米根霉乙醇脱氢酶粗酶液的特性研究

米根霉细胞中乙醇脱氢酶(ADH)催化丙酮酸向乙醇支路的转化,导致丙酮酸向乳酸转化通量减少,降低了乳酸转化率。本文初步从米根霉菌丝体中提取制备ADH粗酶液,并研究其酶学特性,结果表明,ADH粗酶液体系反应的最适温度为25℃,温度高于30℃将降低ADH活力。ADH催化体系pH值对其活力有很大影响,最适pH值在7.5左右,高于或低于此值,反应速度均很快下降。在反应体系中添加0.1μmol的EDTA、Mg2+、Ca2+或Zn2+,对该酶都有一定的抑制作用。ADH以乙醛为底物的米氏常数Km为6.90×10-4mol/L。     

一株耐高乙醇和低pH己酸产生菌Lysinibacillus fusiformis- pBE3-ep-SigB的构建

以Lysinibacillus fusiformis为出发菌,分别转染SigA和SigB突变基因,获得耐高乙醇和低pH胁迫的优良己酸产生菌。以pET32a（+）-SigA/SigB为模板,采用均匀试验优化SigA/SigB易错聚合酶链式反应（ep PCR）扩增体系中的Mn2+和Mg2+浓度,通过ep PCR获得ep-SigA/SigB突变基因,与载体pBE3-MCS连接后,构建L. fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB突变菌体库,将两种菌体库在pH值2～5和乙醇含量2%～12%条件下进行筛选。结果表明,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株耐受最高乙醇含量为8%左右,最低耐受pH值为2.5左右;当乙醇含量为8%、pH值为3.5时,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株的己酸产量达到（254.35±39.74） mg/100 mL,显著高于工程菌株L. fusiformis-pBE3-ep-SigA的己酸产量（P＜0.01）,且为出发菌L. fusiformis己酸产量（93.62±10.33） mg/100 mL的271.68%,表明L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株具有较强的抗高乙醇浓度和低pH值胁迫产己酸的能力。     

降解亚硝酸盐乳杆菌的筛选鉴定及其NiRs酶学性质

控制食品中的亚硝酸盐含量是食品工业的热点话题之一,因此该研究以乳酸菌为研究对象,从中筛选出亚硝酸盐降解能力最强的菌株进行鉴定,随后分离纯化目的菌株的亚硝酸还原酶（nitrite reductase,NiRs）,并研究其酶学性质。结果表明,亚硝酸盐降解率在90%以上的32株乳酸菌中,亚硝酸盐降解率最高的菌株36（目的菌株）的亚硝酸盐降解率为（96.36±0.37）%,为革兰氏阳性杆状菌,其糖类发酵试验结果与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）一致;其16S rDNA基因序列长度为1 464 bp,在NCBI中登录号为MN611150,与L.plantarum JCM1149同源性达100%,确定菌株36为植物乳杆菌。菌株36的NiRs比酶活为99.35 U/mg,回收率为15.5%,亚基相对分子质量约为47.8 kD;该酶最适温度为50℃,最适pH值为6.5,Km值为7.79 mmol/L,Vmax为5.84 mg/（L·min）;当金属离子添加浓度在1 mmol/L～10 mmol/L,Fe2+、Fe3+和Ca2+对NiRs酶活力有显著激活作用（P＜0.05）,1 mmol/L和10 mmol/L的Na+以及10 mmol/L Ba2+也有显著激活作用（P＜0.05）;而1 mmol/L和5 mmol/L的Ba2+和K+对NiRs酶活力有显著抑制作用（P＜0.05）,但乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）对酶活无显著影响。     

NH_4~+对合成气乙醇发酵过程的影响及其酶学机理

为研究合成气厌氧乙醇发酵中合成气杂质组分NH_3对发酵过程的影响,实验通过考察发酵培养基内不同初始浓度的NH~+_4对菌株A-fm4,Clostridium ljungdahlii和Clostridium autoethanogenum DSM10061利用生物质合成气发酵乙醇的影响,证实低浓度的NH~+_4可促进菌体生长和乙醇发酵,当其浓度高于9.35 mmol/L时,菌体生长和乙醇发酵随其浓度的增大而抑制显著。对菌株在菌体生长期和乙醇/乙酸发酵期内4种关键酶的活性研究表明,氢化酶(H_2ase)、一氧化碳脱氢酶(CODH)、乙醇脱氢酶(ADH)和乙酸激酶(ACK)均受高浓度(149.6 mmol/L)NH~+_4抑制,且菌体生长期的酶活水平均高于发酵期的值。这说明在低浓度NH~+_4下可促进还原力的产出而利于乙醇发酵,而较高浓度NH~+_4抑制代谢途径,致使菌体生长和乙醇发酵受阻。菌株C.ljungdahlii和C.autoethanogenum DSM10061的K_i值分别为208.13 mmol/L和240.37 mmol/L,耐铵能力较强,可作为未来耐铵菌株的驯化提供材料,为降低工业生产成本和减少合成气净化工艺工序奠定基础。     

蜂蜜对急性酒精中毒大鼠的解酒作用研究

目的:研究蜂蜜对急性酒精中毒SD大鼠的解酒作用及其对酒精代谢关键酶的影响。方法:用75%食用级无水乙醇按10m L/kg一次性灌胃法构建急性酒精中毒大鼠模型,以解酒护肝鼎久口服液为阳性药物对照,采用蜂蜜高、中、低3个浓度进行灌胃干预。以大鼠血清乙醇浓度、肝脏乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH)和乙醛脱氢酶(Acetaldehyde Dehydrogenase,ALDH)、胃ADH和ALDH为考察指标。结果:与模型组比较,蜂蜜低、中浓度组大鼠血清乙醇浓度均显著降低(P0.05),蜂蜜高浓度组大鼠血清乙醇浓度极显著降低(P0.01),蜂蜜中、高浓度组极显著提高大鼠肝ADH和胃ALDH活性(P0.01),蜂蜜各浓度组可显著提高胃ADH和肝ALDH活性(P0.05或P0.01)。结论:蜂蜜能够通过提高肝脏和胃的ADH和ALDH活性从而显著降低大鼠血清乙醇浓度,具有明显的解酒作用。     

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg,回收率为29.05%,纯化倍数为34.58;该酶分子质量约为171.79 kD,亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0;在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好;最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L;正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn2＋、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Mg2＋对该酶有激活作用,EDTA对该酶有双重作用。     

啤酒酵母HD34-1乙醇脱氢酶浮眭的研究

菌株HD34-1是将B．sub的乙醇脱氢酶（ADH）基因转入啤酒酵母HD34而构建的无醇啤酒酵母工程菌株,该菌株的ADH基因受Gal启动子的控制,因此为了考察该菌株ADH基因的表达情况,本研究设计了半乳糖和乙醇的浓度梯度进行发酵试验并测定了相应条件下的的ADH活性,结果表明2％的半乳糖浓度,诱导16h最适宜ADH基因的表达。     

蕹菜过氧化物酶的分离纯化及理化性质

新鲜蕹菜经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯的过氧化物酶（peroxidase,POD）,该酶的比活力、回收率、纯化倍数和产率分别为35 972.96 U/mg、12.21%、168.48和211.07 U/g。该酶的亚基分子质量为42.7 kD,最适温度为40 ℃,最适pH值为6,并且在20～50 ℃及pH 5～8的范围内具有良好的稳定性。以不同浓度的H2O2为底物,测得该酶的Km值为18.32 mmol/L。NaCl、尿素（Urea）、Zn2+、Mg2+对该酶都具有较强的激活作用,十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）、硫氰化钾（potassium thiocyanate,KSCN）、抗坏血酸（ascorbic acid,AsA）、Ba2+、Mn2+ 、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇对蕹菜POD活力均有抑制作用,其中抗坏血酸对POD有极强的抑制作用,当浓度为0.01 mol/L时,酶活力接近于0。     

浓香型白酒风味成分对乙醇代谢及关键酶活性影响的体内实验研究

选用不同产地的四种浓香型白酒样品（编号为SC1、SC2、SC3、JS）,建立小鼠灌胃模型,分别灌胃白酒、高醇白酒、高酯白酒和相同浓度的酒精溶液,随后测定小鼠的行为指标,血液中乙醇和乙醛含量以及肝脏中乙醇脱氢酶（ADH）和乙醛脱氢酶（ALDH）活性。结果表明,灌胃给药后,白酒中高浓度异丁醇、正戊醇和异戊醇显著降低了小鼠的协调能力（P＜0.05）;血液中乙醇含量（3 692～23 237 mg/L）和乙醛含量（18～84 mg/L）均升高;增加白酒中大多数醇类和酯类含量均能抑制ADH（30.93～45.73 U/L）和ALDH（87.98～104.61 U/L）活性,且对ADH抑制作用更显著（P＜0.05）;增加SC2和SC3酒样中丁酸乙酯含量可以同时促进ADH（34.73 U/L、35.11 U/L）和ALDH（104.61 U/L、103.52 U/L）的活性。体内实验结果表明,不同产地的白酒及其差异化风味成分（增量变化）对乙醇代谢和关键代谢酶有不同程度的影响。     

一种测定乙醇脱氢酶活性的循环催化流动分析法

基于乙醇(EtOH)/乙醇脱氢酶(ADH)/氧化型辅酶I(NAD+)催化反应体系,建立了一种用于ADH活性测定的循环催化流动分析法(RCFA),并优选该测定体系的实验条件,得到如下参:Tris-HCl缓冲液浓度(pH 8.9)为0.1 mol/L.EtOH的浓度为15.6 mol/L,NAD+浓度为9.0 mmol/L,ADH用量20 μL/次,反应液流速为0.98 mL/min,反应液体积为2 mL;ADH的测定范围为0.6～50 U/L,检出限为0.14 U/L,相对标准偏差≤1.3%(n=11).RCFA法具有测定过程简便、快速、自动化特点,能对ADH催化反应过程进行连续循环检测,可对ADH活性变化实现动态研究.RCFA法使反应液循环不但节省了大量的试剂和酶量、降低了测定成本,而且循环测定时不存在人为误差,提高了测定结果的准确度.