河北九莲城淖尔可培养放线菌多样性及抗菌活性筛选

【目的】勘探干涸的九莲城淖尔土壤放线菌多样性并进行活性筛选,以期发现药用微生物资源,为新抗生素的发现奠定基础。【方法】采用15种分离培养基,以稀释涂布法分离放线菌;根据分离菌株的16S rRNA基因序列同源性分析放线菌多样性;发酵液经乙酸乙酯萃取,菌丝体经丙酮浸提,获得提取浓缩物样品;样品通过纸片扩散法进行抗菌活性初筛;抗菌阳性菌株采用PCR技术进行Ⅰ型聚酮合酶(PKS I)KS域、Ⅱ型聚酮合酶(PKS II)KS域和非核糖体多肽合成酶(NRPS)A结构域抗生素生物合成基因的检测。【结果】从11份盐湖土壤样品中分离纯化到251株放线菌,其分布于放线菌纲的10个目15个科31个属,其中优势菌属为链霉菌属和拟诺卡氏菌属;251株放线菌中包括57株耐(嗜)盐放线菌,其优势菌属为拟诺卡氏菌属(22株)和涅斯捷连科氏菌属(15株)。基于16S r RNA基因序列的系统发育分析显示,菌株J11Y309为糖霉菌科潜在新属,菌株J12GA03为分枝杆菌科潜在新种。96株放线菌活性检测结果显示,56株至少对1株检定菌具有抗菌活性,阳性率为58.3%;56株有活性的放线菌中,47株至少含有1种抗生素生物合成基因,其中17株同时具有3种抗生素生物合成基因。【结论】干涸的九莲城淖尔土壤中含有较为丰富的药用放线菌资源,具有从中发现放线菌新物种和新抗生素的潜力。     

广西北部湾茅尾海红树林生境放线菌分离培养基的比较

【背景】红树林生境拥有丰富的微生物资源,分离获得更多的纯培养放线菌为新型抗生素的发现提供菌种资源。【目的】使用新型放线菌分离培养基,发掘广西北部湾茅尾海红树林生境放线菌资源,评估新型放线菌分离培养基分离效果。【方法】设计出新型放线菌分离培养基——椰子汁-海藻糖培养基,对广西北部湾茅尾海红树林根际土壤和红树林根皮放线菌进行分离。基于分子生物学鉴定方法,对获得的纯培养放线菌进行多样性分析。【结果】从红树林根际土壤样品中分离获得65株放线菌,分布在5个目10个科15个属,使用YIM171培养基分离到7个属,MA培养基分离到5个属,椰子汁-海藻糖培养基分离到11个属,其中包括4株潜在新种;从红树林根皮样品中分离获得19株放线菌,分布在4个目7个科10个属,使用YIM171和椰子汁-海藻糖培养基分别分离到7个属,包括4株潜在新种;使用椰子汁-海藻糖培养基在红树林生境两类样品中获得3株潜在新种。【结论】广西北部湾茅尾海红树林根际土壤和根皮中放线菌多样性丰富,使用椰子汁-海藻糖培养基分离放线菌效果较佳,可用作放线菌的分离培养基。     

青藏高原阿里、那曲和海西地区土壤可培养放线菌的多样性

【目的】为了研究青藏高原北部地区土壤可培养放线菌的多样性,并比较不同选择性分离培养基对高原土壤放线菌的分离效果。【方法】使用9种分离培养基,并尝试添加藤黄微球菌发酵液,对采集自阿里、那曲和海西地区的14份土壤样品中的放线菌进行选择性分离。通过16S r RNA基因序列分析对分离菌株进行初步分类鉴定,并在不同分类水平上统计所分离得到的放线菌多样性。【结果】分离得到去重复后的放线菌255株,分布于放线菌门的8个目,14个科,23个属,包含94个可能的物种。其中至少25个物种可能为新种,分布于13个属。链霉菌属的菌株108株,可能的物种28个,是最主要的优势菌属。分离培养基中添加藤黄微球菌发酵液明显增加了放线菌分离菌株的数量和多样性,稀释的葡萄糖酵母麦芽汁培养基适合分离链霉菌,淀粉甘油脯氨酸培养基、丙酸钠酪蛋白培养基等则适合分离稀有放线菌。【结论】青藏高原北部土壤放线菌多样性非常丰富,并且存在较多的新颖放线菌类群;添加藤黄微球菌发酵液是提高放线菌分离效率的有效手段。     

山东半岛农药污染点源放线菌多样性及抑菌活性

【目的】探究山东半岛农药污染点源放线菌多样性及非链霉菌抑菌活性,试图发现新放线菌和新抗生素。【方法】通过16S rDNA序列对已分离得到的154株纯培养放线菌进行初步分类鉴定并进行系统发育分析;采用管碟法和菌丝生长速率法检测10株非链霉菌的抑菌活性。【结果】154株放线菌覆盖7个科,8个属,有一株非链霉菌(205)可能为潜在的新种。10株非链霉菌的发酵液均对供试的植物病原真菌和细菌有不同程度的抑制作用,尤其是菌株Microbacterium oxydans JN853773和Kocuria rosea JN192402对所有供试病原菌都有强烈的抑制作用。【结论】农药污染点源可以作为开发新型抗生素产生菌的重要来源。     

嗜酸丝状放线菌的选择性分离与多样性

摘要:【目的】针对酸性土壤中的嗜酸丝状放线菌,建立有效的选择性分离方法,并了解其多样性。【方法】用不同的样品预处理方式和分离培养基,并添加不同的抑制剂进行分离;根据放线菌的菌落数和出菌率确定最佳分离方法组合。采用最佳分离方法对从江西采集的17份酸性土壤样品进行分离;根据培养特征对分离菌株进行分群,进一步通过对各类群的显微形态观察和pH梯度生长实验确定代表菌株;对代表菌株进行16S rRNA基因序列分析研究其多样性。【结果】嗜酸丝状放线菌的最佳分离方法为：土壤样品经分散差速离心预处理后,涂布添加了放线菌酮、制霉菌素和萘啶酮酸（各50 mg/L）的GTV培养基。用此方法共分离到放线菌369株,归为10个不同的颜色类群,其中6.6%为严格嗜酸放线菌,72.4%为中度嗜酸放线菌,21.0%为耐酸放线菌。52株嗜酸放线菌代表菌株分布于放线菌目中的12个属：链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora) 、诺卡氏菌属(Nocardia)、野野村菌属(Nonomuraea) 、韩国生工属(Kribbella) 、小双孢菌属(Microbispora)、马杜拉菌属(Actinomadura)、拟无枝菌酸菌属(Amycolatopsis)、指孢囊菌属(Dactylosporangium)、伦茨氏菌属(Lentzea)、游动四孢菌属(Planotetraspora) 和链嗜酸菌属(Streptacidiphilus),其中链霉菌分离菌株在系统发育树上形成12个不同的进化类群。【结论】所建立的选择性分离方法可用于土壤嗜酸丝状放线菌的高效分离;江西酸性土壤含有丰富多样的嗜酸丝状放线菌种属。     

波罗的海放线菌的多样性

摘要:【目的】为了探索海洋放线菌的多样性,为发现新的药物先导化合物提供新菌源,我们分析了波罗的海的放线菌多样性及生物活性。【方法】采集100 份底泥样品,用7 种培养基分离放线菌809 株;去掉相同菌株后,选择280 株代表菌进行了初步分类鉴定;采用琼脂扩散法,检测了它们对5 种细菌、真菌的抗菌活性;用API ZYM system 测定了21 种酶的活性。【结果】用海藻糖-脯氨酸培养基和HV 培养基分离的放线菌中,稀有放线菌占60% 和63% ;波罗的海的放线菌有15 个属,其中3 个属是首次从海洋中分离     

微波处理对嗜碱和嗜盐海洋放线菌分离效果的影响

【目的】研究微波处理对于分离嗜碱和嗜盐海洋放线菌的效果。【方法】用微波处理7份海泥样品,梯度稀释后涂布于3种分离培养基,分离具有嗜碱和嗜盐特性的海洋放线菌。【结果】微波处理后的7份样品中,4份样品中嗜碱海洋稀有放线菌和3份样品的嗜盐海洋稀有放线菌数量极显著提高;7份样品中的嗜碱、嗜盐海洋小单孢菌属、游动放线菌属、诺卡氏菌属等稀有放线菌数量均有显著增加,不同样品中新分离到链孢菌属、小双孢菌属、链孢囊菌属及其他未鉴定的海洋稀有放线菌,分离到属的数量提高了1-4个。【结论】微波处理不仅显著提高嗜碱和嗜盐海洋放线菌的分离数量,而且明显增加了海洋稀有放线菌的分离种类。     

西藏林芝土壤放线菌抗肿瘤活性菌的筛选及鉴定

【目的】筛选并鉴定西藏林芝八一镇土壤中产生抗肿瘤活性物质的放线菌。【方法】用平板稀释法分离放线菌, 用MTT法和纸碟法对放线菌发酵产物进行体外抗肿瘤与抑菌活性检测, 并用多相分类技术对抗肿瘤活性菌株进行鉴定。【结果】共分离出29株放线菌, 得到6个抑制体外肿瘤细胞增殖的活性菌株(20.7%), 同时它们也具有抑菌活性, 其中4株菌的检测样品对Hela细胞的抑制率达80%以上。多相分类研究表明, 6个活性菌株分别隶属于链霉菌属(Streptomyces)的3个已知物种的变种。【结论】林芝八一镇土壤放线菌中蕴藏抗肿瘤活性链霉菌, 是一个潜在的抗肿瘤药用微生物资源。     

西藏湖泊放线菌的分离鉴定及抗菌活性测定

勘探西藏湖泊沉积物样品中放线菌资源并进行抗菌活性研究,以期发现可以产生新颖活性物质的药用放线菌资源。采用4种分离培养基,以稀释涂布法对西藏地区7个湖泊沉积物样品中的放线菌进行分离,通过分离菌株16S rRNA基因序列分析确定种属分类。采用纸片扩散法进行体外抗菌活性测定,以感染病原菌的秀丽隐杆线虫模型进行体内抗菌活性测定。结果显示,分离获得73株放线菌,分属于4个目5个科8个属,其中链霉菌属和小单孢菌属为优势菌属。至少对一种检定菌表现为阳性的菌株有55株,阳性率为75.3%。8株放线菌具有线虫体内抗菌活性,其中菌株PF188的体内外抗菌活性较好,其16S rRNA基因序列与最近有效菌株Nonomuraea guangzhouensis NEAU-ZJ3~T的相似度为98.13%,为Nonomuraea属潜在新种。西藏湖泊沉积物含有丰富的放线菌资源,是新抗生素发现的潜在药源。     

硝尔库勒湖可培养放线菌多样性及其功能酶和抗细菌活性

【目的】认识和了解硝尔库勒湖可培养放线菌的多样性、功能酶和抗细菌活性特点,为今后的开发和利用奠定基础。【方法】应用可培养技术和基于16S r RNA基因序列的系统发育分析硝尔库勒盐湖沉积物中放线菌的多样性。常规方法检测样品成分因子,并筛选了嗜盐放线菌的蛋白酶、淀粉酶和酯酶活性;抑菌圈法检测放线菌新种的抗细菌活性。【结果】分离获得了51个OTUs,分属于24个不同的属,其中15个OTUs代表了放线菌新种;链霉菌属是优势菌属,占全部分离菌株数量的16.25%。硝尔库勒湖放线菌类群数量一定程度上受样品成分因子的协同影响。代表新种的菌株展示了良好的功能酶活性和抗细菌活性,其中代表链霉菌新种的菌株XHU5011不仅具有多种酶活性,而且具有强大的抗金黄葡萄球菌、耻垢分枝杆菌和荧光假单胞菌的能力,具有很好的开发潜能。【结论】硝尔库勒盐湖中存在丰富的可培养放线菌多样性,潜藏着大量的放线菌新资源,并且具有很好的功能酶和天然产物挖掘潜力。     

来自西双版纳3种有毒植物的免培养与纯培养放线菌多样性及生物活性

【背景】由于土壤放线菌中获得新化合物日益困难,抗生素滥用使致病菌耐药性不断增加,人们转向研究植物内生放线菌以期发现新化合物。【目的】探究西双版纳热带雨林有毒植物内生放线菌的多样性,为开发新药提供具有潜在生物活性的菌株。【方法】通过Illumina Hi Seq高通量测序和纯培养方法分析箭毒木、八角枫、马缨丹3种有毒植物的内生放线菌群落结构组成,利用纸片扩散法筛选抑菌活性,通过PCR扩增检测7类化合物合成基因。【结果】高通量测序的多样性分析和群落结构分析得出:3种有毒植物在门分类水平检测出古菌域的2个门、细菌域的18个门和暂定的Rsa HF231、WD272门;在属分类水平检测出30个属的放线菌,八角枫和马缨丹的微生物群落结构比箭毒木更丰富。纯培养分离获得11个属34株菌,分离自箭毒木的菌株比八角枫和马缨丹的菌株更多,而且大多数高通量检测出的菌种不能通过纯培养获得。抑菌活性检测结果显示:抗菌活性作用明显的菌株以链霉菌属为主。链霉菌属的NRPS和PKS基因的检出率明显高于其他化合物合成基因。【结论】有毒植物内生放线菌多样性非常丰富。有毒植物内生放线菌具有合成次生代谢产物的潜力,可以为生物农药及抗生素开发提供丰富的菌种资源。     

川滇四区森林土壤纯培养放线菌多样性及生物活性

【目的】为了从放线菌发现新的药物先导化合物,研究了川滇4个地区的放线菌多样性及其生物活性。【方法】采集250份土样,用4种培养基分离放线菌;从中选择98株代表菌进行了初步分类鉴定;采用琼脂扩散法,检测了169株放线菌对4种细菌和7种真菌的抑菌活性;利用特异性引物扩增法,测定了它们产生的聚酮合酶(PKSI、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和多烯类化合物合成酶(CYP)基因。【结果】黄荆老林的放线菌有13个属,峨眉山、青城山仅5个属,九寨沟9个属,西双版纳达20个属;不同地区的放线菌具有抗菌活性的菌株平均约占10%;有27%-36%的菌株产生PKSI、II、NRPS、CPY化合物合成基因。【结论】在采集样品的地区中,人类干扰越少,放线菌的多样性越高。分离放线菌时,使用"极端"条件,虽然分离到的放线菌数量可能不多,但获得未知菌的比例较大。添加抑制剂可减少革兰氏阴性细菌和真菌,有利于分离放线菌。     

超声波处理土样分离放线菌

【目的】探索超声波处理土壤悬液,增加稀有放线菌的类群。【方法】将西双版纳热带雨林的混合土样,制成土壤悬液,用超声波分别处理0-120s,用平板稀释法分离放线菌,得到纯菌落后测定其16S rRNA基因序列,进行系统发育分析,将分离菌株鉴定到属;用超声波处理已经鉴定到种且常见的10种链霉菌0-5min,后进行培养,测定其存活率。【结果】土壤悬液经超声波处理不同时间,放线菌的数量和种类逐渐增加。超声波处理已知链霉菌1-5min,对链霉菌的数量没有明显影响。【结论】用超声波处理土壤悬液40s,可以大大增加放线菌的出菌总数,明显增加稀有放线菌的种类,是一种经济且简便易行的方法。     

百部内生放线菌的分离、分类及次级代谢潜力

【目的】以对叶百部块根为材料分离内生放线菌,并对分离菌株进行分类、抗菌活性和次级代谢产物合成基因研究。【方法】样品经过严格的表面消毒,选用4种培养基分离百部内生放线菌;分离菌株通过形态观察和16S rRNA序列分析进行分类鉴定;采用琼脂移块法测试分离菌株的抗菌活性;通过PCR检测分离菌株的PKS/NPRS和卤化酶基因;使用HPLC-UV/VIS-ESI-MS/MS分析发酵产物。【结果】从6个样品中获得18株内生放线菌,分属链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和甲基杆菌属(Methylobacterium)。分离菌株绝大部分具有抗菌活性和次级代谢产物合成基因,其中13株对耐药金黄色葡萄球菌和/或绿脓杆菌有拮抗活性,17株具有PKS/NRPS基因,8株菌具有卤化酶基因,且卤化酶阳性代表菌株的发酵产物具有抗细菌活性和卤代化合物特征。【结论】百部作为一种传统中药,其内生放线菌以链霉菌和小单孢菌为主,在次级代谢产物合成方面具有很好的潜力,可作为一类重要微生物资源进行活性产物开发。     

武陵山放线菌多样性

[目的]为了探究武陵山放线菌多样性,以便从新放线菌菌株中发现新的潜在药物先导化合物.[方法]从武陵山采集280份土样,采用纯培养的方法,用4种培养基分离到1134株放线菌.选择其中30株代表菌进行了初步分类鉴定;以3株细菌和7株农作物致病真菌作为指示菌,检测其抑菌活性;利用特异性引物扩增的方法,检测是否具有聚酮合酶(PKS Ⅰ、PKSⅡ)基因、非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因和多烯类化合物合成酶(CYP)基因.[结果]分离到的武陵山放线菌中,链霉菌占70%以上,还有小单孢菌等8个科13个属,其中有5个菌株是潜在的新种.选取的30株实验菌对细菌、真菌有不同程度的抗菌活性;其中含有4类化合物合成基因的菌株占23%～60%.[结论]武陵山原始森林土壤中,放线菌多样性很丰富,且存在很多未开发的稀有类群.有抑菌活性的菌株,可用于进一步的药物开发利用.     

宁夏贺兰山东麓荒漠草原区地衣的物种多样性研究

地衣是宁夏贺兰山东麓荒漠草原区一类重要的生物资源,地衣结皮的形成为该区域景观的稳定作出了重要的贡献。该研究于2014~2019年在贺兰山东麓荒漠草原区开展了地衣的野外调查,利用表型特征和DNA序列分析且对采集的500余份标本进行了物种的鉴定,并分析了其物种组成及地理成分。结果显示：(1)共鉴定地衣19科41属74种,其中中国新记录25种,新种2个(待发表),新记录属11个,宁夏新记录56种。(2)研究区地衣物种区系地理成分以北温带成分为主(33.78%),其他主要区系成分包括欧亚成分和世界广布成分等,具有明显的北温带成分区系特征。(3)研究区地衣以壳状和鳞状地衣为主(81.1%),生长型体现了地衣对当地气候条件的适应特性。实地调查发现宁夏贺兰山东麓荒漠草原区地衣的生存环境非常脆弱。该研究结果有助于提高对该区域地衣物种多样性的认识并促进其保护。     

中国东海和南海海域可培养烃类降解细菌的筛选及功能

【背景】海洋环境中蕴藏着丰富的微生物资源,其种类繁多而且功能多样,在驱动物质循环及能量流动等方面起着重要的作用。目前,海洋中烷烃化合物降解菌的分离筛选和降解功能研究已有文献报道;但是对海洋中尤其是我国东海和南海海域,具有降解芳香烃类化合物功能的菌株分离筛选及其多样性研究鲜有报道。【目的】分离筛选我国东海和南海海域具有烃类降解能力的可培养菌株,并对其降解功能和多样性进行初步研究。【方法】分别从东海和南海海底沉积物样品中筛选菌株,选择不同的烃类化合物为菌株筛选的唯一碳源,采用梯度稀释和平板划线法分离纯化得到单菌落,并利用相应烃类为唯一碳源进行生长验证获得该化合物降解菌。【结果】以肉桂酸、碱木素、十六烷等12种烃类化合物为唯一碳源,从样品中共分离到63株具有烃类化合物降解能力的菌株,分别属于3个门4个纲8个目10个属,主要为红球菌属(Rhodococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、弧菌属(Vibrio)、盐单胞菌属(Halomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)。两大海域优势降解菌差别较大,其中东海沉积物降解菌株主要为不动杆菌属(Acinetobacter),而南海沉积物降解菌株主要为红球菌属(Rhodococcus)。【结论】我国东海和南海海域蕴藏着丰富的烃类化合物降解菌株资源,两大海域优势降解菌种类存在明显差异,这将为我国未来可能的海洋环境石油污染的微生物治理储备菌种资源。     

中华蜂体内放线菌的分离、多样性及抗菌活性研究

【目的】探索药用昆虫中华蜂(Apis cerana cerana Fabricius)体内可培养放线菌的分离方法,研究其物种多样性及抗菌活性,挖掘更多微生物资源。【方法】选用7种分离培养基对中华蜂样品体内放线菌进行分离;通过采用16S rRNA PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析方法研究其多样性;选用4种致病菌对菌株进行抗菌活性初探。【结果】共分离得到180株放线菌,根据菌落的形态和细胞特征观察结果,从中选取84株作为代表菌株,其分属于3个目、4个科中的4个属,其中6株为潜在新种;最适的表面消毒方法:浓度为0.2%的Cl O2(二氧化氯)作为消毒剂,作用60 s;拮抗实验显示,31.0%、48.8%、27.4%、16.7%的代表菌株分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、玉米弯孢病菌、西瓜枯萎病菌有不同程度的抗菌活性,71.4%的代表菌株对至少一种病原菌有拮抗作用。【结论】分离方法的选择对昆虫体内放线菌的分离效果影响较大;中华蜂体内放线菌具有丰富的多样性,展现出很好的抗菌活性,表明其在发现新型生物活性物质中具有很大的潜力。