TMV、CMV和PVY三重荧光定量PCR同步检测方法的建立

为建立同时检测烟草普通花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的多重荧光定量PCR方法，本研究根据GenBank中TMV、CMV及PVY的CP基因保守序列设计引物和探针，并对反应体系进行了优化，建立了可同时检测TMV、CMV和PVY的三重荧光定量PCR方法，并评价了该方法的敏感性、特异性、重复性及准确性。结果显示，建立的方法中TMV、CMV和PVY的检测下限分别为2.60×10¹、1.25×10¹、2.33×10¹ copies/μL，检测灵敏度比普通PCR法提高10倍；该方法可特异性检测出TMV、CMV和PVY，但烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草脉带花叶病毒(TVBMV)和番茄斑萎病毒(TSWV)无法检出且无交叉反应，批内与批间重复性试验变异系数均小于1.5%,24份样本检测结果中TMV、CMV和PVY的阳性检出率分别为75%、100%和41.67%，且三重荧光定量PCR方法与普通单重PCR方法得出一致的检测结果。结果表明本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法具有特异性强、稳定性好、准确性高等优点...     

产黄曲霉毒素真菌双重荧光定量PCR检测技术的建立与应用

为实现产黄曲霉毒素真菌的快速检测,本研究建立了检测产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因的双重荧光定量PCR方法。分别针对aflR基因和nor-l基因保守序列,各设计2对特异性引物和探针,通过引物对间的有效性实验各筛选出1对最优的aflR引物探针和nor-1引物探针,随后建立并优化双重荧光定量PCR的反应条件,构建标准曲线,测定该方法的重复性、灵敏度和特异性。结果显示,成功筛选出aflR-2和nor1-2 2组引物/探针组合,并优化和确定了引物/探针的最佳反应终浓度。特异性实验结果显示,本研究建立的检测方法仅对产黄曲霉毒素真菌的aflR基因和nor-1基因呈现特异性扩增,对黑曲霉、碳黑曲霉、赭曲霉和镰刀菌等常见产毒真菌的核酸样品均无扩增曲线。建立的方法重复性好,批内和批间变异系数均<3%,双重反应体系的检测灵敏度均低至1×10² copies/μL。利用本研究所建立的方法与ELISA试剂盒分别对80份食品样品进行检测,结果显示,双重荧光定量PCR共检测出9份阳性样品,而ELISA试剂盒只检测出了7份阳性,表明本研究建立的方法具有更高的灵敏度和准确性。     

实时荧光PCR法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的研究

近年来,包装饮用水中铜绿假单胞菌超标的现象时有发生,运用国家安全标准方法进行检验,过程烦琐,周期较长,不利于监管。然而,实时荧光PCR检验法具有灵敏、快速、准确等优点,被广泛应用于各种检验检测中。本文采用实时荧光PCR法,利用特异性引物和探针对目标基因进行扩增。然后通过实时荧光PCR法对其他5种细菌和梯度含量的铜绿假单胞菌菌悬液进行检测,验证方法的特异性和灵敏度。结果表明,只有铜绿假单胞菌的实时荧光PCR检测结果为阳性,其他细菌的检测结果为阴性,说明本方法对铜绿假单胞菌的特异性较好,方法的灵敏度为1×10³ CFU·mL^-1。同国家安全标准方法相比,实时荧光PCR法所用时间更短,明显提高了检测效率。     

散装即食食品中3种食源性致病菌多重荧光定量PCR检测方法的建立

该研究旨在建立散装即食食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种食源性致病菌的多重荧光定量PCR检测方法，根据沙门氏菌侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因、蜡样芽孢杆菌的cer A基因分别设计3对特异性引物与探针，并对体系中引物探针的浓度以及退火温度等反应条件进行优化筛选，建立多重荧光定量PCR检测方法，同时评估其特异性、灵敏性及重复性，并应用该方法检测散装即食食品样本中致病菌，同时与国标法比对。结果表明，建立的多重荧光定量PCR检测方法能特异性地扩增沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽孢杆菌3种目标菌，其他菌株均不扩增，灵敏度分别为4×10²、3×10²、2×10² cfu/mL，且批内和批间变异系数均小于2%，重复性和稳定性良好。同时用国标法和多重荧光定量PCR法对100份散装即食食品样本进行检测比对，多重荧光定量PCR法的阳性检出率略高于传统国标法，且检测时间大幅缩短。综上所述，建立的多重荧光定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、快速准确，在食源性致病菌快速筛查方面具有良好...     

鸡源细菌中5种四环素耐药基因多重PCR检测方法的建立

为建立一种同步检测鸡源细菌中5种四环素耐药基因tetA、tetD、tetG、tetS和tetX的多重聚合酶链式反应(PCR)方法,优化了多重PCR体系的引物和Taq DNA聚合酶浓度及退火温度等参数,并考察了方法的灵敏度、特异性和适用性。建立的多重PCR反应技术的最佳反应体系为:混合DNA模板5μL,Taq酶1μL,tetA和tetX的正反向引物各0.5μL,tetG、tetD和tetS的正反向引物各1.0μL,dNTP4μL,MgCl24μL,10×PCR反应缓冲液5μL,最终用dd H2O补齐至50μL;反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min。该方法的灵敏度为102 CFU/mL,且能广谱地检测多种鸡源细菌中的5种四环素耐药基因。与传统的单重PCR方法相比,该多重PCR技术快速高效、适用性广。     

多黏菌素类抗生素耐药性编码基因检测用质粒标准样品研制

目的 研制适合多黏菌素类抗生素耐药性编码基因检测用质粒DNA标准样品。方法 由National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库检索得到mcr-1、mcr-3、mcr-5基因参考序列,构建重组质粒和重组菌株;将重组菌传代至15代检测目标基因的遗传稳定性。提取重组质粒,真空干燥,制得标准样品。将标准样品水化、连续10倍梯度稀释,测定聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光PCR（RT-qPCR）扩增目标基因的检出限。随机抽取质粒DNA标准样品,采用PCR法和紫外分光光度计法检验样品的均匀性及其在4 ℃、37 ℃、-20 ℃的贮存稳定性。结果 成功获得多黏菌素类抗生素耐药机制编码基因mcr-1、mcr-3、mcr-5基因片段,重组菌15代传代中目的基因遗传稳定。mcr-1、mcr-3、mcr-5标准样品PCR和RT-qPCR最低检出限分别为1.67×10⁴ 拷贝数/μL和1.67 拷贝数/μL、1.31×10⁶ 拷贝数/μL和13.1 拷贝数/μL、1.55×10⁵ 拷贝数/μL和1.55 拷贝数/μL。T检验表明,各基因随机抽取的12管标准样品质量间的F值均小于F_临界值,且PCR均可检出,均匀性符合要求。标准样品在4 ℃贮存90 d、37 ℃贮存14 d、-20 ℃贮存360 d,定性、定量检验结果稳定、无极显著性差异。结论 本实验制备的mcr-1、mcr-3、mcr-5质粒DNA标准样品目的基因遗传稳定,均匀性和贮存稳定性良好。本研究结果可用于多黏菌素类抗生素耐药机制的快速预测和相关基因检测的质控样品。     

食品中铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测的研究

根据铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个Taq Man探针,建立铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的铜绿假单胞菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,只有铜绿假单胞菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及Taq Man探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3 CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

可视化环介导等温扩增法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌

为建立一种快速、简单、灵敏的产志贺毒素大肠埃希氏菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）检测方法,本研究以stx基因作为检测靶基因和利用羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue,HNB）指示剂建立了一种STEC的可视化环介导等温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP）方法。根据GenBank公布的STEC菌株stx1和stx2基因核苷酸序列为靶序列,分别设计并合成五组特异性LAMP引物,优化反应条件和体系,进行特异性和灵敏度试验。同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测方法相比较,并对人工污染STEC的脱脂乳进行检测。结果表明,建立的可视化LAMP方法在64℃反应50 min后可凭肉眼观察（紫罗兰色到天蓝色）判定结果。该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应,可以准确区分STEC与非STEC菌。灵敏度的检测结果表明,stx1-LAMP和stx2-LAMP检测方法的检测限分别为3.54×10-4 ng/μL和3.54×10-5 ng/μL,而常规PCR的检测限stx1和stx2分别为3.54×10-3 ng/μL和3.54×10-2 ng/μL,即stx1-LAMP检测方法的灵敏度是stx1-PCR的10倍,stx2-LAMP检测方法的灵敏度是stx2-PCR的1000倍。对人工污染STEC菌牛奶样品进行检测,stx1-LAMP和stx2-LAMP分别可检测到细菌浓度为103 CFU/mL和102 CFU/mL的加标样品。本研究为STEC菌株提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低,适用于现场和基层检测的可视化LAMP 检测方法。     

利用重组酶聚合酶扩增和表面增强拉曼散射快速检测大肠杆菌耐药基因mcr-1

目的 利用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法和表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering, SERS)技术建立了一种大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)耐药基因mcr-1(mobile colistin resistance-1, mcr-1)的快速检测方法。方法 首先,通过RPA特异性扩增大肠杆菌耐药基因mcr-1的保守序列。然后,以金纳米粒子(gold nanoparticles, Au NPs)作为SERS增强基底,利用便携式拉曼光谱仪采集样品的SERS光谱。最后,利用样品的特征SERS信号,实现大肠杆菌耐药基因mcr-1的快速、灵敏检测。结果 样品位于505.5和840.9 cm?1拉曼位移处的SERS信号强度与其浓度的对数值之间具有良好的线性相关关系,R2分别为0.9827和0.9636。该方法的最低检测限为3.2×10-4 pg/μL,检测时间约为30 min。结论 本研究建立的RPA结合SERS方法检测耐药基因灵敏度高、用时短,为细菌耐药基因的快速检测提供了新思路。     

NDM-1基因DHPLC快速检测体系的建立

NDM-1基因是一种专属于"超级细菌"的重要特有的耐药基因,在食品潜在污染病原微生物的检测中着重要的作用。本研究以实现食品中超级细菌的快速检测为目标,初步建立了NDM-1基因的PCR-DHPLC快速检测鉴定方法,根据NDM-1基因序列,设计、合成了PCR引物(ND-D-F和ND-D-R),并分别对NDM-1质粒DNA及其他11个标准菌株进行了PCR扩增和DHPLC检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA经过PCR-DHPLC反应扩增出特异性样品吸收峰,而其他对照菌均未出现相应吸收峰,提示本文中设计和应用的PCR引物具有NDM-1基因检测的特异性;灵敏度测定结果显示,此体系检测下限可达100fg/μL,提示PCR-DHPLC方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化

本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因设计特异性引物,优化反应条件,并对特异性、灵敏度进行了验证。LAMP最佳反应条件为,外内引物浓度比为1∶8,Mg2+反应浓度为4 mmol/L,d NTPs浓度为3.5 mmol/L,温度为65℃,反应时长为1 h,只对副溶血弧菌产生扩增反应,与其余细菌不产生扩增反应,细菌基因组DNA和纯培养物的灵敏度约为5.45×101 fg/μL和140 cfu/m L,对人工污染食品样品进行检测,检出限为2.8×102 cfu/m L。该方法反应时间短、特异性强、灵敏度高。     

基于HDA的超级细菌耐药基因NDM-1检测方法的建立

本研究以建立解旋酶DNA恒温扩增(HDA)检测方法为目的,选择三种超级细菌NDM-1基因(metallo-beta-lactamase 1 gene)为目的基因,设计并合成特异性引物,建立和优化了可快速检测该种基因的HDA检测方法。特异性和灵敏度检测结果表明:该方法对NDM-1基因检测具有特异性,最低检测限可达10fg/μL,灵敏度高于普通PCR。提示HDA是一种针对NDM-1的快速、灵敏、便捷的非PCR核酸扩增技术。     

NDM-1基因PCR检测技术的研究

NDM-1基因是一种"超级细菌"特有的耐药基因,对于菌体的广谱抗药性起着决定性的作用。本研究以实现该基因的快速检测为目的,初步建立了NDM-1基因的PCR快速检测鉴定法。选取肺炎克雷伯氏菌ADB65的NDM-1基因为目的基因,设计并合成了PCR检测引物(ND-319-F和ND-319-R),并以另外11种标准菌株为对照,分别进行了PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA经过PCR反应都扩增出长为319bp的特异性片段,而其他对照病菌均未出现相应片段,证明这对引物具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出100fg/μL质粒DNA模板。研究表明,PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。     

烟草靶斑病LFD-RPA快速检测方法的建立

烟草靶斑病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)侵染引起的烟草叶部病害，近年来在我国部分省份发生严重，危害烟草生产。为开发烟草靶斑病的早期快速诊断方法，本研究根据该病原菌的内转录间隔区(ITS)，设计了重组酶聚合酶扩增技术相关引物Rs RPA-F3/R3，建立了一种靶斑病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。该方法能够在37℃，15 min内特异性地检测到R. solani(1.40×10² copies/μL)质粒DNA，与常规PCR灵敏度一致。在田间烟草靶斑病实时检测中，准确率达95.83%。本方法具有快速、简单、可视化等特点，为烟草靶斑病菌的田间快速诊断提供了技术支撑。     

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/m L。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

产黄曲霉毒素真菌多重PCR检测体系的建立

依据标准SN/T 2582—2010《产黄曲霉毒素真菌PCR检测方法》推荐的产黄曲霉毒素调节基因afl R、柄曲霉素转甲氧基酶基因omt-1、杂色曲霉素A脱氢酶基因ver-1及真菌共有的5.8S r DNA的ITS序列分别设计4对特异性引物,对4对引物进行多重PCR反应体系构建与优化,建立快速检测产黄曲霉毒素真菌的多重PCR方法,并应用10株试验菌株对所建立的检测方法进行验证。结果表明,建立的多重PCR方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的优点,为产黄曲霉毒素真菌快速检测试剂盒的研发及应用提供了重要技术保障。     

葡萄球菌耐药基因aph的LAMP检测方法研究

随着抗生素大量而广泛的使用,细菌的耐药性已成为世界范围内关注的问题,对细菌携带耐药基因的检测已成为生物安全调查评估的新途径。本实验应用PCR方法扩增新霉素耐药基因aph,将其克隆于p EASY-T1载体并测序。通过Genbank同源性比较,在aph基因保守区设计了一套环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,建立了耐新霉素aph基因的LAMP检测方法,其最佳工作条件为:甜菜碱浓度为0.8 mol/L,Mg2+浓度为20 mmol/L,反应温度63℃,时间50 min。此方法可在60 min左右完成对aph基因的检测,特异性好。应用系列稀释的aph基因质粒进行敏感性检测比较,结果表明aph基因的LAMP检测灵敏度与PCR相当,检测限约20个拷贝。对38株葡萄球菌分离株的aph基因的LAMP检测表明,aph基因阳性携带率为84.2%。     

烟草五种土传病原菌的多重PCR快速检测

  目的  建立一种可同时检测烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）、青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、立枯病菌（Rhizoctonia solani）、根腐病菌（Fusarium oxysporum）和根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）5种烟草重要土传病原菌的五重PCR快速检测方法。  方法  筛选5种病原菌的特异性引物组合,通过不同的引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行优化,检测体系的灵敏度,并对土壤和植株样品进行测试,验证其实用性。  结果  根据青枯病菌fliC基因、立枯病菌RPB2基因、根腐病菌COI基因以及根黑腐病菌TEF1基因设计特异性引物,并结合已报道的黑胫病菌parA1基因的特异性引物,成功建立5种烟草土传病害的多重PCR检测方法。反应体系（25 μL）:Sf1/Sr1、Ff1/Fr1、Pf1/Pr1每条引物分别0.3 μL,Rf1/Rr1每条引物各1.8 μL,TBf1/TBr1每条引物各1 μL,2×PCR Mix 12.5 μL,退火温度为58℃,灵敏度可达到100 pg/μL。  结论  本研究建立的多重PCR体系能够同时快速检测烟草黑胫病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田间带菌烟草病株和土壤,为田间烟草土传病害的早期诊断提供依据。      

建立DARQ-LAMP方法快速检测单增李斯特菌

该研究针对单增李斯特氏菌的特异性基因hlyA设计引物，优化反应条件，建立实时荧光环介导等温扩增（realtime loop-mediated isothermal amplification,real-time LAMP）的检测方法，在此基础上，建立检测单增李斯特氏菌的基于淬灭基团释放环介导等温扩增检测方法（detection of amplification by release of quenching-LAMP,DARQ-LAMP），分析其特异性和灵敏度。结果表明，该方法的适宜反应条件为反应温度63℃、Bst DNA 3.0聚合酶0.32 U/μL、淬灭探针双链（quenching probe double chain,QPD）探针浓度10%、Mg2+浓度6 mmol/L；对单增李斯特菌的检测限为7.3×101copies/mL，灵敏度是普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的100倍。该方法效率高、特异性好、灵敏度高，为环介导等温扩增技术检测食源性致病菌的研究提供参考。     

单核细胞增生性李斯特氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

以单核细胞增生性李斯特氏菌的hly基因为靶基因,用Primer 5.0设计了特异性兼并引物,建立荧光定量PCR检测方法。并用阳性质粒标准品、不同菌株对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,且在人工污染鲜切甜瓜上对该方法进行了初步应用。结果表明,建立的检测方法特异性强、灵敏度高,对阳性质粒标准品的灵敏度为7.69×10copies/μL,对人工污染的鲜切甜瓜中单核细胞增生性李斯特氏菌的最低检出限为3.11×10cfu/mL。