添加肉类蛋白对米酒乳杆菌生境适应相关基因表达的影响

米酒乳杆菌是常见的异型发酵乳酸菌,它常常用作肉类工业发酵剂。为了了解其在肉类环境中的生存状况,本文用定量PCR对米酒乳杆菌La22在添加肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的培养基中生长时生境适应相关基因表达量进行分析。结果显示,在两种培养基中生长时,p H值均随时间的延长而下降,在添加肌浆蛋白的培养基略高于添加肌原纤维蛋白培养基。与对照相比,在添加肌浆蛋白培养基中的arc A、arc B、arc C、arc T以及添加肌原纤维蛋白培养基中的arc R基因表达量明显上调,其余几个arc基因也均上调,但不明显;压力相关基因lsa00513、usp4以及usp2在肌浆蛋白培养基中均明显上调;有6个ABC转运子基因在添加两种肌肉蛋白的培养基中表达量明显上调。结果表明米酒乳杆菌能通过能量转换与基因表达调节来适应含肉类蛋白的培养环境。     

酸奶后酸化中保加利亚乳杆菌关键基因表达分析

酸奶中的乳酸菌能将大分子蛋白质分解成人体易吸收的小分子营养物质,这对人体具有很重要的保健功能,然而酸奶的后酸化问题不仅严重影响风味,还大大缩短了酸奶的货架期,阻碍了我国酸奶行业的发展。研究证明,控制保加利亚乳杆菌在酸奶发酵后期的生长代谢,是解决酸奶后酸化的关键。本文在研究模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842在复原脱脂乳培养基中生长和产酸特性的基础上,利用半定量RT-PCR技术,分析酸奶后酸化中保加利亚乳杆菌不同时期关键基因表达的差异,选取后酸化过程中表达变化明显的丙糖异构酶基因,通过对该基因的过量表达,探究该基因在酸奶后酸化过程中的功能。结果表明,大多数关键基因受到后酸化的影响而上调或下调,其中丙糖异构酶基因过量表达后影响菌株产酸和生长。     

氨基酸对植物乳杆菌KLDS1.0391生长及细菌素合成的影响

为探究氨基酸对植物乳杆菌生长及细菌素合成的影响，调节化学成分确定培养基中的氨基酸组成，培养植物乳杆菌KLDS1.0391，采用高效液相色谱法测定乳酸含量，通过实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析细菌素和氨基酸合成相关基因的表达。结果表明，天冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺的缺失导致该菌生长能力和细菌素合成量均显著降低（P＜0.05）；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、色氨酸及缬氨酸的缺失仅影响菌体生长，对细菌素合成无明显影响；而赖氨酸胁迫（缺失及过量）对菌体的生长影响很小，但却显著影响细菌素的合成。色谱结果显示，赖氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸及苏氨酸单缺失后乳酸含量升高。real-time PCR结果表明，细菌素合成相关基因plnEF、plnD及plNC8HK因赖氨酸的缺失表达显著下调（P＜0.05），而上述基因在外源赖氨酸质量浓度达到2.0 g/L前，上调水平随赖氨酸添加量的增大而增大。氨基酸合成关键基因dapG、yclM 因赖氨酸缺失表达显著上调，相反，上述基因在赖氨酸质量浓度为2.0 g/L时表达量显著下调（P＜0.05）。由上述研究结果推测，当赖氨酸缺失时，菌体通过上调基因dapG 和yclM 的表达以合成多种蛋白质保证其正常生长代谢，赖氨酸可正向诱导该菌细菌素合成，其可能作为细菌素合成底物发挥作用。     

基于蔗糖代谢途径分析保加利亚乳杆菌的后酸化性能

弱后酸化能力是乳酸菌作为发酵剂使用时的重要特性。为研究保加利亚乳杆菌蔗糖代谢途径对发酵乳后酸化起到的作用，该研究比较了五株保加利亚乳杆菌的后酸化性能，分析了保加利亚乳杆菌的生长情况、糖代谢和产酸能力，探究了蔗糖代谢产酸相关基因的差异表达及关键酶活性，并研究了外源添加蔗糖代谢关键酶前后保加利亚乳杆菌的生长情况。结果表明，Lb. 1后酸化能力最弱，在以蔗糖为碳源的培养基中生长缓慢，KLDS 1.0207后酸化能力最强。发酵24 h后，二者蔗糖转化率分别为5.85%和85.39%，乳酸含量分别为1.13 g/L和11.81 g/L。在含双糖（乳糖:蔗糖=1:1.5）的MRS培养基中生长时，KLDS 1.0207蔗糖代谢途径中基因sacA、pgi、gap、pgk、ldh表达量极显著高于Lb. 1（P<0.01），KLDS 1.0207蔗糖酶活性显著高于Lb. 1（P<0.05），达到1.31 U/mg。在Lb. 1的蔗糖培养基中补充蔗糖酶后，OD600 nm增至原来的5倍。因此，蔗糖酶活性对保加利亚乳杆菌代谢蔗糖至关重要，编码蔗糖酶的sacA基因表达下调显著减弱蔗糖酶活性，菌株后酸化能力明显下降。     

不同初始pH值对保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达的影响

由于保加利亚乳杆菌自身不能直接利用外源蛋白,其必须通过蛋白水解体系外源蛋白质,生成供菌体正常生长需要的短肽和游离氨基酸。选择具有高蛋白水解活力的6株保加利亚乳杆菌作为供试菌种。将菌株接种于不同初始pH值的灭菌脱脂乳中,在m RNA转录水平上,应用实时荧光定量PCR技术,探讨保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因表达情况。结果表明:在脱脂乳体系中,初始pH值对保加利亚乳杆菌蛋白水解关键酶基因的表达存在显著影响,随着初始pH值的升高菌株KLDS 1.0501,1.9201,1.9203和1.0208的各基因表达量均上调,在pH=6.5时,部分基因表达量继续上调,且各菌株间蛋白基因表达有较大差异。     

氮源对保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达的影响

选择6株保加利亚乳杆菌(KLDS 1.0207,1.0501,1.1007,1.9201,1.9203,1.0208)进行脱脂乳发酵。应用RT-PCR技术,在mRNA转录水平上,探讨不同氮源对保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因(prtB,oppD,pepC,pepF,pepQ,pepX,pepT)表达的影响。结果表明:在12%脱脂乳中培养12 h,6株保加利亚乳杆菌菌株间的蛋白水解活力存在显著差异(P0.05);在脱脂乳体系中,添加大豆蛋白胨可以显著下调prt B基因表达(P0.05),添加酪蛋白胨显著下调6株菌pepC,pepF,pepQ,pepX,pepT基因表达(P0.05);opp D在不同菌株中的基因表达量趋势不完全相同。添加酵母浸提物,基因的表达量整体呈上调趋势,只有菌株KLDS 1.0208的各目的基因表达量显著下调(P0.05)。6株菌的蛋白酶基因表达量受培养基质中氮源影响,各基因表达依赖肽供给。     

AI-2的体外合成及其对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的影响

本文采用单因素实验,优化AI-2合成的孵育温度、pH、酶浓度以及孵育时间。利用优化的合成条件,成功合成具有生物活性的AI-2,活性约为阳性对照的2倍。添加合成的AI-2到MRS培养基中,研究AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391生长和细菌素合成的影响,并采用实时荧光定量PCR分析培养15 h的植物乳杆菌KLDS1.0391的细菌素结构基因pln EF的转录水平。结果表明:AI-2合成的最优条件为:0.5 mg/m L Pfs蛋白、1.0 mg/m L Lux S蛋白、2 mmol/L SAH,p H7.5,37℃孵育5 h。添加合成的AI-2对植物乳杆菌的生长无明显影响;培养3 h后,相同培养时间时添加AI-2的实验组对枯草芽孢杆菌ATCC6633的抑菌圈直径显著高于空白对照和阴性对照组(p0.01);添加AI-2的实验组的pln EF基因的表达量上调至空白对照的2.89倍。本研究成功优化AI-2的体外合成条件;添加合成的AI-2对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成有促进作用,且这种促进作用可能与pln EF基因转录水平上调有关。     

干酪乳杆菌Zhang在逆境条件下基因表达的差异分析

为了探讨益生菌干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH值胁迫下转录水平上的基因表达差异。本文选取干酪乳杆菌Zhang中与糖代谢、氨基酸代谢、细胞膜脂肪酸以及应激蛋白等相关的12个主要基因为研究对象,将干酪乳杆菌Zhang用MRS液体培养基活化3代后置于4℃条件下进行逆境胁迫,间断性取样,采用反转录PCR对选定基因的表达水平进行动态监测。结果表明,干酪乳杆菌Zhang在低温、低pH值胁迫下,3个糖代谢相关基因(苹果酸乳酸酶基因、6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶)、1个细胞膜脂肪酸相关基因(环丙烷脂肪酸合成酶基因)、1个应激蛋白相关基因(分子伴侣Gro EL基因)共5个基因表达上调;而DNA引发复制酶基因、3个氨基酸代谢相关基因(阳离子转运酶基因、D-谷氨酸代谢基因、ABC转运体ATP结合蛋白基因)、2个细胞膜脂肪酸基因(磷脂合成基因、短链醇脱氢酶基因)、磷酸转移酶系统丝氨酸特异性转运蛋白基因等7个基因表达下降。这为解析干酪乳杆菌Zhang在胁迫条件下的生理、生化特性的改变及其抗性机制提供了参考依据。     

植物乳杆菌发酵盐渍辣椒汁培养基的优化

将盐渍辣椒汁作为植物乳杆菌发酵培养基主料,添加不同的碳源、氮源、磷源,通过单因素和正交试验确定碳源、氮源、磷源的最优添加量与配比,得出盐渍辣椒汁发酵培养基培养植物乳杆菌的最优条件。结果表明,接种1%的植物乳杆菌培养24h后,在葡萄糖添加量为2.5%,细菌学蛋白胨添加量为2.5%,磷酸氢二钠添加量为0.2%,培养温度为37℃,初始pH值为自然条件的培养基中植物乳杆菌生长最好。     

猪肉蛋白和牛肉蛋白对生长期大鼠生理功能的影响

目的：研究长期摄入猪肉蛋白和牛肉蛋白对生长期大鼠生长性能、生理功能的影响。方法：30 只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为3 组,分别饲喂添加酪蛋白、猪肉蛋白和牛肉蛋白作为蛋白质来源的半合成饲料,实验期为90 d,观察其对大鼠生理指标的影响。结果：相对于酪蛋白组,猪肉蛋白组和牛肉蛋白组大鼠的生长速率变缓,脂肪沉积减少（P＜0.05）,但有较高的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活力（P＜0.05）。猪肉蛋白和牛肉蛋白可降低大鼠血清中的甘油三酯浓度（P＜0.05）,牛肉蛋白还可降低总胆固醇和血糖浓度（P＜0.05）,猪肉蛋白则对其没有显著影响（P＞0.05）。猪肉蛋白组和牛肉蛋白组的大鼠有较低的血清游离氨基酸水平（P＜0.05）。结论：长期摄入猪肉蛋白和牛肉蛋白会对大鼠机体代谢产生不同的影响,这与蛋白质来源及其消化和吸收有关。猪肉蛋白和牛肉蛋白有控制大鼠体质量增长的作用,牛肉蛋白还可以降低大鼠肝脏代谢水平,具有降血脂的功能。     

茯苓固态发酵产物对益生菌增殖效果初探

通过测定菌体培养液吸光值的方法,进行茯苓发酵产物提取液(FPE)对乳杆菌和双歧杆菌的增殖效果体外实验。结果表明:与异麦芽低聚糖(IMO)和低聚果糖(FOS)相比,添加了FPE的培养基可以更好的促进双歧杆菌的生长(P 0.01),说明FPE可以作为一种双歧因子,促进双歧杆菌的增殖。培养基中FPE的浓度为2.5%～5%时对双歧杆菌和乳杆菌的增殖效果最好。在添加了FPE的培养基中生长的双歧杆菌的生长迟缓期较在未添加的基础培养基中更短,添加FPE的培养液的吸光值明显大于未添加培养液(P0.01),说明发酵产物提取液可以作为一种有效的益生元促进二者生长。     

氮缺乏对保加利亚乳杆菌胞内肽酶基因表达的影响

试验选取保加利亚乳杆菌作为研究对象,探讨氮缺乏对保加利亚乳杆菌蛋白水解体系中关键蛋白酶基因表达的影响。试验采用qRT-PCR技术分析7株保加利亚乳杆菌中pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT胞内关键肽酶基因在氮缺乏培养条件下的基因表达情况。研究结果表明,氮缺乏培养条件下,pepF基因表达量比MRS液体培养条件下显著上调(P0.05),平均上调3.2倍,而pepX和pepC基因表达水平呈显著下调趋势(P0.05);氮缺乏培养条件下,菌株LB08006、LB08007和LB08015中pepT和pepQ基因表达量上调,而在菌株LB08012、L08014、LB08016和LB08017中pepT和pepQ基因表达量则是下调的。可见,氮缺乏显著影响保加利亚乳杆菌胞内肽酶基因表达,且在不同菌株间表现出不同的表达量。     

酸、热胁迫条件下酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因的表达分析

本研究在克隆得到酸土脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T SOD基因全序列的基础上,利用荧光实时定量PCR技术分别检测酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因在酸、热胁迫条件下的表达差异。结果表明:该基因在正常生长条件下组成性表达,在酸、热胁迫下表达量在短时间内迅速上调,酸胁迫0.5 h表达量为对照组的4.63倍,胁迫1 h表达量升至最高,为对照组的32.55倍,随后表达量迅速下调,胁迫5 h时表达量降至对照组的1.67倍。70℃热胁迫5 min时SOD基因相对表达量为对照组的2.81倍,胁迫25 min时表达量升至最高,为对照组的15.05倍,随后表达量下调,胁迫40 min时表达量降至对照组的4.93倍。酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因对酸、热环境胁迫具有快速反应的特点,表明酸土脂环酸芽孢杆菌SOD基因与该菌嗜热耐酸的独特生理适应机制密切相关。     

响应面法优化甜米酒酸菜发酵工艺

以青菜为原料,通过发酵乳杆菌（Lactobacillus fermenti）FY1及短乳杆菌（Lactobacillus brevis）FY2发酵甜米酒酸菜。在单因素及PB试验的基础上,利用响应面优化设计甜米酒酸菜的发酵工艺。结果表明,甜米酒酸菜制作的最佳工艺为食盐添加量4.0%,白砂糖添加量6.2%,甜米酒添加量15.6%,室温条件下发酵9 d。在此优化条件下,甜米酒酸菜感官评分92.3分,理化及卫生指标均符合国家标准。     

低聚果糖对干酪乳杆菌生长和代谢的影响

为研究干酪乳杆菌体外利用低聚果糖的生长代谢过程,分别以0.5%、1.5%、3%低聚果糖替代0.5%葡萄糖作为培养基碳源,取0、4、8、12、18、24h发酵液测p H、菌落数、代谢产物。结果表明:随着培养时间的延长,培养基中p H降低;0.5%低聚果糖培养基中干酪乳杆菌数量在8h时达到最高值,增加低聚果糖浓度到1.5%,干酪乳杆菌的数量随之增加;继续增加低聚果糖浓度到3%,干酪乳杆菌数量没有明显差异(p0.05)。干酪乳杆菌代谢低聚果糖在4h时乙酸产量达到最高值,且3%低聚果糖培养基中乙酸产量是0.5%、1.5%低聚果糖的2倍;乳酸产量随着培养时间的延长逐渐积累,3%低聚果糖培养基中乳酸产量最多,干酪乳杆菌利用低聚果糖的主要代谢产物为乙酸和乳酸。     

6种益生菌及其添加方式对发酵米酒品质的影响

目的:探究不同益生菌及其添加方式对米酒制作效果的影响。方法:以糯米为原料,通过外源添加鼠李糖乳杆菌BV-77、发酵乳杆菌TSF-331、唾液乳杆菌AP-32、约氏乳杆菌MH-68、嗜酸乳杆菌TYCA-06、干酪乳杆菌CS-773酿制益生菌米酒,对比只添加糖化酶、同时添加糖化酶和酵母以及添加方式(益生菌麸曲和益生菌菌粉)对米酒酒精度、还原糖、总酸和感官质量的影响。结果:酵母对益生菌米酒的发酵有促进作用,可显著提高米酒酒精度和还原糖含量。利用发酵乳杆菌菌粉同时添加用量为200 U/g的糖化酶和0.04%的酵母,在30℃发酵3 d的米酒发酵效果最佳,酒精度和还原糖含量达到最高,分别为7.20%vol和270.00 mg/mL,总酸含量达到最低,为8.40 mL/L,酿造出的米酒口感较为浓郁。结论:发酵乳杆菌是6种益生菌中最适宜酿造米酒的益生菌。     

胆盐水解酶基因在植物乳杆菌KLDS1.0386中的表达研究

本文从转录水平上研究了四种胆盐水解酶基因在植物乳杆菌KLDS1.0386中不同生长阶段的表达情况,并且分别以不同浓度的牛磺脱氧胆酸盐和甘氨脱氧胆酸盐为底物,以16s r RNA作为内参基因,利用实时荧光定量PCR技术研究不同浓度底物下的胆盐水解酶基因(bsh1、bsh2、bsh3、bsh4)表达的变化规律。结果显示,内参基因和目的基因的扩增效率均在90%~105%之间,说明目的基因的表达量可以被很好的反应出来。通过实时荧光定量PCR结果分析可知,植物乳杆菌KLDS1.0386中的4种胆盐水解酶基因随着生长时间的延长,表达量显著增加,而且在两种胆盐中都表达,基因表达量都被不同剂量(1%、2%、3%)的胆盐上调,上升幅度随着胆盐浓度的增加表现出极显著的增加趋势,而且胆盐不同,同浓度时每个基因的表达量也各不相同,在甘氨脱氧胆盐中的表达量普遍高于牛磺脱氧胆盐。     

双向电泳技术在副干酪乳杆菌盐胁迫应激反应研究中的应用

对耐盐副干酪乳杆菌在盐胁迫下的应激反应进行研究,比较其在含有6g/dL NaCl和未含有NaCl的培养基中生长至对数生长中期的蛋白质组双向电泳图谱差异。结果表明:有20个蛋白质点表达发生明显变化,经过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱鉴定,其中热休克蛋白质GroEL和DnaK在盐胁迫下表达上调,参与脂肪酸合成的3-氧酰基-(酰载体蛋白)合酶FabG表达下调,可能与该菌应对盐胁迫密切相关。     

干酪乳杆菌DI-1发酵产胞壁蛋白酶的培养基优化

采用Plackett-Burman和Box-Behnken方案,对影响干酪乳杆菌DI-1产胞壁蛋白酶(CEP)的MRS培养基成分进行筛选,结果表明,当在MRS培养基中添加磷酸氢二钾2.78g/L,柠檬酸二铵2.92g/L和乙酸钠4.36g/L时,CEP活性显著提高,此时酶活性为11.36U/mL,比基本MRS培养基提高了63.68%。在氨基酸和鸭肉水解肽添加试验中,当基础培养基中分别添加0.1g/L的精氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺时,CEP的活性从6.94U/mL提高到11.11U/mL;当添加木瓜风味复合蛋白酶水解鸭肉蛋白多肽时,CEP活力提高到13.89U/mL。     

诱变酒酒球菌中抗酸候选基因ATPase和FtsH的表达差异分析及功能验证

为研究胁迫条件下具有不同表达趋势的抗酸候选基因ATPase和FtsH是否可以提高菌株的抗酸性,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定诱变酒酒球菌抗酸菌株b1和酸敏菌株b2中ATPase和FtsH在pH 4.8(最适条件)和pH 3.0(胁迫条件)ATB培养基中的相对表达量,分析其表达趋势;从b1中克隆ATPase和FtsH,分别命名为ATPase1和FtsH1,从b2中克隆ATPase和FtsH,分别命名为ATPase2和FtsH2,分析序列差异;将ATPase1,ATPase2,FtsH1和FtsH2分别在植物乳杆菌XJ25中做功能验证,构成重组植物乳杆菌a1,a2,f1和f2。以含空载体的植物乳杆菌con为对照,于pH 3.2的MRS培养基中测定重组植物乳杆菌的生长能力。定量结果表明ATPase在菌株b1和b2中表达量均显著上调;FtsH在b1中不变,在b2中显著上调。ATPase1和ATPase2在功能结构域内有3处非同义突变,FtsH1和FtsH2在跨膜结构域内有1处非同义突变。功能验证结果表明:a1和a2的生长能力均强于con,且a1和a2生长能力无差异;f1生长能力强于con,f2生长能力与con无差异。由此可知ATPase1,ATPase2和FtsH1均可以提高菌株抗酸性。