慢性乙型肝炎患者外周血CD4~+CD25~+Treg与CD4~+和CD8~+ T淋巴细胞亚群的相关研究

目的:探讨慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+调节性T细胞的含量和CD4+CD8+T淋巴细胞亚群分布,两者之间相关性及与HBV的相关性。方法:采用流式细胞术检测50例慢性乙型肝炎患者和20例健康对照者外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞表达及CD3/CD4/CD8 T淋巴细胞亚群,荧光定量PCR法检测HBV DNA含量。结果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25highTreg明显高于健康对照组(P0.01),且随HBV DNA载量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg细胞的水平逐渐升高。慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞也相应增高,且与CD4+CD25highTreg细胞的变化成正相关(r=0.890,P0.001)。与健康对照组比较,患者组CD4+T细胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,而CD3+T细胞和CD8+T细胞百分率差异无显著性(P0.05)。CD4+CD25highTreg细胞与HBV DNA取对数后成正相关(r=0.782,P0.001),与谷丙转氨酶(ALT)成正相关(r=0.432,P0.005);与CD3+、CD4+、CD8+T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无相关性(P0.05)。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+比值与HBV DNA载量之间亦无相关性(P0.05)。结论:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞增高,且与HBV的复制水平及ALT增高具有一致性,而T细胞亚群是否可作为监测CHB患者免疫状态的指标需进一步探讨。     

中国HIV感染长期不进展者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞变化研究

目的 对中国HIV感染长期不进展者(LTNP)CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞水平及其与疾病进展相关性进行研究,探讨CD4+CD25+Foxp3+ 调节性T细胞在LTNP保护机制中发挥的作用.方法 选取74名HIV-1感染者(LTNP、典型进展HIV组、AIDS组)及16名健康对照,应用流式细胞仪胞内染色技术在单细胞水平检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表达水平,分析其与CD4+ T细胞数量、病毒载量、淋巴细胞活化、凋亡水平的相关性.结果 中国HIV感染LTNP CD4+CD25+Foxp3+ T细胞百分率明显低于典型进展HIV、AIDS组及健康对照组(P<0.05).HIV/AIDS患者CD4+CD25+Foxp3+ T细胞百分率与CD4+ T细胞显著负相关(r=-0.509,P<0.001),与病毒载量明显正相关(r=0.414,P<0.01),与CD4、CD8+ T细胞表面CD38、CD95表达水平明显正相关(P<0.05),与CD4、CD8+ T细胞表面HLA-DR表达无显著相关性.结论 中国HIV感染LTNP CD4+CD25+Foxp3+ 调节性T细胞百分率明显低于典型进展者,提示调节性T细胞与LTNP保护机制相关.     

浆细胞性乳腺炎患者外周血CD4+CD25+CD127-调节性T细胞变化

目的:观察浆细胞性乳腺炎(Plasma cell mastitis,PCM)患者外周血CD4+ CD25+ CD127-调节性T细胞(CD4+CD25+ CD127-Treg)数量和功能变化,以探讨PCM免疫病理机制.方法:将58例浆细胞乳腺炎患者分成三组:其中急性组13例(22％)、亚急性组25例(43％)和慢性组20例(34％).并设正常对照组20例及乳腺癌对照组16例.以流式细胞术检测各型PCM患者外周血中CD4 +CD25+ CD127 Treg细胞百分率;实时荧光定量RT-PCR检测转录因子Foxp3表达及ELISA检测TGF-β水平.结果:三组PCM组与正常组相比,外周血CD4+ CD25+ CD127 Treg数量,外周血PBMC中Foxp3表达及血浆TGF-β水平均下降(P＜0.05),其中急性PCM组下降最为明显(P＜0.01),乳腺癌组三项指标均升高(P＜0.05).结论:浆细胞性乳腺炎患者的CD4+ CD25+ CD127-Treg数量及功能有所下降.     

中国健康人外周血中具有CD4+CD25nt/hiCD127lo特征的调节性T细胞频率

目的:初步确定健康人外周血中具有CD4+CD25nt/hiCD127lo特征的调节性T细胞(Treg)频率,为临床相关疾病的研究及Treg的分选提供参考.方法:采集312名8～60岁(5个年龄组)、不同性别健康人的静脉血,经三重免疫荧光染色,用流式细胞术分析CD4+CD25nt/hiCD127lo Treg细胞频率,并观察细胞内Foxp3转录因子的表达.结果:健康人CD4+CD25nt/hiCD127lo Treg细胞在外周血中约占CD4+T细胞的(6.55±0.11)%,各年龄组之间有差异(P=0.015),组内性别之间也存在统计学意义(P＜0.05);CD25nt/hiCD127lo细胞特异性地表达Foxp3转录因子.结论:初步确定了中国健康人外周血中具有CD4+CD25nt/hiCD127lo表达特征的细胞频率,为Treg细胞的临床研究奠定了基础;CD25nt/hiCD127lo作为CD4+CD25+Treg细胞表面的特征性标志,可在分选时排除其他细胞干扰,获得较完整的Treg细胞.     

类风湿关节炎患者外周血和滑液中CD4~+CD25~+调节性T细胞的水平变化

了解具有抑制功能的CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在类风湿关节炎(RA)中的水平变化。分离32例RA患者及35例正常对照者外周血和15例RA关节滑液中的单个核细胞,用荧光抗体标记细胞膜表面CD4、CD25分子和细胞内Foxp3转录因子,进行流式细胞分析,同时用RT-PCR方法测定单个核细胞中Foxp3 mRNA水平。实验发现RA外周血中CD4+CD25hT细胞比例(1.90±1.68)与健康人(1.81±1.79)无明显差异,而RA关节滑液中CD4+CD25+和CD4+CD25hT细胞含量却明显增高(14.98±12.52,8.94±9.67,P<0.01)。RA患者外周血单个核细胞中Foxp3+/CD4+T细胞比值(2.35±2.06)较正常人(7.25±3.98)明显降低(P<0.01),RA外周血中Foxp3 mRNA含量较正常人Treg减少,而RA关节液中Foxp3 mRNA含量较RA外周血更为低下(P<0.01)。RA患者存在CD4+CD25+Treg的异常改变,其外周血和关节液中具有抑制作用的Treg含量明显降低提示RA患者Treg数量减少及抑制功能下降可能是RA自身免疫反应亢强不能控制的原因之一。RA关节液中CD4+CD25hT细胞增高考虑与RA炎症反应造成T细胞过度活化有关。     

宫颈癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+调节性T淋巴细胞及血清中IL-10、TGF-β的表达及其临床意义

目的 探讨宫颈癌患者外周血CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T淋巴细胞(regulatory T cells,Treg)、T淋巴细胞亚群以及血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2细胞因子的表达及其临床意义.方法 选取32例宫颈癌患者和24位健康体检者为研究对象,采用流式细胞术检测受试者外周血中CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例、T淋巴细胞亚群细胞比例;采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-10、TGF-β1、TGF-β2的含量.结果 与健康对照组相比,宫颈癌组外周血中CD4+CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值明显增高,差异有统计学意义(P＜0.01),T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4 +/CD8+、CD19+)比例差异无统计学意义(P＞0.05),血清IL-10含量明显增高,TGF-β2含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),TGF-β1的含量差异无统计学意义(P＞0.05);宫颈癌组手术后、化疗后CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比例,血清IL-10、TGF-β1、TGF-β2含量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),CD4+ CD25+ Foxp3+Treg与TGF-β1之间存在正相关(r=0.673,P＜0.01).结论宫颈癌患者CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg占CD4+T淋巴细胞的比值增高,且与TGF-B1含量呈正相关,可能在宫颈癌的肿瘤发生发展及肿瘤免疫逃逸中起着重要作用.     

强直性脊柱炎患者外周血CD4+调节性T细胞的变化及意义

目的 探讨强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者外周血中CD4+调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的表达、功能及意义.方法 采用流式细胞术检测78例AS患者和50例健康志愿者外周血中CD4+CD25+CD127lo/- Treg、细胞毒性T细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)和NK细胞,采用ELISA法检测血清中β型转化生长因子(transforming growth factor-β,TGF-β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达水平.从患者外周血单个核细胞中磁珠分选出CD4+CD25+ Treg细胞,混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte culture, MLC)分析其免疫抑制功能.结果 AS活动期患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+ T淋巴细胞的百分比为(4.36±1.21)%,MLC中CD4+CD25+ Treg抑制同种异体T淋巴细胞增殖功能低下,与其Treg分泌TGF-β减少相关,CD4+ Treg含量及功能均低于健康志愿者(P<0.05).AS患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/- Treg水平与TGF-β呈正相关,与TNF-α呈负相关.结论 AS患者外周血中Treg表达水平低,且存在功能缺陷,导致体内诱导免疫耐受机能不足,可能参与AS免疫发病.     

免疫磁珠两步法分离小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞

体外分离CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)并进行初步鉴定.用磁性细胞分离器(MiniMACS)分离CD4+CD25+Treg细胞,流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析细胞纯度和Foxp3蛋白表达,体外检测细胞因子.MACS分离的CD4+CD25+Treg细胞纯度大于90%,细胞存活率大于93%,并且特异性表达Foxp3蛋白,体外能抑制CD4+CD25-Treg分泌IFN-γ,同时CD4+CD25+Treg能分泌抑制性细胞因子TGF-β1、IL-10.结果显示,通过MACS可分离高纯度、高活性的CD4+CD25+Treg细胞.     

妊娠浓度的雌激素对诱导CD4~+CD25~-naive T细胞转化为CD4~+CD25~+Treg细胞的影响

目的 体外观察妊娠浓度的雌激素能否诱导CD4+CD25-naiveT细胞转化为CD+CD25+Treg细胞,并探讨其相关性.方法 以CD4+CD25-T细胞作为反应细胞,实验组加入妊娠水平的雌激素(E2)及CD3/CD28单抗作为刺激原培养72 h,设阴性对照组(仅加入CD3/CD28单抗)和空白对照组.72 h后检测各组中CD4+CD25+T细胞和CD4+Foxp+T细胞比例变化及Foxp3 mRNA表达.结果 1)阴性对照组CD+CD25+T细胞比例较空白对照组显著增高(P＜0.001),而实验组CD4+CD25+T细胞比例进一步升高(P＜0.001).2)阴性对照组不能诱导CD4+Foxp+T细胞比例增高,但实验组CD4+Foxp3+T细胞的比例则较其它2组均显著升高(P＜0.001).3)RT-PCR提示阴性对照组Foxp3 mRNA的表达量较空白对照组无显著差异(P＞0.05);而实验组F0xp3 mRNA的表达昔较其它2组均显著升高(P＜0.001).结论 体外淋巴细胞刺激实验提示妊娠状态下雌激素的高水平与CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例的升高密切相关.     

结核性胸膜炎患者外周血及胸水中CD4~+ CD25~+ CD127~-调节性T细胞表达水平的临床意义

目的:探讨结核性胸膜炎外周血和胸水中CD4+ CD25+ CD127-调节性T细胞表达水平及其临床意义。方法:收集住院收治的初治结核性胸膜炎患者30例和非结核性胸膜炎患者20例,另选择健康体检人员20例为正常对照组。流式细胞术检测外周血及胸水中CD4+ CD25+ CD127-调节性T细胞的百分率。结果:结核性胸膜炎组外周血中CD4+ CD25+ CD127- Treg细胞占CD4+T细胞总数的百分比显著高于正常对照组和非结核性胸膜炎组(P<0.05)。结核性胸膜炎组胸水中CD4+ CD25+ CD127- Treg细胞占CD4+T细胞总数的百分比明显高于非结核性胸膜炎组(P<0.05)。结核性胸膜炎组患者在规则治疗1、3、7、14 d时,外周血和胸水中CD4+ CD25+ CD127- Treg细胞占CD4+T细胞总数的百分比均逐渐下降,外周血中CD4+ CD25+ CD127- Treg细胞占CD4+ T细胞总数的百分比于治疗3 d时显著低于入院时水平(P<0.05),胸水中CD4+ CD25+ CD127- Treg细胞占CD4+ T细胞总数的百分比于治疗7 d时显著低于入院时水平(P<0.05)。结论:CD4+ CD25+ CD127-调节性T细胞参与了结核性胸膜炎的发病机制,且可作为判断肺结核患者的免疫状态、指导用药、疗效观察的指标。     

CD3+、CD4+和CD8+ T细胞Vβ亚家族中PD-1免疫表型检测方法的建立

 目的：建立分析CD3⁺、CD4⁺和CD8⁺ T细胞Vβ亚家族中免疫抑制性受体程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）分子免疫表型的方法,从而了解人体外周血T细胞谱系中PD-1表型细胞的分布频率。方法：收集健康个体（HI）外周血10例,利用抗CD45、CD3、CD4、CD8、PD-1等多色荧光流式单抗,以及T细胞受体（TCR）Vβ谱系试剂盒[IOTest^® Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit,共8管,每一管均为FITC和PE偶联的复合抗体（A~H）,每一管复合抗体包含3个TCR Vβ亚家族的抗体],检测T细胞亚群TCR Vβ亚家族中PD-1的分布情况。结果：在10例HI的检测中,CD3⁺、CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞亚群中检测的24个TCR Vβ亚家族总和符合试剂盒所提供的Quick Reference Card数据,初步结果显示,HI中CD3⁺ T细胞主要优势TCR谱系是Vβ2、Vβ3、Vβ8、Vβ9、Vβ5.1、Vβ13.1和Vβ13.2;而在CD3⁺CD4⁺ T细胞中的优势利用主要集中在Vβ2、Vβ3、Vβ8、Vβ9、Vβ5.1和Vβ13.1;在CD3⁺CD8⁺ T细胞中则主要为Vβ1、Vβ2、Vβ3、Vβ9、Vβ13.1和Vβ13.2等亚家族。进一步分析显示PD-1⁺细胞在HI的CD3⁺、CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞24个TCR Vβ亚家族中均可以检测到,PD-1⁺细胞在T细胞各亚群中分布频率有个体差异,在CD4⁺ T细胞中,以Vβ5.2⁺ T细胞的分布频率较高,而在CD8⁺ T细胞中,以Vβ11⁺和Vβ13.6⁺ T细胞的分布频率较高。结论：本项工作利用健康人样本成功建立了多色荧光流式细胞术检测T细胞亚群TCR Vβ谱系中免疫抑制性受体PD-1分子免疫表型的方法,为进一步应用于分析白血病等病人TCR Vβ谱系的免疫抑制特点提供了新方法。     

新生儿败血症单核细胞CD14+/CD16+表达水平测定及其临床意义

目的探讨新生儿败血症患儿单核细胞CD14     

FL、rIL-6、rIL-6R对脐血CD34+细胞的体外分化增殖作用

目的探讨FL、rIL-6、rIL-6R对CD34+细胞的体外分化增殖作用.方法用磁性细胞分离仪富集人脐血CD34+细胞.加入FL、rIL-6、rIL-6R及其不同组合因子,不同时间取样计数CD34+细胞集落数及细胞数.结果FL、rIL-6、rIL-6R扩增细胞形成集落的主要成分为CFU-GM,但在rIL-6+rIL-6R及FL+rIL-6+rIL-6R作用下,也可形成一定数量的BFU-E及CFU-M,而CFU-MK则未见形成.FL+rIL-6+rIL-6R可刺激红细胞生成.可使CD34+细胞总数在第7天时扩增6.4倍.结论FL+rIL-6+rIL-6R可扩增脐血CD34+细胞数量并可促进其分化.     

HIV/AIDS与肝炎病毒感染者CD4+、CD8+淋巴细胞数的比较

目的探讨HIV携带者或AIDS病人(简称HIV/AIDS)与肝炎病毒感染者的CD4     

原发性肝癌患者CTCs与CD4~+/CD8~+、NLR、TTV及肿瘤分期的相关性研究

目的:探讨原发性肝癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs)与T细胞亚群CD4~+/CD8~+比值、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、肿瘤总体积(TTV)及肿瘤分期的关系。方法:收集80例原发性肝癌患者外周血,采用益善生物技术公司使用的"免疫去除结合纳米过滤法"Can PatrolTM行CTCs检测。同时使用流式细胞术检测外周血中CD4+T细胞和CD8~+T细胞数量;收集患者外周血中性粒细胞数、淋巴细胞数、肿瘤最大直径及肿瘤分期等临床病理参数。计算出外周血CD4~+/CD8~+比值、NLR及TTV。根据CD4~+/CD8~+平均值及TTV、NLR中位数将CD4+/CD8+比值、TTV和NLR分为高、低2组;根据肝癌第7版TMN分期标准将患者分为I+II期和III+IV期2组。分别比较CTCs在2组中的差别。结果:高CD4~+/CD8~+比值组外周血CTCs数及间质型CTCs数明显低于低CD4~+/CD8~+比值组(P0.05)。高TTV组外周血的CTCs数、间质型CTCs数及混合型CTCs数明显高于低TTV组(P0.05);肿瘤分期I、II期组外周血的CTCs数、间质型CTCs数及混合型CTCs数明显低于III、IV期组(P0.05)。高NLR组与低NLR组外周血的CTCs数、间质型CTCs数、混合型CTCs数和上皮型CTCs数间的差异无统计学显著性。结论:原发性肝癌患者外周血中存在CTCs;外周血CTCs与T细胞免疫、TTV及肿瘤分期有显著相关:T细胞免疫越差、TTV越大及肿瘤分期越晚,外周血的CTCs越多。     

Stage-specific changes in fetal thymocyte proliferation during the CD4-8- to CD4+8+ transition in wild type, Rag1-/-, and Hoxa3,Pax1 mutant mice

Background  

The function of the thymic microenvironment is to promote thymocyte maturation, in part via regulation of thymocyte proliferation and cell death. Defects in fetal thymic epithelial cell (TEC) development and function, and therefore in the formation of a functional microenvironment, can be caused either directly by TEC differentiation defects or indirectly by defective thymocyte maturation. In this paper we studied fetal thymocyte proliferation during the early transition from the CD3^-4^-8^- (triple negative, TN) to CD4⁺8⁺ (double positive, DP) stages. We compared wild type mice with Rag1 ^-/- mice and with Hoxa3 ^+/- Pax1 ^-/- compound mutant mice, which have blocks at different stages of thymocyte development.     

大鼠下丘脑神经元L-型Ca通道特性与Ba浓度关系的研究

目的:研究不同浓度Ba²⁺情况下,新生大鼠下丘脑神经元L-型Ca²⁺通道单通道特性。方法:采用神经元的急性分离技术;用膜片钳细胞贴附式记录方式进行研究。结果:110mmol/LBa²⁺为载流子与10mmol/LBa²⁺为载流子时,单通道活动不同、电导不同,分别为28.6pS和19.1pS,平均开放概率也明显不同。结论:L-型Ca²⁺通道单通道电导、平均开放概率、激活与失活等电生理特性存在明显的Ba²⁺浓度依赖性。     

糖皮质激素对体外中央记忆性CD8~+ T淋巴细胞的诱导分化作用

目的:以糖皮质激素对人CD8~+ T淋巴细胞的诱导作用为线索,探究其对体外CD8~+ 中央记忆性T淋巴细胞(central memory T cells,T_(CM))的诱导分化作用,以期为CD8~+ T_(CM)过继性免疫疗法提供新的扩增方案。方法:通过密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞,经磁珠和流式细胞术分选出初始CD8~+ T细胞,将细胞使用细胞因子激活之后分为对照组和实验组,在实验组中加入不同浓度的2种糖皮质激素(醋酸可的松和氢化可的松),进行体外培养,最后通过流式细胞术检测2组细胞中CD8~+ T_(CM)的诱导分化情况,并通过CFSE染色判断细胞增殖情况,通过早期凋亡试剂Annexin V染色判断药物本身对CD8~+ T细胞的毒性作用。结果:浓度梯度实验发现,1μmol/L醋酸可的松对CD8~+ T_(CM)表现出良好的诱导效果,氢化可的松在0.5μmol/L的诱导效果较好。分别在体外培养的第3天和第6天,CFSE染色法检测细胞的增殖情况,经统计学分析发现实验组和对照组之间的差异无统计学显著性,表明糖皮质激素不影响细胞的自然增殖。Annexin V染色法表明,这2种药物无显著的促进凋亡作用,对淋巴细胞毒性小。结论:糖皮质激素在体外对人CD8~+ T_(CM)具有良好的诱导作用。这为改善过继免疫治疗中T_(CM)的体外扩增提供新的参考方法,并且在理论上加深对糖皮质激素生物学功能的理解。     

EP_2A体外可促进人CD34~+细胞归巢而不能促进其增殖

目的:探讨前列腺素E_2受体2激动剂(EP_2A)在体外对人CD34~+细胞的归巢与增殖作用。方法:收集健康供者经粒细胞集落刺激因子动员后的外周血,免疫磁珠法分选出人CD34~+细胞;同时收集健康供者动员前骨髓液,分离单个核细胞,并行骨髓间充质干细胞(BMMSC)培养。人CD34~+细胞和BMMSC经前列腺素E_2(阳性对照)、DMSO(阴性对照)、EP_2A和EP_2A+前列腺素E_2受体2拮抗剂(EP_2AA)处理后,对人CD34~+细胞用CCK-8法检测细胞活力,集落形成实验检测集落形成数目,流式细胞术检测G_2/M期细胞比例,Western blot检测细胞中survivin、β-catenin及CXC趋化因子受体4(CXCR4)的蛋白表达;ELISA法检测BMMSC中基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)的含量。结果:EP_2A组与阴性对照组相比,人CD34~+细胞在细胞活力、集落形成数目、G_2/M期比例及survivin和β-catenin蛋白表达方面均无明显差别。但EP_2A组人CD34~+细胞CXCR4及BMMSC SDF-1α的表达均明显高于阴性对照组。结论:EP_2A体外可促进人CD34~+细胞归巢但不能促进其增殖。     

CD8^＋细胞免疫亲合柱的研制及条件探讨

目的：建立一种利用免疫亲合柱纯化细胞的方法。方法：将亲合素交联于聚丙烯酰胺凝胶Ｂｉｏ－Ｇｅｌ上,制成免疫亲合柱;将外周血单个核细胞与生物素化抗ＣＤ８单克隆抗体作用后、加到该免疫亲合柱上进行纯化,ＣＤ８＾＋细胞即吸附于柱上,洗去其他细胞后,得到纯化后的ＣＤ８＾＋细胞。结果：纯化后ＣＤ８＾＋细胞纯度达５６％－７１％,细胞回收率为３９％－６６％,台盼蓝染色法显示活细胞达９８％。