高密度发酵产酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPA

为了提高酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)的表达量和酶活,使之更高效地催化合成左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine,L-DOPA),在摇瓶优化的基础上,研究了溶氧控制策略、补料策略、诱导温度和诱导策略对菌体生长、TPL酶活和L-DOPA产量的影响。结果表明,在5 L发酵罐中25℃诱导条件下,采用DOstat补料策略控制罐内溶氧的体积分数为20%,菌体浓度、TPL酶活和催化合成L-DOPA产量较分批培养分别提高了17. 9%、57. 7%和27. 8%。诱导后控制溶氧体积分数在40%相比于20%更利于TPL的表达,酶活相比于20%的DO的提高了33. 8%。通过优化起始诱导时间,在菌体生长的对数前期(OD_(600)=7)诱导,细胞浓度提高到51. 2 g/L,酶活提高到2. 43 U/mL,L-DOPA产量为56. 58 g/L,较分批培养分别提高了64. 1%、170%和209. 2%。初步实现了重组大肠杆菌高密度培养生产TPL,为L-DOPA产业化研究奠定了基础。     

L-氨基酸氧化酶的诱导表达及生物催化合成5-氨基戊酸的研究

L-氨基酸氧化酶可以催化L-氨基酸生成酮酸等化学品,具有重要的应用前景。本研究成功将来源于红球菌(Rhodococcus opacus)的氨基酸氧化酶在大肠杆菌中表达,并首次用于生物催化合成5-氨基戊酸。结果表明:L-氨基酸氧化酶诱导表达最适温度为25℃,最适诱导剂浓度0.5 mmol/L,最适诱导时间为7 h,诱导时最佳细胞量为0.246 g/L。催化合成5-氨基戊酸时,最适底物L-赖氨酸(Lys)浓度17 mmol/L,最适p H为7.0,最适温度为37℃,最适时间为24 h,最适补加0.5%H_2O_2,添加酶与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的最适摩尔比为1∶1,最终5-氨基戊酸产量达到16.71 mmol/L。本研究成功的实现了单酶(LAAO)合成5-氨基戊酸,为简便生物合成5-氨基戊酸奠定基础。     

D-来苏糖异构酶的酶学性质研究

为探索D-甘露糖的高效酶法合成途径,作者克隆了来源于Peptococcaceae bacterium 1109的D-来苏糖异构酶基因,将其导入到E. coli BL21(DE3)中进行表达。该酶的最适底物为D-来苏糖,并可以高效催化D-果糖与D-甘露糖之间的差向异构反应。以D-果糖为底物时,重组表达的D-来苏糖异构酶的比酶活可达2.5 U/mg,该酶的最适pH为7.5,最适温度为70℃,Co~(2+)可以显著提高该酶的活力。在最适条件下以500 g/L的果糖为底物,反应8 h达到平衡,平衡转化率达19.17%,生产D-甘露糖95.85 g/L。     

合成己酸乙酯酯化酶产生菌的鉴定及产酶条件优化

筛选到1株浓香型酒曲来源且己酸乙酯酯化性能较强的红曲霉并进行菌种鉴定。在形态学鉴定的基础上,通过ITS序列和β-微管蛋白基因序列构建系统发育树,初步鉴定为紫色红曲霉,编号为YJX-8。研究菌株YJX-8最佳产酯化酶条件及酯化酶底物特异性,结果表明,其最适液态培养基组分是:蔗糖90 g/L、黄豆饼粉25g/L、MgSO_41 g/L、NaH_2PO_41 g/L;最适培养条件是:pH 4.5、30℃、180 r/min、6 d;在最优条件下,酯化酶酶活达到(1.177±0.009) U/mL,酶活提高4.56倍。红曲霉酯化酶对己酸具有很强的选择性。     

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量和活力,对高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM109进行培养,优化了发酵培养基成分、培养条件以及发酵工艺,结果表明,最佳葡萄糖浓度为20 g/L,碳氮比为7.86,添加5 g/L酵母粉和蛋白胨有利于菌体产酶,最佳发酵液初始pH为7.5,接种量为10 %.通过以上优化,重组大肠杆菌培养18 h时酶活可达到70 U/g(DCW),酶活比原工艺提高了1.6倍.     

重组短小芽孢杆菌CotA漆酶的酶学性质及发酵优化研究

细菌漆酶具有良好的热稳定性和抗碱性环境能力,在工业废水处理和染料脱色方面具有很大的潜力。通过研究短小芽孢杆菌W3菌株的CotA漆酶基因在大肠杆菌中重组表达的酶学性质,对其发酵培养基进行优化,以提高产量。利用分子手段实现CotA漆酶基因在大肠杆菌中的重组表达,并利用BP神经网络建模和萤火虫算法寻优对CotA漆酶发酵培养基进行优化,最后重组表达的CotA漆酶进行染料脱色研究。结果表明,重组菌株表达的CotA漆酶具有良好的热稳定性和耐碱能力,最适反应pH值为3.5,最适反应温度为80 ℃。重组CotA漆酶对底物ABTS具有良好的亲和能力,Km为0.247 mmol/L,Kcat为41.32 s ^-1。在适宜条件下的重组CotA漆酶的表达量为1 915.3 U/L,使用BP神经网络和萤火虫算法优化培养基获得最佳的发酵培养基配方为：蛋白胨1.16 g/dL、酵母粉0.428 g/dL、NaCl 1.06 g/dL、CuSO ₄ 0.274 mol/L和甘油（体积分数）0.931%。优化过的培养基产CotA漆酶酶活为3 088.68 U/L,相比未优化之前提高了61.26%。重组表达的CotA漆酶对孔雀石绿和酸性蓝129脱色效果明显,达到90%脱色率。短小芽孢杆菌W3来源的CotA漆酶具有良好的酶学性质和工业应用前景。利用BP神经网络偶联萤火虫算法寻优是CotA漆酶发酵培养基优化的有效手段。     

粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

木聚糖酶融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

以来源于Aspergillus usamii E001的高比活木聚糖酶XynⅡ为亲本,采用"中心模板法"将耐高温木聚糖酶TfxA的前31个氨基酸连接在XynⅡ的N端,构建出融合木聚糖酶TPL。将TPL在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行表达,并对表达条件进行了优化,对表达产物的酶学性质进行了分析。结果表明,融合酶TPL最适pH为4.6,最适温度为45℃,和XynⅡ保持一致,但热稳定性有一定提高,在50℃处理10min,TPL和XynⅡ的残余酶活分别为15.72%和6.92%。     

一株产胶原蛋白酶细菌的鉴定及产酶条件优化

采用形态学特征、生理生化特征结合16S rDNA对一株产胞外胶原蛋白酶的菌株AL-13进行鉴定。获得安全、高效、高产量的生产胶原蛋白酶工艺。以胶原蛋白酶活性为指标,采用单因素实验优化温度、pH、接种量等产酶培养条件后,利用单因素结合响应曲面法优化产酶培养基。结果表明,AL-13鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),最适产酶培养条件为:培养时间48 h、培养温度25 ℃、初始pH8.0、接种量6%(v/v),最适产酶培养基为:葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化钙0.17 g/L、磷酸氢二钾2.08 g/L、氯化钠9.48 g/L,在该产酶条件下胶原蛋白酶活力预测值为154.89 U/mL,验证结果显示酶活为(153.06±3.73) U/mL,此结果与预测值接近,相对误差为0.04%。本实验成功优化了一株产胶原蛋白酶细菌的产酶条件,产酶条件优化后的酶活(153.06 U/mL)较优化前(16.14 U/mL)提高了9.5倍。     

纳米磁性微粒固定化脂肪氧合酶的制备及其酶活研究

采用纳米磁性四氧化三铁固定脂肪氧合酶,考察不同因素对游离酶和固定化脂肪氧合酶酶活的影响。结果表明:电镜观察微粒呈黑色短棒状粒子,固定在载体上酶的含量约为6.0%;游离酶与固定化脂肪氧合酶的最适温度均为30℃,游离酶最适p H为8.0,而固定化酶的最适p H为9.0,当双氧水的浓度分别达到14 g/L和8 g/L时,游离酶和固定化酶的活性分别达到最强;最适条件下,游离酶的酶活为3.95×105U/m L,固定化酶的酶活为9.40×105U/g。     

谷氨酸棒杆菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表达及固定化

对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)来源的谷氨酰胺合成酶进行腺苷酰化位点定点突变,并在大肠杆菌中进行异源表达,得到的重组酶活为6.215 U/mg。分离纯化重组突变酶后,对其固定化条件及固定化酶的性质进行研究。结果得到固定化条件为:以LX-1000EP树脂作为固定载体,载体量0.176 g/U、p H值8.0、温度30℃、吸附时间16 h。固定化酶活力达到3.658 U/g,酶活回收率达到67.17%。重组酶固定化后,反应最适温度没有变化,最适p H略向碱性偏移,储藏稳定性提高,转化谷氨酸生产谷氨酰胺的水平与游离酶相当,对50 mmol/L谷氨酸的转化率为92.83%,为酶法生产谷氨酰胺后续研究提供了参考。     

毛酸浆多酚氧化酶的酶学特性研究

以毛酸浆中多酚氧化酶(PPO)为研究对象,采用分光光度法在420nm处对其酶学特性进行研究。结果表明,毛酸浆PPO的底物邻苯二酚的最适质量分数为0.04%;最适pH为7.0;最适温度为35℃;100℃处理2min,可使酶完全失活;PPO催化的酶促褐变反应动力学符合米氏方程,动力学参数为Km=0.025mol/L,Vmax=125U/min;抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸和亚硫酸钠对PPO酶活性的抑制作用均随浓度的增大而加强,抑制能力由强到弱依次为:抗坏血酸柠檬酸L-半胱氨酸EDTA亚硫酸氢钠。     

粘红酵母苯丙氨酸解氨酶合成条件优化

首先利用Plackett-Burman设计及最陡爬坡试验对在摇瓶中对粘红酵母合成苯丙氨酸解氨酶的培养基和培养条件进行优化筛选,然后通过单因子试验确定最适诱导物。在此基础上,进行发酵罐葡萄糖浓度、产酶pH值以及诱导物添加时间的优化。结果显示优化的发酵培养条件为葡萄糖1g/L,蛋白胨35g/L,NaCl 5g/L,KH2PO4 0.25g/L,（NH4）2HPO4 1.5g/L;接种量4%;初始pH值为5;控制产酶pH值为7;诱导物为L-苯丙氨酸,分别在发酵8h和26h时添加;在上述优化条件下,最高比酶活为40.85U/g,比未优化前提高了7.3倍。     

磷脂酶D的制备及催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸

选用穗色链霉菌(Streptomyces racemochromogenes)作为磷脂酶D的生产菌株进行了酶的制备及条件优化,并在两相体系中进行了酶催化磷脂酰胆碱合成磷脂酰丝氨酸的研究。结果表明,最适的产酶条件为葡萄糖10 g/L、酵母粉5 g/L、鱼粉蛋白胨5 g/L、司班-60 10 g/L、氯化钙3 g/L,接种量1%、培养基初始p H 7.0、培养温度30℃,在最适产酶条件下酶活达到2 967 U/L,是优化前的2.12倍;最适的催化工艺条件为有机相二氯甲烷、反应温度35℃、p H 5.5、酶用量1.15 U/m L、钙离子浓度10 mmol/L,在该催化工艺条件下反应10 h后磷脂酰胆碱的生成率达94%。     

β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达、酶学性质分析及其在宝藿苷Ⅰ制备中的应用

为获得安全高效的β-葡萄糖苷酶用于生物催化淫羊藿苷水解制备宝藿苷I,通过大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA5在食品安全菌株枯草芽孢杆菌WB600中异源表达Thermotoga petrophila来源的耐热β-葡萄糖苷酶TpBgl3,研究了所表达重组酶的酶学性质及其水解宝藿苷制备宝藿苷I的工艺条件。结果表明,菌株在30 ℃、SR培养基中发酵培养48 h后,上清液中的β-葡萄糖苷酶酶活力达到69.68 U/mL。重组表达的TpBgl3最适温度为85 ℃,最适pH为4.0,在65 ℃、pH4.0下放置3 h仍能保持85%以上的相对酶活。在65 ℃、pH4.0、酶用量0.16 U/mg、反应时间20 min的优化条件下,其能将10 g/L的淫羊藿苷水解转化为7.50 g/L的宝藿苷I,摩尔转化率为98.67%。β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌分泌表达为宝藿苷I及其他高附加值苷元类化合物的工业化安全高效生物制备提供了新途径。     

褐藻胶裂解酶基因在大肠杆菌中的表达及其酶学性质

作者从蜡样芽孢杆菌F1-5-10中提取DNA,通过PCR克隆得到褐藻胶裂解酶基因后,将其构建到pET-30a(+)上并在大肠杆菌BL21菌株中进行高效诱导表达,继而对纯化得到的褐藻胶裂解酶蛋白进行活性检测和酶学特性研究。实验结果表明:PCR扩增出1035bp大小的褐藻胶裂解酶基因algl(GenBank登录号:GU585575),SDS-PAGE电泳结果显示出相对分子质量约为45 000的特异性蛋白质条带。表达条件优化实验结果表明0.4mmol/L浓度的IPTG 32℃诱导4h重组蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白质质量的36%。测定褐藻胶裂解酶酶活性,酶活力为11.7U/mg。酶学性质研究表明:ALGL的酶活最适温度为35℃,热稳定性较差,最适pH值为6.6,Ca2+、Mg2对酶活有激活作用,ALGL催化褐藻胶的Km值为1.89mg/mL,Vmax为15.01U/mL。     

白丝北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的异源表达及酶学性质分析

为实现从L-谷氨酸到α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,α-KG）的高效生物转化,将来源于白丝北里孢菌（Kitasatospora setae KM-6054）的L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase,LGOX）在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现异源表达,并研究其酶学特性。根据LGOX的氨基酸序列和大肠杆菌系统偏好性合成LGOX全基因序列,并通过pET28a（＋）/DE3系统在大肠杆菌中实现了功能表达。诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）终浓度为0.1?mmol/L,20?℃诱导18?h,重组大肠杆菌粗酶液酶活力可达49.10?U/mL。亲和层析获得酶比活力为45.98?U/mg纯酶,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳条带显示蛋白分子质量大小约为70?kDa。酶学性质研究表明：其最适反应温度和pH值分别为40?℃和6.0;Km值为1.23?mmol/L,Vmax值为76.24?μmol/（min·mg）,L-谷氨酸为该酶的最适底物。本研究确定了LGOX在E.?coli?BL21中的异源表达及酶学特性,为生物转化合成α-KG提供了新的参考途径。     

基于关键因素调控发酵生产过氧化氢酶

采用正交试验策略,分析了不同关键因素对重组E.coli发酵生产过氧化氢酶(CAT)的影响,确定CAT合成的最优摇瓶发酵条件为:甘油5 g/L、酵母粉35 g/L、初始pH 7.5、诱导温度为30℃。在3 L发酵罐发酵生产CAT过程中,当转速为300 r/min时,酶活力最高为201 17.2U/mL,最适发酵产酶初始甘油质量浓度为10 g/L。以0.67 g/(L·h)的速率进行流加甘油时,最高酶活达28 243.0 U/mL。在诱导开始时一次性补入16.7 g/L甘油,当发酵至47 h时CAT酶活达到最大值为50 369.5 U/mL,为优化前酶产量的2.5倍。     

褶皱假丝酵母产脂肪酶条件及酶学性质研究

对一株来源于海洋有产脂肪酶能力的褶皱假丝酵母产酶条件进行研究,探讨了碳源、氮源、pH、培养温度对该菌产脂肪酶的影响。结果显示:在摇瓶培养条件下,其最适产酶条件为:蔗糖5 g/L,橄榄油5 g/L,MgSO4·7H2O1 g/L,K2HPO41 g/L,(NH4)2SO410 g/L,起始pH为7.0,接种量10%,在30℃、200 r/min下培养36 h,产酶能力达到4 351.6 U/mL。该菌所产脂肪酶的最适反应pH为7.0,最适反应温度为37℃,Ca2+、Mg2+对酶活有一定的促进作用。     

Thermus thermophilus分支酶的重组表达及其在抗性糊精制备中的应用

本文研究了来源于Thermus thermophilus的淀粉分支酶TtSBE,通过基因工程的方法构建重组大肠杆菌E.coli BL21(PET-24(a+)-TtSBE),使之在大肠杆菌内高效表达,并在此基础上对TtSBE的酶学性质进行研究,结果表明,TtSBE的最适pH为6.5,最适温度为60℃,在60℃的半衰期为40 h左右,TtSBE经纯化后,比活为773.27 U/mg;以2%的焦糊精为底物,利用TtSBE制备抗性糊精,当酶转化温度为60℃,pH为6.5,加酶量为3000 U/g(焦糊精),酶转化时间为12 h时,抗性成分含量达到50%,较焦糊精原料中的抗性成分含量提高了7%,本研究为抗性糊精的产率和质量的进一步提高奠定了基础。