进其凋亡。     

KDR为靶的siRNA抑制乳腺癌细胞增殖的体内外研究

目的:采用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)在体内外抑制含激酶插入区受体(KDR)基因表达,探讨化学修饰的siRNA介导的RNA干扰(RNAi)技术在乳腺癌基因治疗的可行性和特异性.方法:采用阳离子脂质体Lipofectamine2000TM作为转染试剂将针对人KDR基因的siRNA转染人类乳腺细胞株MCF-7,诱导RNAi,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,RT-PCR,Western blot试验等检测KDR基因和蛋白表达及细胞增殖变化.采用阳离子聚合物纳米粒In vivo jetPEITM为转染试剂将siRNA直接注射进裸鼠移植瘤,监测肿瘤生长变化,RT-PCR,免疫组化方法等监测KDR基因和蛋白表达变化.结果:靶向KDR基因siRNA转染MCF-7后,细胞增殖被抑制,KDRmRNA和蛋白的表达明显降低;裸鼠体内实验显示siRNA治疗组瘤组织的增长受到明显抑制;RT-PCR,免疫组化结果同时表明治疗组KDR表达下调.各对照组指标无明显变化.结论:化学修饰的siRNA介导的RNAi在体内外均能成功抑制靶基因的表达和MCF-7细胞增殖,是潜在的肿瘤治疗新方法,而KDR亦可作为肿瘤治疗的新靶点.     

利用不同方法检测RNAi抑制人pescadillo基因的表达

目的:构建人pescadillo(PES1)基因siRNA的真核表达载体,观察其对PES1表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对PES1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。分别用以下3种方法检测RNAi的抑制效果:(1)将RNAi重组质粒和带FLAG标签的PES1共转染293T人胚肾细胞,用FLAG抗体进行Western blot;(2)将RNAi重组质粒和带GFP标签的PES1共转染293T细胞,用荧光显微镜观察GFP的亮度;(3)在293T细胞中仅转染小干扰RNA(siRNA)重组质粒,用PES1抗体进行Western blot分析。结果:测序证明,成功构建了PES1siRNA真核表达载体。通过Western blot实验证明,构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性PES1基因表达;荧光显微镜检查发现siRNA能明显减弱细胞中荧光强度,抑制PES1的表达。结论:成功地构建了PES1siRNA的真核表达载体,利用3种不同方法均证明该siRNA能有效地抑制PES1基因的表达。     

RNA干扰对肝癌细胞株SMMC7721中STAT3基因表达的抑制作用

目的:研究小片段干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞系SMMC7721的化疗敏感性.方法:根据信号转录及转录活化因子3(STAT3)基因设计siRNA序列,通过经脂质体LipofectamineTM2000以siRNA转染SMMC7721细胞.用实时定量PCR检测SMMC7721细胞中STAT3基因表达的抑制.将细胞以10 μmol/L 5-氟脲嘧啶(5-Fu)作用后,用MTT比色法检测细胞生长的抑制率.结果:成功地构建针对STAT3基因的siRNA表达载体.实时定量PCR检测结果显示,SMMC7721细胞经特异性siRNA转染后,STAT3基因的表达受到抑制.RNA干扰(RNAi)能特异、有效地抑制SMMC7721细胞中STAT3基因的表达.MTT比色法检测结果显示,经siRNA作用后SMMC7721细胞抑制率明显增加.结论:设计合成的siRNA表达载体能有效抑制STAT3基因在肝癌细胞系SMMC7721中表达,增强其对化疗药物5-FU的敏感性,为肿瘤的生物学治疗提供了实验依据.     

Suppression of FLI-1 expression through lentivirus-based vectors mediated RNAi

目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)方法 对小鼠红白血病细胞(CBa)中FLI-1基因表达的抑制作用.方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA( siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体,PCR阳性菌落进行测序鉴定,对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况.RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达.结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒,病毒滴度为1.5E+9TU/mL,并可将其高效感染CB3细胞,病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组(P＜0.001).结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达.     

ST6Gal I 基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalIsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力。结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalIsiRNA组细胞中ST6GalImRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalIsiRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论:化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。     

RNA干扰在免疫学研究中的作用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是内源或外源性双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)诱发的mRNA水平上的基因沉默机制,具有高度特异、高效、持久的特点。RNAi现象在生物界广泛存在,是一种古老而高度保守的防御机制。21bp小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)在哺乳动物细胞中可诱导特异性RNA干扰作用,为人类疾病的研究和治疗提供了新的途径。目前RNAi已经在功能基因组学、免疫学研究、以及基因治疗和信号转导等广泛的领域里取得了令人瞩目的进展。     

TLR4通过NF-κB信号途径对宫颈癌细胞增殖的影响

目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)小干扰RNA(siRNA)是否通过NF-κB信号途径下调Bcl-2而抑制宫颈癌细胞的增殖。方法:设计并合成针对TLR4基因的3条特异性siRNA)及阴性siRNA,并同时设立空白对照,然后用脂质体LipofectamineTM2000转染细胞。通过半定量RT-PCR和Western印迹法分别检测转染前后He La细胞中TLR4 mRNA和蛋白表达水平,Western印迹法检测p65及Bcl-2蛋白表达水平,MTT法和平板克隆检测细胞增殖率,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期。结果:3条针对TLR4基因的siRNA均能抑制TLR4的mRNA和蛋白表达,其中TLR4-siRNA-003的沉默效率最高。转染TLR4-siRNA-003 48 h后细胞中TLR4的mRNA和蛋白表达水平分别下调62%和89%,p65及Bcl-2蛋白水平明显下调,同时细胞增殖明显受到抑制,细胞凋亡率显著升高,细胞周期被阻滞于G1期。结论:TLR4特异性siRNA能够有效沉默TLR4基因表达,并通过NF-κB信号通路下调Bcl-2而显著抑制宫颈癌He La细胞的增殖。TLR4可能成为治疗宫颈癌的一个新靶点。     

PTTG基因siRNA载体的构建与鉴定

目的构建针对垂体腺瘤细胞系AtT20的高效率沉默PTTG基因的shRNA表达载体。方法合成特异性干扰PTTG基因的小发卡RNA(shRNA)片段,并与pGenesil2载体连接,构建PTTG干扰载体(pGenesil2-PTTG shRNA)。利用脂质体将其转染AtT20细胞,分为正常细胞对照组、阴性对照组和3个shRNA干扰组(pGenesil2-PTTG siRNA1、2及3),应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法分析转染后AtT20细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平。结果酶切证实PTTG-shRNA表达载体构建成功;转染效率可达75%左右。转染pGenesil2-PTTG shRNA后,3个干扰组的AtT20细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低(P<0.01)。结论成功构建了能高效沉默PTTG的RNAi表达载体;且pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了垂体腺瘤细胞AtT20细胞中PTTG綦因的表达。     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞葡萄糖调节蛋白78表达及其意义的研究

目的研究利用小分子干扰技术（RNAi）,构建Grp78靶向RNA干扰质粒载体,观察其对人类卵巢癌细胞SKOV3Grp78基因表达的抑制作用。初步探讨RNA干扰技术抑制Grp78的表达作为卵巢癌基因治疗的可行性。方法从GeneBank中选取人类卵巢癌细胞Grp78基因序列,采用siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计Grp78基因发卡寡核苷酸,序列符合siRNA表达载体psiSTRIKETMU6的要求并与psiSTRIKETM质粒载体连接,采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp78 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp78导入卵巢癌细胞系SKOV3中,分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR和Western blot检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度紫杉醇处理后的细胞存活率。结果成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78 RNA干扰质粒载体命名为psiSTRIKETM/Grp78。将上述质粒转染到卵巢癌细胞后,观察到psiSTRIKETM/Grp78能够有效的抑制Grp78 mRNA及蛋白表达。转染psiSTRIKETM/Grp78基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制,出现凋亡征象,且对化疗药物的敏感性增加。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达,增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi技术抑制Grp78表达为卵巢癌的基因治疗开辟了新的思路。     

RNA干扰CREB对缓激肽作用的胶质瘤细胞IL-1β分泌的影响

目的探讨转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的磷酸化是否介导了缓激肽刺激大鼠C6胶质瘤细胞内白细胞介素-1β(IL-1β)的表达。方法利用RNA干扰(RNAi)技术,以CREB为靶基因,将体外化学合成的CREB序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)和无关序列的siRNA分别与Lipofectamine2000结合后转染细胞,用Western blot分析CREB蛋白的表达水平。利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量技术和放射免疫法分别检测CREB siRNA转染前后,缓激肽诱导C6胶质瘤细胞IL-1βmRNA及细胞培养上清液中IL-1β的表达水平。结果CREB序列特异性siRNA转染细胞72h后,可较强的抑制CREB蛋白的表达,而无关序列的siRNA对CREB蛋白表达水平无明显的抑制作用。RT-PCR和放射免疫法结果均显示CREBsiRNA干预C6细胞后,并未改变缓激肽刺激IL-1β表达的能力。结论化学合成的siRNA可有效抑制C6胶质瘤细胞中CREB的表达,CREB可能未参与缓激肽刺激C6细胞IL-1β表达的信号转导过程。     

RNA干扰技术及其应用

近来研究发现 ,真核细胞内某些双链RNA能高效、特异地结合、降解互补mRNA ,阻断特异基因的表达 ,介导高度序列特异性的基因沉默 ,导致细胞出现特定基因缺失的表型 ,此现象称为RNA干扰 (RNAinterference,RNAi) ,其中 2 1～ 2 5nt大小的短双链RNA称为siRNA(smallinterferingRNA) .siRNA与核酶复合体结合形成RNA诱导的沉默复合物 (RNA -inducedsilencingcomplex.RISC) .RISC通过碱基配对方式与靶mRNA结合 ,并在距离siRNA 3’端 12个碱基的位置切割、降解靶mRNA .RNAi具有高效性和序列特异性 ,已经成为功基因组研究的有力工具 ,并且有可能在某些疾病如肿瘤等的基因治疗中发挥重要作用 .     

用慢病毒载体介导的RNAi感染CB3细胞后抑制FLI-1的表达

 【摘要】目的 观察慢病毒载体介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)方法对小鼠红白血病细胞（CB3）中FLI-1（Friend leukemia integration-1,FLI-1）基因表达的抑制作用,以为后续实验提供有力的技术支持。方法 设计制备针对目的基因FLI-1的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA),构建制备目的基因的siRNA慢病毒载体,PCR阳性菌落进行测序鉴定,对慢病毒包装与滴度测定后感染CB3细胞,观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况。RT-PCR和Western blot检测病毒感染CB3细胞后FLI-1的表达。结果 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并包装成慢病毒颗粒,病毒滴度为1.5E+9TU/ml,并可将其高效感染CB3细胞,病毒感染后FLI-1在转录水平和翻译水平的表达量显著低于对照组和未感染病毒组（P<0.001）。结论 成功构建了针对FLI-1基因的siRNA慢病毒载体,并可有效抑制CB3细胞中FLI-1基因的表达,为后续实验提供稳定的感染细胞载体。     

沉默癌胚抗原相关细胞黏附分子1基因抑制SHG44人胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡

目的采用RNA干扰技术(RNAi)沉默癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)基因的表达,观察沉默效果及沉默CEACAM1表达后对SHG44人胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并化学合成针对CEACAM1的3对小干扰RNA(siRNA),脂质体法瞬时转染SHG44细胞。流式细胞术(FCM)检测转染效率,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测siRNA转染前后SHG44细胞中CEACAM1 mRNA的表达,Western blot法检测CEACAM1蛋白的表达。CCK-8法检测SHG44细胞细胞增殖活性,annexin V-FITC/PI染色结合FCM检测SHG44细胞凋亡,Western blot法检测cleaved caspase-3和裂解型多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(cleaved PARP)的变化。结果 CEACAM1 siRNA转染效率达85%。与空白对照组和阴性对照组比较,qRT-PCR及Western blot结果显示,3组特异性siRNA转染48 h后,在mRNA和蛋白水平上CEACAM1的表达均降低,以CEACAM1-siRNA3效果最明显。siRNA组SHG44细胞的增殖能力较正常对照组明显下降,凋亡细胞比例增加。沉默CEACAM1表达可以上调cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达。结论沉默CEACAM1基因表达可有效抑制SHG44胶质瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡。     

RNAi技术抑制HCMV-IE1表达的在体实验研究

目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi) 对体内人类巨细胞病毒-立即早期基因1(human cytomegalovirus immediate-early gene 1,HCMV-IE1)表达的沉默作用,为靶向HCMV-IE1的基因治疗提供科学的实验依据.方法:选取60只雄性昆明种小鼠,并分为3组,分别为实验对照组(注射生理盐水)、病毒感染组(注射HCMVAD169株病毒液)和RNA干扰组(染毒后第2天注射转染了表达RNAi载体的人胚肺成纤维细胞液);采用PCR法检测小鼠体内HCMV基因的表达水平;采用ELISA检测动物血清中HCMV-IgM的含量;采用免疫组织化学和Western免疫印迹技术分别测定小鼠体内HCMV-IE1的蛋白水平.结果:PCR结果表明干扰组比病毒感染组的HCMV的基因表达下调20%;ELISA结果表明RNAi能使动物血清中HCMV的含量降低为19%;免疫组织化学和Western免疫印迹结果证实,干扰组和病毒感染组的HCMV-IE1蛋白水平分别降低为17.6%和18.5%.结论:RNAi技术能有效地抑制目的基因在体内的表达,有可能用于靶向HCMV-IE的基因治疗.     

RNA干扰敲低GSK-3β对瘢痕疙瘩形成影响的体外研究

目的:利用RNA干扰技术探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KFB)的抑制效果。方法:将针对人GSK-3β基因设计合成的3对特异性小干扰RNA(siRNA)分别转染体外培养的人KFB,通过RT-PCR和Western blot筛选出干扰人KFB GSK-3β基因表达的最佳siRNA,进而转染人KFB,并用RT-PCR和Western blot检测GSK-3β及相关蛋白的m RNA和蛋白表达。结果:1434序列具有最佳的GSK-3βm RNA和蛋白抑制效率。转染GSK-3βsiRNA后,KFB的β-catenin、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p-GSK-3β和Wnt2的蛋白水平下降,KFB活力下降,且随着培养时间的延长,细胞生长受抑制程度增大,细胞倍增时间明显延迟。结论:转染靶向GSK-3β的siRNA可有效降低该基因在KFB内的表达,从而抑制了瘢痕疙瘩生长,具有潜在的治疗前景。     

siRNA设计研究进展及在线设计

研究基因功能的方法之一是减少或消除其在细胞中的表达.RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 技术可以研究一个单独基因的作用, 其效应因子为小干扰RNA(small interfering RNAs, siRNA)分子[1].