γ-CGTase酶学性质及产物特异性影响因素

将γ-环糊精葡萄糖基转移酶(γ-CGTase)的特有区域作为判断依据,在美国国家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中,通过序列比对及生物信息学分析,筛选出一种新型基因,并将其克隆表达得到一种酶。利用高效液相色谱-质谱联用进行产物鉴定,表明该酶为γ-CGTase;酶分子质量大约为80 kDa,最适温度50℃,最适pH 10.0;无α-环糊精生成;甲醇、乙醇、环己烷、十二醇激活γ-CGTase活力,异丙醇和正丁醇抑制γ-CGTase活力;反应时间、淀粉质量浓度及乙醇体积分数均会影响γ-CGTase的产物特异性。HPLC结果显示,在10%的乙醇最终体积分数条件下,γ-CGTase催化产物中γ-环糊精的比例由40.11%增加至78.20%,专一性提高了94.96%。该研究提供了一种新型的γ-CGTase,为提高γ-CGTase产物特异性提供研究基础。     

多黏芽孢杆菌产ɑ-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达及其转化产物特异性研究

通过设计简并引物,从Paenibacillus macerans YLW菌株中克隆到其α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)基因,构建重组质粒α-CGTase-p ET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组菌株α-CGTase-p ET28a/BL21(DE3)。在16℃,1m M IPTG条件下诱导15 h,实现了α-CGTase的可溶性表达,胞内酶活达到10046U/m L,是野生菌株胞外酶活的3.25倍。经镍柱一步法亲和纯化α-CGTase后,酶蛋白纯化了6.05倍,酶收率28.82%,通过SDS-PAGE检测获得表观电泳纯酶蛋白。酶催化转化实验表明:重组α-CGTase酶转化质量分数为5%的马铃薯淀粉15 h后,环糊精的总转化率可达40.7%,转化生成α-CD,β-CD,γ-CD比例分别为:43.6%、41.8%和14.6%。该重组酶对α-CD具有较好的转化专一性,通过转化条件的进一步优化将具有非常好的产业化开发前景。     

Box-Behnken响应面法优化酶法制备α-环糊精及其分离纯化

以α-环糊精葡萄糖基转移酶(α-cyclodextrin glycosyltransferase,α-CGTase)为催化剂,研究其作用于马铃薯淀粉产出α-环糊精的酶法生产工艺。通过单因素试验和Box-Behnken中心组合设计法设计响应面试验,分析不同条件对α-环糊精转化率的影响。试验结果表明,当α-CGTase的反应温度为50℃,pH值为5.5时,α-CGTase呈现最好的酶活性质,α-环糊精的转化率最高。反应体系中加入有机溶剂正癸醇,底物浓度为1.0%,加酶量为200 U/g淀粉,反应时间为14 h时,α-环糊精的转化率可达40.6%。通过水蒸气蒸馏法进一步分离纯化α-环糊精产物,经高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)鉴定分析,转化率可达到20%～40%,纯度达到75%。     

双酶法催化玉米淀粉制备γ-CD

以玉米淀粉为底物,研究了来自于栖热水生菌的4α-糖基转移酶(4αGTase)和来自于嗜碱芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)作用于淀粉制备γ-CD的影响因素。结果表明:两种酶的添加方式为先加入4αGTase、再加入CGTase;γ-CD的最佳制备条件为底物质量分数5%,4αGTase加酶量4 U/g淀粉,CGTase加酶量8U/g淀粉,反应时间30 h。在此条件下γ-CD的得率最高为12.83%,比对照组提高了76.7%。     

重组Bacillus stearothermophilus β-CGTase在β-环糊精制备中的应用条件优化

以作者所在实验室前期构建的产嗜热脂肪芽孢杆菌β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)重组短小芽孢杆菌作为菌种,经过摇瓶发酵,得到酶活为49 U/mL的β-CGTase粗酶液。以马铃薯淀粉为底物用β-CGTase进行单酶法转化制备β-环糊精,并对转化条件进行优化。结果表明,最优反应条件为:反应时间18 h,初始pH 6.0,反应温度50℃,底物质量浓度15 g/dL,加酶量13 U/g底物。在最优条件下,总转化率最高为73.9%,其中β-环糊精比例为98.7%。在此基础上,建立了采用普鲁兰酶与β-CGTase复配同步转化淀粉制备β-环糊精的新工艺,并且优化了普鲁兰酶的加酶量。结果表明,当普鲁兰酶加量为50 U/g淀粉底物,反应时间18 h时,总转化率达到最高81.4%,其中β-环糊精占比97.7%。     

利用来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase突变体Y89D生产α-环糊精

对α- 环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGTase)突变体Y89D 制备α- 环糊精的影响因素进行初步研究。其因素包括淀粉种类(马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、可溶性淀粉)、加酶量、反应时间、pH 值、有机溶剂(乙醇、异丙醇、正丁醇、正癸醇)和温度。结果表明：选用5g/100mL 马铃薯淀粉、pH5.0、温度30℃、加酶量控制在 每克淀粉5U 左右,反应体系中加入体积分数5% 的正癸醇,反应6h 后,淀粉总转化率可达70%,其中α- 环糊精在产物中质量分数约为85%,转化产物中含有少量β- 环糊精(15%),而极少生成γ- 环糊精。因此,α-CGTase突变体Y89D 在制备α- 环糊精工艺中具有很好的工业化应用前景。     

环糊精葡萄糖基转移酶生产α-熊果苷的反应条件优化及分子改造

选择4种环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)分别为来源于Paenibacillus macerans的α-CGTase,Bacillus circulans 251的β-CGTase,Bacillus stearothermophilus NO_2和Anaerobranca gottschalkii的α/β-CGTase,研究不同种类的CGTase生产α-熊果苷的情况。以麦芽糊精为供体,对苯二酚(Hydroquinone HQ)为受体,通过CGTase和淀粉葡萄糖苷酶的两步酶法反应催化合成α-熊果苷。分别优化不同类型的酶合成α-熊果苷的条件,发现Anaerobranca gottschalkii来源的CGTase在如下最优条件下获得的HQ摩尔转化率最高,为25%:以葡萄糖当量(DE)值为9%~13%的50 g/L麦芽糊精作为供体,8 g/L HQ为受体,缓冲液pH 6.0,在40℃下反应24 h,沸水浴灭活后,加入糖化酶处理,高效液相色谱检测产物。为了进一步提高CGTase对底物的转化率,利用定点突变技术对A.gottschalkii CGTase进行分子改造,得到1个突变体Y299A,在最优的反应条件下突变体的HQ转化率可达40%。     

高效液相色谱法测定混合环糊精中α-环糊精的含量

环糊精在工业生产中的产物是由α-CD,β-CD,γ-cD和糖类等混合而组成,α-CD相对于β-CD,γ-CD具有更小的空腔,更适于包结相对较小分子量的化合物.目前在实际工作中α-环糊精的测定主要利用紫外分光光度计显色法进行,由于混合环糊精中还含有β,γ-CD及麦芽糊精,互相间有很大干扰,耗时长,操作复杂.为准确测定产物中α-CD的含量,本研究利用高效液相色谱法测定混合环糊精中α-环糊精的含量.色谱柱为Spherrigel C3H5(5μm 300×3.9mm),采用流动相为v(甲醇):v(水)(5:95)溶液进行洗脱,流速为1.0mL/min,检测器为示差折光检测器,柱温40℃.α-环糊精的线性范围为0.1mg/mL～10mg/mL,加样回收率(n=6)为98.46%,RSD(n=6)0.12%.本方法简便、灵敏、准确,可用于α-环糊精的含量测定和质量控制.     

γ-CGTase突变体制备及其产γ-CD条件优化

采用定点突变法将来自Bacillussp.G-825-6的γ-CGTase的211位的酪氨酸突变为亮氨酸,并利用突变体Y211L催化淀粉制备γ-CD,分别研究了底物种类、底物质量分数、反应时间、反应温度、加酶量对γ-CD产率的影响,并在单因素的基础上进行了正交优化,优化后的反应条件为:木薯淀粉质量分数为6%,加酶量为4 U/g,反应温度50℃,反应时间为24 h,在此条件下催化产生γ-CD的产率可达到14%,以总环糊精质量分数为100%计,催化产γ-CD的比率为97%。     

固载β-环糊精的阳离子淀粉的制备研究

采用2种合成路线制备了固载β-环糊精的阳离子淀粉(CSt-βCD):淀粉固载β-环糊精-阳离子化工艺和淀粉阳离子化-固载β-环糊精工艺。实验结果表明:第1种工艺的较佳反应条件为:n(β-CD)∶n[环氧氯丙烷(Epi)]=1∶2,m(β-CD)∶m(淀粉)=4∶1,ρ(NaOH)=300 g/L,反应温度50℃,该工艺阳离子化后的产物水溶性较差,但其取代度不受β-CD含量变化的影响;第2种工艺提高β-CD与阳离子淀粉的质量比,产物中的β-CD含量逐渐增加,而阳离子取代度显著下降,产物水溶性好,但取代度随β-CD含量变化而变化。     

易错PCR技术改造β-环糊精葡萄糖基转移酶的催化特性

β-环糊精是一种环状多糖,可用于改变某些大分子化合物的理化性质,在食品、生物及医药等领域都具有很高的工业应用前景。通过利用β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）,使其作用于淀粉等含有葡萄糖基的多糖化合物,可转化生成β-环糊精。该研究采用易错PCR技术对来源于Paenibacillus campinasensis的β-CGTase进行定向进化,得到酶活力高的突变体,并对突变体进行镍柱亲和纯化与酶学性质分析。实验最终获得了一株突变体Q280L,其酶活力与原始-CGTase相比提高了42.10%,对β-环糊精的转化率提高了7.60%,最适反应pH值和稳定性均有所变化,底物亲和力提高46.13%。经序列比对及结构分析,发现突变体Q280L与野生β-CGTase相比,第280位氨基酸残基种类以及周围氢键发生变化。该试验结果表明,基于易错PCR技术对β-CGTase基因进行定向进化,可提高酶活力和改善酶学性质,为实现β-环糊精的工业生产提供参考意义。     

β-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆、表达及酶学性质

获取来自坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)的编码β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-cyclodextrin glycosyltransferase,β-CGTase)的基因cgt,并将带有His-Tag去除信号肽的cgt基因克隆到表达载体p ET28a(+)后,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过热变性和Ni-NTA获得重组β-CGTase纯化酶,再通过SDSPAGE检测,蛋白分子量在74 k Da左右,并初步研究了重组β-CGTase的酶学性质。结果表明:重组β-CGTase的酶促反应的最适p H为7.0,并且在p H为5.5~10.0范围稳定,最适反应温度为为65℃,重组酶在55℃保温5 h时仍保持90%以上的活性。研究一些金属离子和化学试剂对重组酶的影响发现β-CGTase是一种金属酶,Ca~(2+)对酶的催化起关键作用,尤其是在低浓度下对酶的活性有促进作用。对重组酶的酶促反应动力学研究得出Km为3.75 mg/m L,Vmax为0.33 mg/(min·m L)。该研究成功实现了β-CGTase基因的异源表达,为进一步实现β-CGTase的工业化生产和应用奠定了基础。     

响应面法优化重组大肠杆菌PUCRF发酵培养基的研究

为进一步提高重组大肠杆菌( PUCRF)产β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)的酶活力,以构建的一株能在胞外分泌表达β-CGTase工程菌E.coli PUCRF 为出发菌株,利用响应面法对其发酵工艺条件进行优化。根据Box-Benhnken中心组合设计原理,在单因素试验基础上采用四因素三水平的响应面分析法确定重组大肠杆菌PUCRF最佳培养基组成(g/100mL)为：玉米淀粉 0.962、玉米浆0.097、MgSO4 ·7H2O 0.153、K2HPO4 ·3H2O 1.235。经过优化,β-CGTase产量可达3610U/mL,是初始条件下β-CGTase酶活力(2690U/mL)的1.34倍。     

微波辅助酶催化甜菊苷的转苷和水解

分别研究了微波辅助α-环糊精转移酶(α-CGTase)催化甜菊苷(St)转苷,和β-半乳糖苷酶催化St水解的反应。实验表明,微波能够加速来源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St转苷反应,催化效率提高了21.7倍;但微波对β-半乳糖苷酶催化St的水解反应的影响较小。α-CGTase的加酶量为1 000 U/g时,反应1 min,St的转化率高达71.6%,St-Glc 1的产率为23.7%。     

CGTase合成γ-环糊精的酶促反应条件优化

采用筛选到的一株嗜碱芽孢杆菌,研究它所产生的环糊精糖基转移酶生产环糊精的工艺条件,重点探讨酶促反应条件对环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的影响。结果表明:环糊精糖基转移酶生产γ-环糊精的最佳工艺为反应体系的pH 8.0,温度60℃,环糊精糖基转移酶的酶量500U/g.淀粉,甘草酸浓度2%,淀粉的DE值6～11,在该条件下制备的产品得率最高;蕉藕淀粉和木薯淀粉在生产γ-环糊精时是环糊精糖基转移酶比较合适的底物;普鲁蓝酶对γ-环糊精的产量增加作用有限。     

环糊精糖基转移酶定点突变及其产物特异性分析

环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）是一种多功能酶,能够催化淀粉生成环糊精（cyclodextrin,CD）,本研究考察了Bacillus cereus的CGTase活性区域43位氨基酸与CGTase酶活力及其催化玉米淀粉形成γ-CD能力的联系。实验中共构建17 株突变株,并在大肠杆菌BL21中实现异源表达。结果表明：相比于原始酶,H43E、H43F、H43W、H43Y突变酶的活力均有所提高;产物特异性方面,除H43W突变酶外,其余突变酶的催化产物中γ-CD比例均有所升高,将43位组氨酸突变成脯氨酸、异亮氨酸和苏氨酸后得到的突变酶作用于玉米淀粉,酶的催化产物中β-CD含量均下降,γ-CD含量由20%分别升高到30.2%、28.4%、29.2%,实际产量由4.76 g/L升高到7.64、6.05、6.29 g/L,由此可见Bacillus cereus的CGTase活性区域中43位氨基酸对于CGTase的活力和产物特异性具有重要影响。     

半乳糖基-β-环糊精的合成与结构研究

以β-环糊精和蜜二糖为原料,通过α-半乳糖苷酶酶法合成得到半乳糖基β--环糊精(Gal-β-CD)。酶法合成条件为:蜜二糖中酶用量为20U/g,β-环糊精和蜜二糖的物质的量比为1:2,pH6.5(50mmol/L醋酸缓冲液),反应时间24h,反应温度40℃。经过高效液相色谱分离产物,通过质谱、红外光谱和核磁共振证明该产物为6-O-α-D-半乳糖基-β-环糊精。     

产β-环糊精葡萄糖基转移酶高温菌株HY15发酵条件优化

以一株产β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）的嗜热菌株HY15为研究对象,采用单因素试验研究碳源、氮源、初始pH值、培养温度、MgSO4·7H2O等对酶活力影响。并设计正交试验优化其发酵条件。结果表明最优的发酵条件为：碳源为玉米淀粉+糖蜜,氮源为玉米浆,初始pH7.0,培养温度60℃、摇床转速220r/min,MgSO4浓度10mmol/L,在此条件下,β-CGTase酶活力可达1794.3U/mL。     

短小芽孢杆菌热稳定环糊精葡萄糖基转移酶粗酶酶学特性研究

从土壤分离物中筛选到一株环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucanotransferase,CGTase)产生菌CGT01.16SrDNA序列分析表明该菌与短小芽孢杆菌(Bacillus pumnilus)的同源性为99%.同时根据其生理生化特征,该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌(B.pumilus).命名为B.pumilus.CGT01菌株.产生CGTase的最适初始pH为6.5,最适培养温度为37℃.菌株所产CGlke的最适pH值和最适反应温度分别为pH 6.5和60℃,并有较高的热稳定性.60℃条件下保温,酶活基本稳定,半衰期为35 min.酶液中添加1 mmol/L Ca2+能明显提高CGTase的稳定性,60 ℃保温1 h后,剩余酶活仍达80%以上.SDS-PAGE检测表明酶的分子量约为78 ku左右.经高效液相色谱分析表明,CGTase作用于可溶性淀粉后的主要产物为葡萄糖、麦芽糖和β-环糊精,没有检出α和γ型环糊精产物,因此所产环糊精为单一类型,不同于同种属的其他菌株所产CGTase.     

产环糊精葡萄糖基转移酶苦橙内生细菌的分离鉴定

为寻找产环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase）的微生物新菌株，采用酚酞-甲基橙筛选平板、淀粉-碘筛选平板从苦橙内生细菌中分离获得一株可产环糊精葡萄糖基转移酶的新菌株，命名为KCEB04。形态学特征、生理生化反应、16S rDNA 序列同源性分析结果表明，菌株KCEB04 归属于产酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。酶活测定结果表明，该菌株所产淀粉水解酶酶活为5 884.35 U/mL、α-CGTase 酶活为1.65 U/mL、β-CGTase 酶活为0.44 U/mL、γ-CGTase 酶活为1.05 U/mL。