毕赤酵母展示海藻糖合成酶及其性质研究

利用毕赤酵母表面展示天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)海藻糖合成酶(Trehalose synthesase,TS,EC 5.4.99.16)并研究其酶学性质。人工合成酵母内源壁蛋白(GPI-modified wall proteins,GCW14)与天蓝色链霉菌海藻糖合成酶组合DNA(GCW14-TS),将其亚克隆到pPIC9k载体后转化到GS115酵母菌中,成功构建了pPIC9k-GCW14-TS载体,并将TS展示在毕赤酵母GS115表面,然后对其酶学性质进行研究。发现其在30~45℃温度范围都能发挥作用,最适pH为8.5,K~+、Mg~(2+)等金属离子对其有促进作用且重复使用5次后仍然可以保持75%以上的酶活性。该基因工程菌具有海藻糖合成酶固定化酶性质,可用于将麦芽糖转化为海藻糖的产业化生产。     

人α-防御素5前体蛋白在毕赤酵母中分泌表达的研究

为了探索人α-防御素5(HD5)前体蛋白基因在酵母中高效分泌表达的可行性,将其对应基因克隆到载体pPIC9K,得到重组载体pPIC9K-preproHD5,经SacI线性化后,转入Pichiapastoris GS115,得到重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-preproHD5。应用PCR技术筛选高拷贝转化株,用BMGY培养GS115/pPIC9K-HD5至OD600为2～6时,用BMMY诱导培养120h,离心取上清液,用Tricien-SDS-PAGE和蛋白定量试剂盒分析人α-防御素5前体蛋白的表达量。琼脂扩散法检测人α-防御素5前体蛋白的抑菌活性,发现其对金黄色葡萄球菌(ATCC6538)和大肠杆菌(ATCC10231)2种标准菌株具明显的抑菌活性。人α-防御素5前体基因可在毕赤酵母实现分泌型表达,该策略可能成为防御素工业化开发的有效途径。     

枯草芽孢杆菌B2(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛.将编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis B2)木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-XYN.初步研究表明:以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程菌摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可迭1542.6 U/mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性.     

耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

将一种11家族极端耐热木聚糖酶的密码子优化基因Syxyn11克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-Syxyn11,将其经SalⅠ线性化后转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。经G418筛选得到重组工程菌GS115/Syxyn11,用甲醇诱导表达重组木聚糖酶SyXyn11,酶活可达到17.74 U/mL。SDS-PAGE显示,SyXyn11的相对分子质量为31 000。SyXyn11的最适反应温度为85℃,在80℃以下稳定。最适反应pH为6.5,在pH 5.0~7.5范围内稳定。EDTA和大多数金属离子对重组酶的活性影响不大。结果表明Syxyn11成功在P.pastoris GS115中实现表达,而且重组木聚糖酶的耐热性并未改变。     

枯草芽孢杆菌B2（Bacillus subtiIis B2）木聚糖酶在毕赤酵母中的表达

木聚糖酶是主要工业用酶制剂之一,在食品行业应用广泛。将编码枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶XYN的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载pPIC9K-XYN,载体经线性化后转化Pichia pastoris GS115,G筛选获得了分泌表达XYN的重组毕赤酵母工程菌GS115／pPIC9K-XYN。初步研究表明：以山毛榉木聚糖为底物时,重组毕赤酵母工程茵摇瓶水平发酵上清液中木聚糖酶酶活可达1542.6U／mL,重组木聚糖酶最适温度为50℃,最适pH值为6.0,并显示出较好的热稳定性和宽pH适应性。     

烟草蚀纹病毒外壳蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

摘 要:利用RT-PCR方法获得烟草蚀纹病毒（TEV）外壳蛋白（CP）基因,大小为789 bp。经过EcoRI和NotI双酶切、定向克隆到pPIC9K,构建了真核表达载体pPIC9K-TEVCP。将重组质粒用Sal I线性化后电转化导入毕赤酵母GS115中, 经PCR鉴定为阳性的菌落,利用甲醇进行诱导表达,筛选出了高效表达菌株GS115-11和GS115-14,表达的蛋白大小约为37 kD。表达产物经SDS-PAGE割胶纯化后,免疫家兔,制备了特异性抗血清,ELISA法检测效价为1:1500。Western blot结果显示,制备的抗血清可以用来检测田间的发病植株。      

奶牛α-1,3-岩藻糖基转移酶基因的克隆表达

唾液酸化路易斯-X(sialyl lewis x,Slex)是选择素家族的一个共同糖配体,通过与选择素竞争性地结合炎性细胞,可以抑制炎症反应。克隆表达Slex合成过程中的关键酶,就可以在体外进行Slex的生物合成,从而进行相关生物制剂的开发。α-1,3-岩藻糖基转移酶(alpha-(1,3)-fucosyltransferase,FT)就是参与Slex生物合成过程的关键酶之一。利用相关软件对牛的FT基因进行了生物信息学的分析,了解了FT的相关理化性质。通过PCR的方法获得了FT基因,构建了重组质粒pMD19-FT,并亚克隆至表达载体pPIC9K。通过电转化将线性化的表达质粒pPIC9K-FT整合到宿主菌Pichia pastoris GS115基因组上,构建了重组酵母GS115-FT。经诱导表达后,SDS-PAGE检测到了目的蛋白质条带,证明了此基因在P.pastoris GS115中能够可溶性表达。     

利用GAP启动子在毕赤酵母中表达牛肉风味强化肽

牛肉风味强化肽是1种从牛肉木瓜蛋白酶的水解物中分离得到的风味强化八肽。为了提供能够大量且廉价得到这种小肽物质的表达基因,本实验室工作人员构建以甲醇为诱导物并带有16拷贝BMP基因的表达载体pPIC9-16BMP。本文为了提高食品的安全性,避免甲醇作为诱导物,探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕赤酵母中组成型表达外源蛋白的可能性。应用PCR方法从毕赤酵母染色体中扩增GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9-16BMP上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9-16BMP。转化毕赤酵母GS115,对获得的高拷贝转化子毕赤酵母GS115(pGAP9-16BMP)进行组成型表达,并用SDS-PAGE检测到目的产物。     

Lactobacillus kefiranofaciens 乳糖酶基因克隆及在毕赤酵母中表达

以马乳酒样乳杆菌ZW3基因组为模板,PCR扩增得到乳糖酶中LacL、LacM两个大小亚基片段,经EcoRI和SnaBI双酶切后,分别连接pPIC9K质粒,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,并验证其核苷酸序列正确。将重组质粒pPIC9K-LacL、pPIC9K-LacM分别电转化毕赤酵母GS115,构建pPIC9K-LacL-GS115重组子和pPIC9K-LacM-GS115重组子,通过筛选得到抗G418浓度达到3.0 mg/mL,具有多拷贝基因的重组子。经反转录PCR验证,cDNA上存在LacL片段,并可检测到乳糖酶酶活达到1.17 U/mL;pPIC9K-LacM-GS115重组子诱导表达72 h后的发酵液上清经SDS蛋白电泳检测到目的条带。     

表达豌豆防御素基因的重组酵母对采后柑橘酸腐病的生物防治

抗菌肤(Antimicrobial peptides,APMs)是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制作用的小分子多肽.将碗豆防御素基因Psd1插入甲醇酵母Pichia pastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,并将含有目的基因的重组质粒电转化P.pastoris GS115 (his4),得到重组酵母GS 115/PSD菌株.试验结果表明,重组酵母菌株经扩大培养,诱导表达的菌体被破碎后,酵母悬浮液含量达到5×108细胞/mL时,可以很好地抑制采后柑橘的酸腐病.     

透明颤菌血红蛋白基因（vgb）与monellin基因在毕赤酵母中的联合表达

根据酵母偏爱密码子合成了monellin甜蛋白基因和vgb基因,然后构建了2种不同方式表达的载体,胞内表达的pPIC3.5KV和分泌表达的pPIC9KM.电击转化得到重组子GS115/pPIC9KM和GS115/pPIC9KM/pPIC3.5KV,通过PCR、SDS.PAGE及Western blotting检测发现monellin甜蛋白基因和vgb因成功整合进毕赤酵母基因组并成功表达,通过品尝和CO-差示光谱法证实其表达产物具有活性,用southern blotting对6株高产菌株进行拷贝数分析并未发现拷贝数与分泌蛋白产量之间存在明显的正相关.对比发现,含vgb基因菌株比未含菌株高甜度monellin的产量最高提高了20%,菌体密度平均提高了9%.     

菊糖果糖转移酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

将PCR获得的不包含信号肽序列的菊糖果糖转移酶基因(ift)与毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K进行连接,构建重组载体pPIC9 K-IFTase.重组载体经线性化后电转入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性梯度筛选及PCR鉴定,获得一株高拷贝菊糖果糖转移酶重组毕赤酵母菌株.该重组菌株经甲醇诱导,能够分泌具有活性的菊糖果糖转移酶,且60h时酶活为10.3U/mL.结果表明,菊糖果糖转移酶可以实现在毕赤酵母的分泌表达.     

麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

用PCR 方法从E.coli BL21(DE3)中获得麦芽糖转糖基酶基因,将该基因插入到酵母表达载体pPIC9K 的α分泌信号开放阅读框的下游,对重组质粒pPIC9K-MalQ 所含的外源片段进行双向测序。将测序正确的重组质粒用内切酶Sal Ⅰ线性化,电穿孔转化到GS115 感受态细胞中,G418 梯度筛选高拷贝转化菌及PCR 鉴定目的基因的整合,1% 甲醇诱导表达。经薄层色谱分析粗酶液处理的麦芽二糖溶液,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基酶活性。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

为大规模制备β-葡萄糖苷酶,构建重组酵母工程菌,实现β-葡萄糖苷酶的分泌表达。根据已报道黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶cDNA序列设计一对引物,采用RT-PCR扩增,获得黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl)。构建了pMD-18T-bgl克隆载体,bgl亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-bgl。经BglⅡ线性化后电转入Pichia pastoris GS115,经过MD、YPD/G418平板筛选阳性克隆,获得分泌表达重组P.pastoris GS115的工程菌。用终体积分数1%的甲醇对其进行诱导表达,SDS-PAGE和酶活测定结果表明,重组毕赤酵母分泌了1个相对分子质量约90 000的蛋白质,与该酶基因产物的理论值一致。酶催化的最适温度为50℃,最适pH 5.5,其酶活达到38 U/mL,比已报导重组酶产酶水平有较大程度的提高。     

GOD转基因酵母菌的构建及其重组GOD的纯化与活性分析

葡萄糖氧化酶（GOD）被广泛应用于食品工业、医学诊断试剂等。目前葡萄糖氧化酶生产主要采用的发酵体系,大多数属于胞内表达存在生产成本偏高,且产出蛋白有杂质使产品纯度不够高等问题。因此,如何构建优良的GOD产生菌株,并让它有效的高表达,具有重要意义。本实验用Sacl内切酶鉴定所保存的质粒是否正确,克隆的真核分泌型表达载体质粒pPIC9K—His—GOD转化大肠杆菌,提取重组质粒pPIC9K—His—GOD并纯化质粒。用pPIC9K—His—GOD用BlgII内切酶线性化,电转毕赤酵母菌GS115,用PCR法鉴定其基因组中是否转化成功。将得到的预期菌种做发酵表达,SDS-PAGE检测蛋白表达结果。     

烟曲霉壳聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

为了筛选高效表达壳聚糖酶的毕赤酵母菌株。重组质粒pPIC9K-CSN经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut+转化子,PCR鉴定后,用G418梯度浓度筛选多克隆子,用甲醇诱导摇瓶分泌表达。经PCR分析,质粒转到宿主菌GS115,在G418为4mg/mL时,筛选到了多克隆子,经SDS-PAGE分析表明分泌表达蛋白的相对分子量约为25kDa,酶活为14.59 U/mL。     

新型生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽在毕赤酵母中的表达

在毕赤酵母GS115中表达一种新型食品生物防腐剂——多聚阳离子抗菌肽(poly-cationic antibacterialpeptide,PCAP)。根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成编码多聚阳离子抗菌肽与多聚阴离子肽融合肽的DNA序列,连接并克隆入酵母表达载体pPIC9,得到重组表达质粒pPIC9-PCAP,并转化至毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆子,用体积分数0.5%的甲醇诱导表达,优化表达条件,表达产物用Tricine-SDS-PAGE分析,在分子质量8kD左右处可见目的蛋白表达条带,表明融合肽成功地在毕赤酵母中分泌表达。在pH2.0条件下将表达产物采用胃蛋白酶酶解,分离得到的碱性多聚阳离子肽对食品腐败微生物枯草芽孢杆菌具有明显的抑菌作用。     

组合策略促进碱性果胶酶在毕赤酵母中高效表达

本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量。基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的Eco R I-Not I得到PGL表达载体p PIC9K-PGL。p PIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL 14#,胞外PGL酶活达到301.32 U/mL,较优化前提高25.1%。在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1)。结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3%,达到450.12 U/mL。应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#进行3 L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1 362.31 U/mL。研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义。     

解淀粉芽杆菌中性植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

采用PCR法从解淀粉芽孢杆菌BA11中克隆到一个中性植酸酶phyc基因,将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上并电转化至宿主细胞GS115后进行诱导表达.SDS-PAGE试验表明,该重组中性植酸酶在毕赤酵母宿主细胞中实现了高效分泌性表达.植酸酶活性测定结果显示阳性克隆子在诱导72h酶活性达到最高值,活性为2330U/L.     

用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组 猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂

目的构建组成型表达重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kiwi pectin methylesterase inhibitor, kwPMEI)的毕赤酵母(P．pastoris)GS115工程菌株,探索碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)对重组菌表达kwPMEI的影响,纯化kwPMEI并鉴定其对番茄果胶酶的抑制活性。方法应用PCR方法从P．pastoris GS115染色体中扩增了三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP),以其取代诱导型表达载体pPIC9K-kwPMEI上的醇氧化酶启动子(pAOX1),构建了组成型表达载体pGAP9K-kwPMEI,并转化至GS115中。用Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白表达情况,镍柱亲和层析纯化目的蛋白,并用凝胶扩散方法鉴定其抑制活性。结果重组毕赤酵母工程菌株成功组成型表达了kwPMEI,48h即达到最大表达水平,表达量约为66 mg/L。并且以甘油为碳源时kwPMEI表达量最高。成功分离纯化了kwPMEI,并经凝胶扩散方法检测表明其具有抑制活性。结论成功构建了组成型分泌表达kwPMEI的毕赤酵母菌株,为kwPMEI在果蔬汁中的进一步应用奠定了基础。