不同生长阶段保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达变化规律

乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白质,必须通过蛋白水解体系水解外源蛋白质,生成供菌体正常生长需要的短肽和游离氨基酸。该研究选择6株保加利亚乳杆菌(KLDS1.0207、1.0501、1.1007、1.9201、1.9203、1.0208)进行脱脂乳发酵,在mRNA转录水平上,应用实时荧光定量PCR技术,探讨保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)在菌体不同生长阶段表达的动态变化。结果表明,所有菌株生长曲线均呈S型。随着菌体在脱脂乳中的不断生长,蛋白水解活力极显著增强(P<0.01),7个目的基因相对表达量呈现总体上调。6株菌的prtB和oppD基因在对数期的相对表达量极显著高于对照组(4h)(P<0.01)。对数期的胞内肽酶基因(pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表达量与对照组(4 h)相比,呈极显著上调(P<0.01),但菌株KLDS 1.0207的pepQ基因在对数期下调,而稳定期上调。由此可见,蛋白水解活力较高的菌株,其生长和产酸特性也较高;发现在脱脂乳中培养保加利亚乳杆菌,其关键蛋白酶基因的表达量呈时间依赖性,且菌株间各蛋白酶基因表达量有较大差异。     

氮源对保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达的影响

选择6株保加利亚乳杆菌(KLDS 1.0207,1.0501,1.1007,1.9201,1.9203,1.0208)进行脱脂乳发酵。应用RT-PCR技术,在mRNA转录水平上,探讨不同氮源对保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因(prtB,oppD,pepC,pepF,pepQ,pepX,pepT)表达的影响。结果表明:在12%脱脂乳中培养12 h,6株保加利亚乳杆菌菌株间的蛋白水解活力存在显著差异(P0.05);在脱脂乳体系中,添加大豆蛋白胨可以显著下调prt B基因表达(P0.05),添加酪蛋白胨显著下调6株菌pepC,pepF,pepQ,pepX,pepT基因表达(P0.05);opp D在不同菌株中的基因表达量趋势不完全相同。添加酵母浸提物,基因的表达量整体呈上调趋势,只有菌株KLDS 1.0208的各目的基因表达量显著下调(P0.05)。6株菌的蛋白酶基因表达量受培养基质中氮源影响,各基因表达依赖肽供给。     

氮缺乏对保加利亚乳杆菌胞内肽酶基因表达的影响

试验选取保加利亚乳杆菌作为研究对象,探讨氮缺乏对保加利亚乳杆菌蛋白水解体系中关键蛋白酶基因表达的影响。试验采用qRT-PCR技术分析7株保加利亚乳杆菌中pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT胞内关键肽酶基因在氮缺乏培养条件下的基因表达情况。研究结果表明,氮缺乏培养条件下,pepF基因表达量比MRS液体培养条件下显著上调(P0.05),平均上调3.2倍,而pepX和pepC基因表达水平呈显著下调趋势(P0.05);氮缺乏培养条件下,菌株LB08006、LB08007和LB08015中pepT和pepQ基因表达量上调,而在菌株LB08012、L08014、LB08016和LB08017中pepT和pepQ基因表达量则是下调的。可见,氮缺乏显著影响保加利亚乳杆菌胞内肽酶基因表达,且在不同菌株间表现出不同的表达量。     

酸奶后酸化中保加利亚乳杆菌关键基因表达分析

酸奶中的乳酸菌能将大分子蛋白质分解成人体易吸收的小分子营养物质,这对人体具有很重要的保健功能,然而酸奶的后酸化问题不仅严重影响风味,还大大缩短了酸奶的货架期,阻碍了我国酸奶行业的发展。研究证明,控制保加利亚乳杆菌在酸奶发酵后期的生长代谢,是解决酸奶后酸化的关键。本文在研究模式菌株保加利亚乳杆菌ATCC 11842在复原脱脂乳培养基中生长和产酸特性的基础上,利用半定量RT-PCR技术,分析酸奶后酸化中保加利亚乳杆菌不同时期关键基因表达的差异,选取后酸化过程中表达变化明显的丙糖异构酶基因,通过对该基因的过量表达,探究该基因在酸奶后酸化过程中的功能。结果表明,大多数关键基因受到后酸化的影响而上调或下调,其中丙糖异构酶基因过量表达后影响菌株产酸和生长。     

保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌发酵夸克的工艺条件优化

以脱脂乳为原料,保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵剂制备夸克。以乳清OD500nm值、夸克校正产率及感官品质为评定指标,对凝乳酶添加量、CaCl2添加量、发酵剂嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌配比、切割pH值4个因素进行考察。在此基础上对夸克感官评分进行四因素两水平的正交试验。结果表明：在凝乳酶添加量0.015%、嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌配比3:2、CaCl2添加量0.02%、切割pH值为4.5时,所得夸克的感官评分最高,具有浓郁的奶香味,酸味清爽无颗粒感。     

德式乳杆菌保加利亚亚种的乳清蛋白利用能力比较

为了探究德式乳杆菌保加利亚亚种对乳清蛋白的利用能力,研究了8株德式乳杆菌保加利亚亚种菌株在乳清蛋白培养体系中的生长和产酸情况,发酵过程中氨肽酶Pep N、Pep C和Pep X活力变化及乳清蛋白主要组分β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白的利用情况,探讨了不同菌株氨肽酶活力变化与乳清蛋白水解能力之间的相关性。结果表明,在乳清蛋白培养体系中,最适宜菌株生长的初始p H是5. 5,该条件下菌株在3 h内快速生长到达稳定期。在发酵过程(12 h)中,3种氨肽酶活力均表现出先升高后降低的变化趋势,但不同菌株的酶活力之间存在显著差异性。8株菌株均表现出对α-乳白蛋白较强的水解能力(26. 93%～31. 33%),但对于β-乳球蛋白的水解能力存在菌株差异性,β-乳球蛋白的变异体A和B的水解率分别是10. 56%～22. 82%和9. 04%～23. 83%。菌株的氨肽酶活力与β-乳球蛋白的水解能力之间存在一定相关性,DQHXNS8L6和DQHXNS15M2在3 h内即能达到最高的氨肽酶活力并有效水解β-乳球蛋白,具有发酵乳清蛋白饮料的应用潜力。     

蛋白酶水解脱脂乳培养基的优化

为减少进口发酵剂的使用,降低国内乳制品的生产成本,国内需要自主研发发酵剂,水解脱脂乳培养基的优化是发酵剂制备过程中的一个重要环节。为制备有利于乳酸菌生长的水解脱脂乳培养基,本研究首先以发酵乳杆菌V9为试验菌种,筛选出水解脱脂乳最适的蛋白酶,再通过单因素与正交实验对制备脱脂乳水解液的温度、时间、pH值、加酶量进行优化。结果表明,最适水解条件为:在p H为8.5的12%脱脂乳中按25 U/mL接入碱性蛋白酶,55℃水解1 h,以此水解脱脂乳为培养基培养乳酸菌活菌数达到2.5×109CFU/mL,较脱脂乳培养基中的活菌数提高了1.74倍。利用此优化培养基培养鼠李糖乳杆菌grx19和植物乳杆菌S7,得到的活菌数分别较脱脂乳培养基提高了1.50和1.62倍。     

乳酸菌蛋白水解体系及相关基因表达的研究进展

乳酸菌的蛋白水解体系包括胞外酶、转运系统和多种胞内酶.它们将外源蛋白质逐步水解成能被乳酸菌直接利用的游离氨基酸,弥补了因乳酸菌自身不能直接利用外源无机氯和蛋白质的缺陷,对于乳酸菌的正常生长具有非常重要的意义.目前,国内外正在研究利用现代分子技术,从基因表达层面检测不同菌株之间或菌株经过不同处理前后关键蛋白水解酶的表达水平差异,筛选出蛋白酶高表达量的菌株,从而得到蛋白水解能力强的优质乳酸菌发酵剂菌株.本文将对乳酸菌的蛋白水解体系及近几年乳酸菌蛋白水解体系中相关基因表达情况的研究进展进行综述,以期为乳酸菌蛋白质代谢的进一步研究提供参考.     

提高保加利亚乳杆菌抗冷冻性的研究

保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)L.b-DR经脱脂乳培养基和MRS培养基活化、菊芋汁复合培养基培养、离心收获菌体,以12%脱脂乳作为冷冻保护剂,进行了冷冻试验。研究了在培养基中添加活性成分、培养基的起始pH值、培养温度、细胞收获的菌龄、保护剂的pH值对细胞冷冻存活率的影响。结果表明:在菊芋汁复合培养基中添加0.1%甘油或0.5%VE、培养基的起始pH值为6.0、37℃培养、对数末期或稳定初期收获菌体、保护剂pH值调至6.0,可显著提高保加利亚乳杆菌L.b-DR的冷冻存活率(P<0.05)。     

培养条件对保加利亚乳杆菌中胞外肽酶PrtB基因表达的影响

目的：选择实验室保藏的保加利亚乳杆菌，探究不同的培养条件对其关键酶PrtB基因表达的影响。方法：利用实时荧光定量PCR测定生长时期、氮源、初始pH值（5.6，5.9，6.2和6.5）和培养温度（30，37，42 ℃和45 ℃）对PrtB基因表达的影响。试验结果表明，保加利亚乳杆菌LB08012、LB08014和LB08016从对数初期到稳定期，PrtB基因的表达量显著下调（P<0.05）；N缺乏条件与正常MRS培养条件相比，PrtB的表达量呈现明显增加的趋势（P<0.05），而添加酪蛋白胨与正常MRS培养条件相比，PrtB的表达量显著下调（P<0.05）；在初始培养pH值为5.9，6.2和6.5中的表达量与对照组（pH5.6）相比，LB08006、LB08007、LB08012和LB08016菌株的PrtB的表达量为增加（P<0.05），而LB08014、LB08015和LB08017菌株为降低（P<0.05）；在37，42 ℃和45 ℃时，LB08007、LB08012、LB08014和LB08015菌株的PrtB的表达量为先上升后下降，而LB08006、LB08016和LB08017为先上升后下降的趋势，45 ℃时PrtB的表达量最低，趋于0，较对照组（30 ℃）下降10.7倍。     

酶水解脱脂乳培养基对植物乳杆菌KLDS1.0391发酵产抑菌物质的影响

以中性蛋白酶水解脱脂乳为培养基,研究脱脂乳水解度对植物乳杆菌KLDS1.0391发酵产抑菌物质的影响,并优化发酵pH和时间。采用毛细管电泳和SDS-PAGE技术分析不同水解度脱脂乳的肽分布,采用3.7L发酵罐,通过单因素试验确定发酵pH和时间。研究结果表明:15%水解度的脱脂乳中,酪蛋白被全部水解,乳清蛋白被部分水解,水解后的低分子量肽更易于被该菌利用;以15%水解度的脱脂乳为培养基,恒pH 5.0发酵24 h后,所产抑菌物质的抑菌活性最高,达538.53 IU/mL。     

豌豆蛋白酶解产物促进益生菌生长活性研究

研究豌豆蛋白酶解产物(PPH)对17株常见益生菌在普通液体培养基及脱脂乳培养基中生长的影响。比较这17株益生菌在含有PPH的MRS培养基和不含PPH的MRS培养基中的菌体密度、活菌数和发酵液pH值,结果发现添加4mg/mL的PPH,可显著改善干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌和双歧杆菌等益生菌在MRS培养基中的生长,其菌体密度提高10.78%～49.34%,活菌数提高1～3个数量级,发酵液的pH值显著降低;然而其对植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜热链球菌的生长无明显影响。比较这17株益生菌在含有PPH的10%脱脂乳培养基和不含PPH的10%脱脂乳培养基中的活菌数和pH值,结果发现这些菌在含有PPH的10%脱脂乳培养基中的生长均优于不含PPH的10%脱脂乳培养基中的生长, pH显著下降,经特定时间发酵后的活菌数显著提高。经24 h发酵,PPH对鼠李糖乳杆菌W119的促生长作用最强,能使其活菌数从4.23×108提高到7.47×1011,发酵液pH值从5.83降到4.90。综上所述,豌豆蛋白酶解产物可显著促进益生菌的生长,提高益生菌的存活率,缩短益生菌的生产时间。     

弱后酸化酸奶发酵菌株的紫外诱变选育

为获得弱后酸化酸奶发酵菌株,采用紫外线对保加利亚乳杆菌3 4.5和嗜热链球菌sp1.1进行诱变处理,将诱变菌株同时接到低pH液体培养基和脱脂乳中,经37℃培养24h,选出低pH液体培养基不发生混浊的菌所对应的脱脂乳管,即为弱后酸化菌株,并对诱变菌株进行贮藏及传代稳定性实验。结果表明,球菌sp1.1与杆菌3 4.5紫外最佳诱变时间50S。经诱变后得到一株弱后酸化球菌S1,与原始菌株比后酸化程度降低了8.0%;两株杆菌L2、L34,与原始菌比后酸化分别降低10.3%、9.5%,经传代组合发酵乳实验,突变菌可稳定遗传。     

保加利亚乳杆菌发酵乳清的抗氧化性研究

通过控制初始发酵条件:pH6.0、发酵温度39℃,可以提高发酵乳清清除羟基自由基和DPPH.的能力。在发酵20h内,随着乳清蛋白水解度的增加,发酵乳清清除羟自由基和DPPH.的能力也随之增大,在发酵20h时达到最大,分别为48.06%和73.52%,发酵乳清清除羟自由基和DPPH.的能力与未发酵乳清相比分别提高了22.73%和46.09%,与保加利亚乳杆菌菌体相比分别提高了23.75%和40.63%。探讨了蛋白水解度和保加利亚乳杆菌活菌数和抗氧化活性之间的关系。20h后,发酵液自由基清除能力与水解度之间没有正相关性,因此不能采用蛋白水解度作为评价发酵乳清抗氧化性的指标。本研究对可能影响保加利亚乳杆菌发酵乳清抗氧化性的因素进行探讨,为开发功能性乳清产品奠定了理论和实践基础。     

保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖影响因素研究

研究保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的影响因素。通过改变其营养基质和发酵条件,采用单因素试验和正交试验,确定出保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最佳工艺条件。结果表明:葡萄糖、蛋白胨和磷酸氢二钾为保加利亚乳杆菌G6高产胞外多糖的最适碳源、氮源和磷酸盐,当其质量浓度分别为30,10,3.0 g/L,而初始pH值为5.5,发酵温度为34℃,发酵时间36 h时,该菌株胞外多糖合成量为425.7 mg/L,比优化前提高了36.57%。验证实验结果表明,此工艺条件具有合理性和稳定性,并可为高产胞外多糖乳酸菌的开发和应用提供理论依据。     

不同菌种发酵绿茶对其茶多酚及咖啡碱含量影响的研究

分别以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌三种菌种为生产菌株,以脱脂乳为培养基,茶汁添加量分别为20%、30%、40%.在37℃恒温条件下经6、12、18、24、36、48h发酵后,以紫外分光光度法测定其中茶多酚以及咖啡碱的含量.当茶汁添加量为30%,以保加利亚乳杆菌发酵12～18h时,培养基中茶多酚含量的增加速率最快.当茶汁添加量为30%,以嗜酸乳杆菌发酵12～18h时,咖啡碱含量达最大值.     

保加利亚乳杆菌关键糖代谢机制的研究

以五株德氏乳杆菌保加利亚亚种为出发菌株,通过高效液相色谱法对四株后酸化强弱不同的保加利亚乳杆菌发酵的酸奶中葡萄糖、乳糖、半乳糖及乳酸的含量进行测定,通过Carrez法处理沉淀蛋白,采用AminexHPX87H色谱柱,5mmol/LH2SO4溶液为流动相,流速0.6mL/min。结果表明,本实验中保加利亚乳杆菌室温贮存过程中产乳酸的途径为乳糖到葡萄糖,葡萄糖通过糖酵解生成乳酸,生成的半乳糖不被利用,一直处于累积状态;后酸化强的菌株代谢乳糖和葡萄糖的含量比后酸化弱的菌株代谢量更高,乳糖代谢途径为菌株贮存期产酸关键途径。     

乳酸菌基础培养基比较研究

研究了脱脂乳中性蛋白酶的最适酶解条件，并以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为混合发酵菌种，对MRS、脱脂乳和脱脂乳酶解液3种基础培养基进行了比较研究。结果表明：（1）脱脂乳中性蛋白酶的适宜酶解条件为：加酶量5000U／g蛋白质，在pH=7．0，50℃下酶解2h；（2）脱脂乳酶解液是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种较好的基础培养基，其冻干发酵剂的质量和数量均优于脱脂乳培养基。以脱脂乳酶解液为基础培养基制备的冻干发酵剂的活菌数达到3．5×10^11cfu／g，冻干发酵剂的重量是脱脂乳的1．93倍。     

瑞士乳杆菌与干酪乳杆菌在脱脂乳中发酵特性的研究

研究了瑞士乳杆菌(Lh134)和干酪乳杆菌(Lc134)单独与组合在脱脂乳中发酵32 h的pH、发酵乳酸度值、活菌数和氨基酸态氮变化.结果表明,Lh134在脱脂乳中发酵速度比Lc134快,Lh134和Lc134组合在脱脂乳中的发酵能力高过二者单株发酵,发酵结束时pH下降至3.90,发酵乳酸度达到281.30°T,活菌数...     

基于蔗糖代谢途径分析保加利亚乳杆菌的后酸化性能

弱后酸化能力是乳酸菌作为发酵剂使用时的重要特性。为研究保加利亚乳杆菌蔗糖代谢途径对发酵乳后酸化起到的作用，该研究比较了五株保加利亚乳杆菌的后酸化性能，分析了保加利亚乳杆菌的生长情况、糖代谢和产酸能力，探究了蔗糖代谢产酸相关基因的差异表达及关键酶活性，并研究了外源添加蔗糖代谢关键酶前后保加利亚乳杆菌的生长情况。结果表明，Lb. 1后酸化能力最弱，在以蔗糖为碳源的培养基中生长缓慢，KLDS 1.0207后酸化能力最强。发酵24 h后，二者蔗糖转化率分别为5.85%和85.39%，乳酸含量分别为1.13 g/L和11.81 g/L。在含双糖（乳糖:蔗糖=1:1.5）的MRS培养基中生长时，KLDS 1.0207蔗糖代谢途径中基因sacA、pgi、gap、pgk、ldh表达量极显著高于Lb. 1（P<0.01），KLDS 1.0207蔗糖酶活性显著高于Lb. 1（P<0.05），达到1.31 U/mg。在Lb. 1的蔗糖培养基中补充蔗糖酶后，OD600 nm增至原来的5倍。因此，蔗糖酶活性对保加利亚乳杆菌代谢蔗糖至关重要，编码蔗糖酶的sacA基因表达下调显著减弱蔗糖酶活性，菌株后酸化能力明显下降。