产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及产酶性质研究

以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)法筛选产酶菌株,并进行酶活力定量分析。对产酶菌的种属定性采用5.8SrDNA-ITS区域RFLP分析的分子鉴定法。通过细胞破壁检测酶活力测定菌株的产酶定位。利用水杨苷和七叶苷为诱导物驯化菌株,提高其产酶能力。结果表明,从236株自选酵母菌中筛选出210株产酶菌株,区分为4种分子类型,分别为:有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora vineae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)和卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)。产酶活性较高的8株酿酒酵母酶活性在0.0075~0.0099 U/mL之间,产酶定位均为:胞外酶胞内酶胞壁酶。水杨苷只对S4菌株产酶具有诱导作用,酶活力提高14%。而七叶苷可对S1和S4菌株产酶具有诱导作用,酶活力分别提高13%和19%。本研究筛选出8株高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母,可用于生产葡萄酒。     

非酿酒酵母菌的分离鉴定及产酯关键酶活性的研究

采用传统培养分离法从新疆葡萄表皮分离酵母菌，结合形态观察及WL培养基鉴定，选取代表性菌株进行分子生物学鉴定，并测定筛选菌株的产酯含量及产酯关键酶活性。结果表明，共分离出72株酵母菌株，筛选出33株代表性菌株，其中非酿酒酵母31株，归属于10个属，分别为红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属（Cryptococcus）、有孢圆酵母属（Torulaspora）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、有孢汉生酵母菌属（Hanseniaspora）、洛德酵母属（Lodderomyces）、梅奇酵母属（Metschnikowia）、棒孢酵母属（Clavispora）、毕赤酵母属（Pichia）和锁掷酵母属（Sporidiobolus），且Rhodotorula（16.13%）、Hanseniaspora（16.13%）和Pichia（19.35%）为主要非酿酒酵母。非酿酒酵母中Torulaspora XM2（5.22 g/L）、Pichia K3（4.91 g/L）、Hanseniaspora HE3（4.63 g/L）和Pichia ML3（4.57 g/L）总酯含量较高。通过对其产酯关键酶活性的测定推测乙酸酯水解酶及醇乙酰基转移酶对酯类物质的生成可能有极大地影响。     

宁夏玉泉营地区酿酒葡萄酵母菌的分离筛选及分子鉴定

为进一步探究宁夏玉泉营地区酿酒葡萄酵母菌的多样性,更好地开发利用本土葡萄酒产区酵母菌资源,从宁夏玉泉营地区的葡萄园土壤、葡萄果实表皮以及葡萄自然发酵过程中进行酵母菌的分离筛选,对得到的22株酵母菌株运用WL营养琼脂培养基进行初步聚类分类,并采用26S rDNA D1/D2区序列分析法进行菌株鉴定。结果表明,供试菌株共鉴定为6种,分别为大隐球酵母（Cryptococcus magnus）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）。     

产香酵母的筛选及其苹果酒发酵特性

从分离自赤霞珠葡萄酿酒不同时期发酵液中的酵母菌中筛选产香菌株,并对其苹果酒发酵特性进行研究。结果表明,经感官评定初筛,获得7株产香较优的酵母菌,并对其进行耐酒精、耐SO2和耐盐性能分析,其中菌株B2-13具有较好的发酵性能,经分子生物学鉴定菌株B2-13为葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。菌株B2-13发酵苹果酒酒精度为4.2%vol～5.5%vol,糖度为2.6～44 g/L,共鉴定出32种香气成分,主要有酯类（6种）、醛酮类（4种）、醇类（6种）、酸类（8种）等,其中异戊醇、苯乙醇含量最高,分别为0.36 mg/mL和0.16 mg/mL,另外还有赤霞珠干红葡萄酒的特有香气物质3-羟基-2-丁酮（0.16 mg/mL）。菌株B2-13是一株具有较好的苹果酒发酵和产香性能的酵母菌株,有良好的工业化生产应用前景。     

河南不同地区赤霞珠葡萄表皮酵母菌多样性研究

该研究采用富集分离方法,从河南省内不同地区（安阳、长垣和漯河）葡萄种植园的赤霞珠葡萄表皮分离酵母菌,并利用分子生物学技术结合形态观察对菌株进行鉴定。结果表明,共分离得到193株酵母菌,为10种表型,且被鉴定为4个属6个种,分别为仙人掌有孢汉逊酵母（Hanseniaspora opuntiae）、葡萄有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）、橡树假丝酵母（Candida quercitrusa）、葡萄酒有孢汉生酵母（Hanseniaspora vineae）和Pichia terricola。其中,H. opuntiae和H. uvarum分布范围广,且漯河地区所蕴含的酵母菌种类最多。不同地区的赤霞珠葡萄表皮蕴含着多种类型的酵母菌资源,且不同地区的酵母菌种类及数目上的分布存在一定差异。     

葡萄酒相关酵母β-葡萄糖苷酶活性及影响因素研究

以内蒙古西部地区分离到的6个属7个种共340株葡萄酒相关酵母菌株为材料,对产β-葡萄糖苷酶菌株进行初筛,进而采用对 硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法检测菌株胞外、胞壁结合及胞内β-葡萄糖苷酶活力,并对高酶活性菌株中β-葡萄糖苷酶的理 化性质进行了研究。 结果表明,分属5个属5个种（葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）及星形假丝酵母（Candida stellata））的66株酵母菌株产β-葡萄 糖苷酶,且胞内酶活性均高于胞壁结合酶活性;不同菌株中β-葡萄糖苷酶具有相同的理化性质,4%以上葡萄糖可抑制该酶的活性, 5%～15%（V/V）的乙醇添加量对该酶活性无明显影响,其最适pH值为5.0～6.0,最适温度为40 ℃。     

产蛋白酶酵母菌的选育及酶学特性

在葡萄酒自然发酵过程中,在发酵初期非酿酒酵母菌占主导地位,蛋白酶可将葡萄汁中的蛋白质水解成可溶性肽和氨基酸,利于葡萄酒的澄清和稳定,同时对陈酿期间的酵母自溶也有着重要的作用。本研究通过对新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中非酿酒酵母菌的筛选,得到1株产蛋白酶能力较强的菌株;紫外-微波复合诱变后,酶活力增加1.47倍;经26S r RNA基因序列分析鉴定为葡萄汁有孢汉生酵母XYN162(H.uvarum XYN162);酶学性质研究表明:所产蛋白酶最适p H为8.0,在p H为7.0~8.0时酶活性保持在90%以上;酶的最适作用温度为37℃,在35℃酶活力保持较好;Fe2+、Ca2+对酶有不同程度的激活作用,Mg2+、Cu2+对酶有明显的抑制作用,说明此菌株所产的蛋白酶对金属离子具有依赖性。以上数据确认该菌为产蛋白酶葡萄汁有孢汉生酵母。     

4 株本土非酿酒酵母的发酵特性

对分离于我国3 个葡萄酒产区的葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）CVE-HU36、葡萄园有孢汉逊酵母（H. vineae）CVE-HV6、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）CVE-MP20和陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）CVE-IT8共4 株非酿酒酵母菌株进行纯种发酵实验,以酿酒酵母BDX为对照,比较4 株非酿酒酵母的发酵和产香特点。结果表明,4 株非酿酒酵母菌株中CVE-HV6菌株生长能力最强、具有最大的发酵速率,并高产甘油和乙醇;CVE-HU36菌株合成乙酸能力最强;CVE-MP20菌株具有最低的乙醇产率;CVE-IT8菌株苹果酸产量较高。不同非酿酒酵母菌株的产香能力存在明显差异：CVE-HV6菌株产乙酸苯乙酯、苯乙醇和癸酸能力显著高于酿酒酵母和其他3 株非酿酒酵母,其中乙酸苯乙酯含量为酿酒酵母的3.04 倍;CVE-HU36菌株的β-香茅醇含量高于酿酒酵母（2.05 倍）和其他3 株非酿酒酵母;CVE-MP20菌株在5 株酵母菌中产乙酸乙酯和α-萜品醇能力最高,且高产异丁醇;CVE-IT8菌株高产辛酸和4-乙基愈创木酚。4 株非酿酒酵母具有不同的发酵性能和产香特性,综合来看,CVE-HV6菌株的酿造特性要优于其他3 株菌,在提升葡萄酒香气和改善品质方面具有较好的应用潜力。     

宁夏贺兰山东麓酿酒酵母分离筛选及菌株鉴定

为进一步探究宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄酵母菌的多样性,更好开发利用葡萄产区酵母菌资源。从宁夏贺兰山东麓的西夏王陵、红寺堡、玉泉营、青铜峡、张裕十五世酒庄地区的葡萄园土壤、葡萄浆果表皮以及葡萄自然发酵过程中进行酵母菌的分离筛选,对得到的122株酵母菌株运用WL营养琼脂培养基进行初步分类,同时结合26S r DNA D1/D2区序列分析。共鉴定出克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大隐球酵母(Cryptococcus magnus)共5种酵母菌。进而初步确定宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄产区酵母菌的主要种类,为地方特色葡萄酒酵母菌的筛选和选育提供理论基础和研究依据。     

基于途径分析的产甘油有孢汉逊酵母菌株的选育

以葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）GF-23为出发菌株,对其甘油的合成代谢途径进行分析并提出育种策略。 对 菌株GF-23进行诱变筛选,最终得到一株耐高渗高产甘油的葡萄汁有孢汉逊酵母突变菌株GY-1。结果表明,突变菌株GY-1的耐氯化 钠质量浓度达到50 g/L,在酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基中培养2 d时,甘油产量为0.44%,是出发菌株的3.33倍;接种在葡萄汁中 发酵6 d后,甘油产量达到0.49%,是出发菌株的4.45倍。 葡萄发酵液中的残糖量为3.03 g/L,酒精度为3.86%vol,说明突变菌株GY-1能 够适用于葡萄酒的发酵。 对突变菌株连续传代5次以上,其遗传性状稳定且甘油产量均无明显变化。     

昌黎产区产酶酵母多样性及其应用潜力分析

利用优选酵母混菌发酵,是改善葡萄酒品质及增香的有效途径。以赖氨酸培养基、WL培养基和产酶筛选培养基为基础,分析了昌黎4个葡萄园土样中产酶酵母的多样性,结果表明,该地区产酶酵母丰富,50%的产酶酵母能同时产2种或2种以上的酶。对产酶酵母酿造因子耐性分析表明,菌株GY1、M9和J24具有高糖耐性,适合于高糖低醇果酒酿造;菌株GY13和M9具有高酒精耐性,酒精含量为15.000%时活性较强;菌株J24和GY1具有高酸耐性,pH 2.5时具有较高活性;7株菌15℃时具有较高活性。综合分析发现,菌株M9(Torulaspora delbrueckii)同时产β-葡萄糖苷酶、果胶酶和纤维素酶,除酸耐性较差外,具有高糖、高酒精度和低温耐性,在高糖低醇果酒酿造中具有很大应用潜力。     

一种猕猴桃果酒专用酵母的高效筛选方法

为探索猕猴桃果酒专用酵母的筛选方法,提高果酒品质,以雅安红阳猕猴桃为原料,从自然糖度（150 g/L）和添加白砂糖达到高糖度（350 g/L）的两组猕猴桃汁发酵液中筛选酵母,对其发酵性能进行测定,并通过微生物质谱检测对其进行菌种鉴定。结果表明,经一级筛选,各分离出3株菌株,编号分别为ZR-1、ZR-2、ZR-3及GT-1、GT-2、GT-3,其中菌株ZR-1及ZR-3被鉴定为柠檬形克勒克酵母（Kloechera apiculate）,其他菌株均被鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。菌株GT-2发酵力最持久,产酒精力最强,发酵液中酒精度达9.5%vol,且对150 mg/L的SO2和pH=3.0的酸性环境的耐受性最强;菌株GT-1对12%vol酒精耐受性最强,原酒感官评分最高。说明以高糖启动自然发酵,从中筛选酵母简便且准确度高,可作为猕猴桃果酒专用酵母的高效筛选方法。     

一株低产高级醇桑椹果酒酵母的分离、鉴定

以桑椹为分离源,从其自然发酵醪液中分离得到35株酵母菌,采用杜氏小管发酵法初筛,产乙醇能力复筛,耐乙醇和SO₂能力三级筛选,再与葡萄酒活性干酵母的发酵性能和高级醇产生量进行比较,得到1株发酵性能优良且高级醇产生量低的桑椹果酒酵母—S-2。对S-2菌种进行的研究表明,该菌在12 h开始产气,48 h后产生的气体充满杜氏小管,在14%乙醇和120 mg/L SO₂的胁迫下仍有较好的发酵表现,该菌在正常情况下发酵产生的乙醇含量高达10.56%,且高级醇产生量为312.41 mg/L。采用18S rDNA对其进行序列鉴定,确定其与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)同源性最高,相似度达到100%。该菌完全可以取代葡萄酒酵母专门用于桑椹果酒的发酵。     

野生苹果酒产香酵母的分离及筛选

从苹果园土壤中经多次稀释涂布分离出多株酵母菌,根据菌落形态、显微观察以及平皿的香味评定初筛出4株产香酵母,通过性能测定,测出这4株菌能耐受160 mg/LSO2和10%vol酒精度。然后经混合发酵试验所得苹果酒综合评价,筛选出J-4号菌较其他菌株更适合作为苹果酒酿造的产香酵母,其发酵所得苹果酒品质优,具有苹果酒的典型风味,适用于苹果酒生产。对J-4进行分子鉴定,鉴定结果表明其为孢汉逊酵母属,与Hanseniaspora thailandica AB501147.1为同一种。     

耐高渗酵母选育及其在葡萄酒中的应用研究

高醇、高糖、高硫等条件会影响酵母菌的生物活性。为筛选出耐高酒精度、高糖度、高SO2浓度的葡萄酒酿造优良菌株,该实验采集葡萄酒糟、黄酒糟、酒醅,经过富集筛选分离纯化得到8株酵母菌,经高酒精度、高糖度、高SO2耐受试验后初步筛选出2株菌株,一株耐高糖,在含糖量60%条件下21.5 h仍可启动发酵;一株耐高酒精度,在酒精度20%vol条件下21.3 h仍可启动发酵;2株菌株均可在300 mg/L SO2条件下在6.7 h启动发酵。经生理生化试验初步鉴定两株菌分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和膜醭毕赤氏酵母（Pichia membranefaciens）。在浓缩葡萄汁初始糖含量28%条件下接种酿酒酵母,高泡期补料至含糖量34%接种膜醭毕赤氏酵母,20 ℃发酵15 d,得到的葡萄酒酒精度为18.1%vol。     

冰酒中的毕赤属和汉逊属酵母菌的筛选及其在葡萄酒酿造中的应用

从冰葡萄酒自然发酵过程中分离、鉴定出10株毕赤属(Pichia)和汉逊属(Hanseniaspora)酵母,对其耐受性(酒精、糖、酸、SO2)进行研究,筛选得到4株耐受性能优良的酵母菌株,编号为"HO"和"HU"(Hanseniaspora属)、"PO"和"PK"(Pichia属)。再将此4个酵母菌株与商业酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)按不同比例(1:1和10:1,1:1编号为1,10:1编号为2),先接种非酿酒酵母菌株,48 h后再接种酿酒酵母的顺序进行混合发酵。研究了发酵过程中菌群及乙醇的动态变化,又对发酵结束后冰葡萄酒的主要成分进行分析。结果显示:"HO"随接种量的增加菌落数受到抑制,"HU""PO"及"PK"随接种量的增大菌落数受到促进作用;HO1、HU1、HU2、PK1、PK2乙醇含量在发酵前期增长较少,在发酵中期迅速增大,HO2、PO1、PO2乙醇含量在发酵前期增长较多,在发酵中期显著增大,所有发酵乙醇含量皆于第21天稳定在9%左右;"HO""HU""PO"及"PK"不同比例混合发酵各理化指标(酒精度、总糖、总酸、有机酸)均符合国家葡萄酒标准,"HU"乙酸含量过高,葡萄酒品质中含有缺陷。以上结果表明4株酵母菌株均可应用于本土葡萄酒的酿造中,为生产具有本地特色的葡萄酒提供一定的参考。     

靖州杨梅果酒发酵菌种筛选、鉴定及发酵性能研究

以不同杨梅园杨梅鲜果、杨梅叶和果园土壤为原料,共分离得到172株酵母菌。采用显色法、杜氏管法、糖发酵法和杨梅酒发酵法进行四级筛选,获得3株综合性能优良的菌株;经形态学、分子生物学鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RY1、仙人掌有孢汉逊酵母(Hanseniaspora opuntiae)DY5与有孢汉逊酵母(Hanseniaspora pseudoquilliermondii)JW14。通过发酵性能研究发现,3株酵母均能耐受可溶性固形物含量(SSC)为32%、SO_2添加量为200mg/L、酒精含量为16%Vol、pH为2.0的环境;RY1酵母具有较强的发酵性能及耐受能力,适宜发酵杨梅果酒,DY5和JW14酵母具有较好的产香能力,适宜辅助发酵为杨梅酒增香。     

水晶葡萄酿酒酵母菌的分离筛选及酿酒性能研究

以水晶葡萄为原料,通过杜氏管产气试验、耐受性试验分离筛选优良酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,采用分子生物学技术对其进行鉴定,并研究其酿酒性能。结果表明,筛选出两株优良酵母,分别命名为SJJM-7和SJJM-18;两株菌对糖、低pH值、乙醇和SO2的耐受性较强,均能在50%糖度、12%vol乙醇及200 mg/L SO2的培养基中生长并发酵产气;在pH值2.0的培养基中培养2 d,菌体存活率均＞20%;菌株SJJM-7和SJJM-18均被鉴定为酿酒酵母（S. cerevisiae）;利用这两株菌株发酵水晶葡萄汁后,菌株SJJM-7和SJJM-18的酿酒性能（澄清度、挥发酸含量、残糖量及酒精度）优于进口商品酵母菌株LA-PE,在生产水晶葡萄酒方面具有一定的研究意义和应用价值。     

桑葚酒用非酿酒酵母的筛选及特性研究

为筛选出适合桑葚酒发酵的非酿酒酵母,改善桑葚酒的口感及香味,以桑葚及桑园土壤样品中筛选得到的72株酵母菌为出发菌株,经杜氏管发酵、酒精发酵与感官品评进行初筛。将初筛得到的酵母分别与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BO213按1∶1的比例接种到桑葚汁中发酵,通过感官品评与理化分析优选出一株非酿酒酵母JM-7,经鉴定该酵母为异常威克汉逊酵母（Wickerhamomyces anmalus）。其与菌株BO213混酿的桑葚酒感官评分为90.2分,总酯含量为3.21 g/L,还原糖含量为3.9 g/L,酒精度、总酸、挥发酸含量分别为11.7%vol、7.97 g/L、0.51 g/L。研究菌株JM-7生长曲线及耐受性发现,该酵母生长速率快,5 h即进入对数期,36 h达到稳定期,最高菌体浓度为4.5×108 CFU/mL,对温度、pH、SO2都有较好的耐受性,在16～36 ℃、pH 2～10、SO2质量浓度0～100 mg/L均能正常生长,但对酒精的耐受性较差,在酒精度为8%vol时生长受到抑制,在12%vol时不能生长。