贵州三穗特色豆豉发酵优势菌种的筛选和鉴定

为实现贵州三穗特色细菌型豆豉产品品质稳定、大规模工艺化生产,在保留原有风味的基础上,实现纯种或混菌发酵,强化优良菌种,从传统生产工艺中分离筛选出13株菌,接种于黄豆,以感官评定和蛋白酶活力为指标进行制曲初筛及复筛,选出优势菌株5株,对其进行生理生化试验后,最终挑选3株(B、F和J菌株)进行16Sr DNA测序并建立系统发育树。结果表明,3株菌均属于芽孢杆菌属的亚种,是贵州三穗特色细菌型豆豉的优势菌株。     

一株细菌型豆豉发酵菌种的筛选及鉴定

从临沂细菌型豆豉中筛选出一株适于豆豉生产的高产蛋白酶菌种,并对此菌种进行鉴定。结果表明：采用酪蛋白平板初筛,制曲复筛,根据曲样蛋白酶酶活以及游离态含量共选出5株优良菌株用于豆豉的制作,由成品豆豉的理化指标和感官评定认为D2号菌种发酵的豆豉风味好,滋味鲜美。结合生理生化和16SrDNA序列分析初步鉴定D2号菌种为枯草芽孢杆菌,该菌株来源于豆豉,属于安全菌种,具有研究开发价值。     

细菌型豆豉发酵芽孢杆菌的筛选与鉴定

对贵州省10 个细菌型豆豉产区的样品进行菌种分离与鉴定。旨在通过纯种发酵、口感评测、产蛋白酶能力测定、产气实验,筛选出能够取代自然发酵、蛋白酶产量高、发酵风味好、发酵不产气的芽孢杆菌菌株。结果从分离的184 株芽孢杆菌中,筛选出3 株发酵品质突出且不产气的菌株：BJ3-2、BJ1-3 和ZY4-5,其产蛋白酶能力(h/c)分别为3.60、1.71 和1.50。生理生化鉴定和16S rDNA 序列分析结果显示,它们均为枯草芽孢杆菌。扩大纯种发酵实验证明,可以将其作为工业发酵参考菌株。     

庆阳豆豉优势菌株的分离鉴定

为了确定庆阳豆豉的主要作用微生物,获得优势发酵菌株,以甘肃庆阳7个县区农户所制的发酵豆豉为材料,采用不同培养基分离纯化,通过平板透明圈法初筛,发酵液蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶活性测定,对传统豆豉发酵微生物进行了分离筛选,最后对优势菌株进行生理生化鉴定及16S rDNA分子生物学鉴定。共分离出22株细菌菌株,初筛获得10株均可分解蛋白质、淀粉和纤维素能力的菌株,其中QY2b蛋白酶和纤维素酶活性最高,分别达到了25.37 U/mL和6.015 U/mL。通过对QY2b的形态观察及生理生化试验,结合16S rDNA鉴定手段,确定该优势发酵菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。     

豆豉优势细菌菌株的酶活、抑菌作用和初步鉴定

为了获得豆豉多菌种发酵的候选菌株,以著名的自然发酵豆豉——黄姚豆豉和天马山豆豉为材料,首先采用平板划线法分离纯化其中的优势细菌菌株,接着采用透明圈法考察这些菌株对蛋白质、淀粉和纤维素的分解能力,然后采用琼脂平板扩散法考察具有分解能力的菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制作用,最后根据形态及生理生化特征对菌株进行鉴定。结果表明,黄姚豆豉和天马山豆豉各存在3种不同菌落形态的优势细菌菌株,分别命名为HX-1、HX-2、HX-3和TX-1、TX-2、TX-3;分解蛋白质能力最强的是菌株HX-1,分解淀粉和纤维素能力最强的是菌株TX-1;菌株HX-1和TX-1不仅对蛋白质、淀粉和纤维素都具有分解能力,而且对大肠杆菌具有抑制作用,均为枯草芽孢杆菌。     

豆豉后发酵中优势菌株筛选及其生产性能

为了更好地控制传统豆豉后发酵过程,实现多菌纯种发酵,确保豆豉的质量安全。本实验对豆豉后发酵过程中的优势有益微生物进行研究。以北京仙源豆豉及部分市售豆豉为实验材料,对其中的酵母菌、芽孢杆菌和乳酸菌进行分离鉴定,并对分离菌株的抑菌性能、产酶性能以及耐盐和耐温等生产性能进行研究。最后选出适合于豆豉后发酵的6 株优势有益菌株,经分子生物学鉴定,确定为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）,解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）,戊糖片球菌（P. pentosaceus）,食窦魏斯氏菌（W. cibaria）,东方伊萨酵母（I. orientalis）和热带假丝酵母（C. tropicalis）。     

阳江豆豉菌种的筛选及前发酵工艺条件优化

从广东阳江豆豉的曲醅中筛选出两株前发酵优势菌,经18S rRNA基因序列分析和菌株形态观察鉴定确定为米曲霉与米根霉,再选出长势旺盛,高产蛋白酶的菌株,以麸皮培养基扩大培养,单菌或双菌混合进行制曲。通过研究曲料中的氨基态氮含量与菌种生长情况,及成品的氨基态氮、还原糖、总酸含量与风味评定,确定豆豉前发酵最优菌种组合,发酵温度与发酵时间。结果表明,以米曲霉与米根霉混合制曲,于36℃条件下发酵56h,生产出的豆豉品质最好。     

应用原生质体融合技术筛选豆豉芽孢杆菌

采用原生质体融合技术,以枯草芽孢杆菌Bl⑥为出发菌株,与纳豆芽孢杆菌进行原生质体融合,最终筛选获得融合菌株11株.其中以枯草芽孢杆菌B1⑥和纳豆芽孢杆菌融合获得的RH3519菌株纯种发酵豆豉的品质最佳,且显著优于原始菌株和自然发酵豆豉.RH3519菌株的生理生化鉴定表明,属于芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其遗传稳定性高,发酵不产气,发酵特性可满足工业生产的要求.     

不同菌种发酵对豆豉游离脂肪酸构成的影响

熟化黄豆分别接种毛霉（总状毛霉）、细菌（纳豆芽孢杆菌）和曲霉（米曲霉）,经不同发酵工艺形成三种不同类型的豆豉,研究三种不同菌种接种发酵处理对豆豉中游离脂肪酸构成的影响。结果表明熟化黄豆、毛霉型豆豉、细菌型豆豉、曲霉型豆豉分别鉴定出9种、11种、9种、8种游离脂肪酸;四种样品中游离脂肪酸含量从高到低依次是毛霉型豆豉（3 736.3 mg/100 g）＞熟化黄豆（1 911.16 mg/100 g）＞细菌型豆豉（1 421.02 mg/100 g）＞曲霉型豆豉（924.55 mg/100 g）,多不饱和脂肪酸含量分别为毛霉型豆豉（2 087.51 mg/100 g）＞熟化黄豆（1 065.53 mg/100 g）＞细菌型豆豉（731.17 mg/100 g）＞曲霉型豆豉（478.64 mg/100 g）。研究结果表明,经不同菌种发酵的豆豉游离脂肪酸组成和含量有差异。     

细菌型豆豉纯种发酵工艺优化

考察了菌种、后酵温度和加盐量对豆豉感官品质和氨基酸态氮含量的影响,经统计比较确定,细菌型豆豉纯种发酵的较优工艺条件是:以枯草芽孢杆菌菌株BBDC3和BBDC4的混合茵为菌种,后酵温度50℃,加盐量10%.在此优化条件下发酵得到的豆豉含蛋白质38.93%、脂肪23.90%、灰分14.59%、总酸0.42%,氨基酸态氮和三氯醋酸可溶性蛋白的含量分别为0.61%和1.59%,大大高于原料黑豆(0.19%,0.26%),与传统"八宝豆豉"的主要质量指标相符,也符合我国豆豉行业标准.     

细菌型豆豉发酵菌株的鉴定

为了明确细菌型豆豉发酵菌株的身份,首先采用形态及生理生化方法进行鉴定,接着提取该菌株的基因组DNA,并根据芽孢杆菌属16S rDNA序列两端的保守性片段设计引物,然后用PCR方法扩增出16S rDNA部分序列,纯化、测序,最后经BLAST搜索进行序列比对和构建系统进化树.结果表明,菌株BBDC3为革兰氏阳性芽孢杆菌,生理生化特征与枯草芽孢杆菌相符;扩增出的16S rDNA部分序列长为1344bp,与序列号为EF488171的枯草芽孢杆菌16SrDNA序列的相似度最高,为99%;系统进化树中,菌株BBDC3与枯草芽孢杆菌AB018487在同一分支.因此,菌株BBI)C3属于枯草芽孢杆菌.     

细菌型豆豉低生物胺发酵模型构建

为了降低细菌型豆豉中生物胺含量,通过响应面法构建细菌型豆豉纯种发酵低产生物胺的发酵模型。利用前期筛选出来的益酵益生型低生物胺菌株进行发酵,经过单因素实验得到较优的3个水平,以生物胺及感官评价为指标构建低生物胺发酵模型。细菌型豆豉低生物胺发酵模型为接菌量8%、发酵温度37℃、发酵时间3 d。经验证试验得到该发酵模型下的豆豉产品颗粒饱满、色泽深黄色、粘丝短而丰富,具有典型的豉香味,且总生物胺水平显著下降(P0.05),含量为10.65 mg/kg(较优化前降低1.36倍,较传统自然发酵降低10.68倍);其中降幅最大的生物胺为精胺(1.86倍和42.61倍),其次是酪胺(1.62倍和10.54倍)和苯乙胺(1.35倍和2.60倍),为研发低生物胺细菌型豆豉积累了资料,实现细菌型豆豉产品安全性的全面提升,得到安全优质产品,为特色传统豆豉的工业化安全生产提供技术支撑。     

水豆豉中高产豆豉纤溶酶的菌株筛选、鉴定及生长性能研究

采用平板法初筛,从市售水豆豉分离细菌中筛选得到6株具有高产蛋白酶、淀粉酶和豆豉纤溶酶的菌株;经化学法复筛,获得1株高产豆豉纤溶酶菌株B61。对B61菌株进行形态学、生理生化特性鉴定及16SrDNA同源性分析,最后鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),且该菌株在生长16h后检测到最高豆豉纤溶酶活力(826.25IU/mL)。该研究丰富了豆豉纤溶酶产生菌的菌种资源,并为其后续相关研究提供了理论依据。     

高产蛋白酶菌株的分离鉴定及诱变

目的:从豆豉中分离出高产蛋白酶的菌株并进行紫外诱变,以提高菌株的产蛋白酶能力.方法:采用酪蛋白平板法,初步筛选出一些产蛋白酶菌株,通过比较发酵后蛋白酶活力,筛选出一株产蛋白酶活力最高的菌株,鉴定其菌种,对该菌株进行紫外诱变,并对诱变后的菌株进行筛选,最后得到一株产蛋白酶活力最高的菌株.结果:分离鉴定后得知菌株B为地衣芽孢杆菌,产蛋白酶活力为2360.80U/mL.最佳诱变时间为120s,菌落致死率为66.68％,得到的高产蛋白酶菌株为B-14,其蛋白酶活力为2922.90U/mL,诱变后菌株产蛋白酶活力提高了23.81％.结论:通过筛选、诱变成功选育出高产蛋白酶的菌株B-14.     

苎麻高效生物脱胶菌株的筛选和诱变

以苎麻田土壤和沤麻池淤泥为菌种筛选的来源,用选择平板筛选方法得到8株有效菌种,经过苎麻微生物发酵实验筛选出l株优势菌种,经菌落形态、生理以及生化指标检验,确认菌株C J2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis).该菌株对苎麻脱胶后,脱胶率为17.6％,对其进行紫外诱变60 s处理后,筛选得到的突变...     

3种传统发酵介质对细菌型豆豉风味形成的影响

为研究传统发酵介质对细菌型豆豉风味形成及细菌群落结构的影响，该研究以稻壳、豆豉叶和香樟叶构建不同的传统发酵介质，分析发酵后豆豉的理化特性及风味物质组成，并利用高通量测序技术分析豆豉中细菌群落结构。结果显示，由稻壳、豆豉叶、香樟叶发酵的豆豉分别含有13、14、23种风味物质，且豆豉微生物均分布于20个属，其中芽孢杆菌属和乳杆菌属与豆豉叶发酵豆豉的独特风味物质吡嗪类化合物的含量呈正相关；克雷伯杆菌属和葡萄球菌属与香樟叶发酵豆豉的独特风味物质桉叶油醇的含量呈现正相关，肠杆菌属和芽孢杆菌属与稻壳发酵豆豉的独特风味物质苯酚和对乙基酚的含量呈现负相关。结果表明，不同的发酵介质赋予了细菌型豆豉不同的细菌群落，进而引起豆豉的风味的改变。因此，控制发酵介质可以影响豆豉的质量。     

自然发酵型水豆豉细菌菌群的动态监测研究

对贵州某工厂自然发酵型水豆豉制曲及后发酵过程细菌菌群种类和数量进行了动态监测。结果表明,在制曲和后发酵期间,优势微生物菌群鉴定出8个属共26种。枯草芽孢杆菌、热噬淀粉芽孢杆菌(B.thermoamylovorans)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)为优势菌群。检测到粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)4种致病菌,分析可能是生产辅料、生产设备或生产环境等带入导致污染,其中奇异变形杆菌(P.mirabilis)存在于贵州自然发酵型水豆豉中,属于首次报道。     

细菌型豆豉蜡样芽孢杆菌的动态变化研究

采用传统分离鉴定法对细菌型豆豉不同发酵时期蜡样芽孢杆菌污染情况进行动态检测。结果表明,自然发酵过程中,蜡样芽孢杆菌最高达到2.3×104 CFU/g;纯种强化发酵过程中蜡样芽孢杆菌最高达1.1×103 CFU/g,自然发酵豆豉的蜡样芽孢杆菌含量高于纯种强化发酵。豆豉成品中总蜡样芽孢杆菌数量均＜105 CFU/g,短期内不存在食品安全问题。经分析,豆豉成品中蜡样芽孢杆菌主要来源于前发酵豆豉。     

混合菌种发酵对豆豉抗氧化性影响的研究

通过混合菌种发酵豆豉,提高豆豉的抗氧化能力.选用高产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌D2、D8、D10和β-葡萄糖苷酶产生菌枯草芽孢杆菌U35进行单菌种和混合菌种发酵豆豉,测定其中的抗氧化成分黄酮类化合物含量,比较豆豉铁氰化钾还原能力、自由基清除能力、抗氧化能力差异,同时分析其抗氧化成分含量和抗氧化活性的关系.混菌豆豉的苷元型异黄酮含量明显提高,D2U35、D8U35、D10U35混菌豆豉比D2、D8、D10单菌豆豉分别增加了59.71％、68.18％、54.83％.豆豉中抗氧化成分黄酮类化合物的含量比蒸煮大豆高31.20％～45.19％.混菌豆豉铁氰化钾还原能力、对[·OH]自由基清除能力分别比单菌豆豉高约22.02％、38.62％,对[DPPH·]自由基清除能力与单菌豆豉基本相同.混菌豆豉苷元型异黄酮含量对抗氧化性质影响较大.     

混菌发酵豆豉中异黄酮含量及对小鼠肺癌细胞的抑制作用

选用高产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌D2和β-葡萄糖苷酶产生菌枯草芽孢杆菌U35进行单菌种、混合菌种发酵生产豆豉,测定大豆异黄酮含量及其抗肿瘤能力,分析异黄酮含量和抗肿瘤能力的关系。用HPLC法测定豆豉提取物异黄酮含量,采用MTT比色法检测异黄酮含量对细胞增殖的影响,并在荧光显微镜下观察小鼠肺癌(LLC)细胞形态变化。结果表明,D2U35混菌豆豉苷元型异黄酮含量分别比D2、U35单菌豆豉高101.95μg/mL(2.38倍)和35.48μg/mL(1.25倍),D2U35混菌豆豉对肿瘤细胞的抑制率分别比D2、U35单菌豆豉高15.79%和7.02%,说明混菌发酵不仅提高了苷元型异黄酮含量,还提高了豆豉提取物的抗肿瘤能力。对肿瘤抑制作用,苷元苷型异黄酮>总异黄酮>糖苷型异黄酮。