普通烟草WOX转录因子家族的全基因组鉴定及分析

  背景  WOX（WUSCHEL-related homeobox）转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族,被报道参与生长发育、细胞间通讯、干细胞分裂分化稳态调控和器官发育等过程。  方法  利用比较基因组学和生物信息学的方法,在烟草基因组中对WOX转录因子成员进行鉴定,并进行进化分析、共线性分析、保守基序分析以及表达模式等分析。  结果  （1）从烟草基因组中鉴定出23个WOX转录因子家族成员编码基因,其中15个NtWOX基因定位到染色体上;（2）系统发育分析表明,普通烟草和拟南芥的WOX转录因子被分成了3个亚支和9个亚家族;（3）共线性分析发现若干普通烟草NtWOX基因存在于普通烟草与拟南芥基因组的共线性区段中;（4）复制事件分析表明串联重复或者全基因组重复事件在普通烟草WOX家族扩张中起重要作用;（5）保守基序分析表明同一亚家族内NtWOX成员的保守基序的组织形式高度相似;（6）表达分析表明普通烟草NtWOX基因表达具有组织特异性;（7）GO注释分析发现普通烟草NtWOX转录因子参与组织器官发育、细胞间通讯过程和胁迫响应等生物学过程。  结论  本研究在普通烟草中鉴定并系统分析了WOX转录因子家族成员,为其功能研究奠定基础。      

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

普通烟草NtWRKY53基因克隆、鉴定及表达分析

WRKY转录因子家族是一类植物特有的转录因子家族,其成员WRKY53在生物及非生物胁迫和叶片衰老过程中发挥着重要的调控作用。为明确WRKY在烟草中的相关功能,克隆了普通烟草NtWRKY53基因。结构域分析表明,NtWRKY53基因编码典型的WRKY转录因子并具有高度保守且典型的WRKY结构域;进化和共线性分析发现,所鉴定的普通烟草NtWRKY53基因与拟南芥AtWRKY53基因为同源基因;亚细胞定位结果表明,NtWRKY53转录因子定位于细胞核中;转录激活试验发现,NtWRKY53转录因子具有转录激活活性;表达模式分析表明,NtWRKY53基因在衰老的叶片中表达量较高且能够被盐、干旱胁迫,以及CMV和黑胫病所诱导。因此,普通烟草NtWRKY53基因编码WRKY型核定位转录因子,在落黄的烟草叶片中表达量较高,受多种生物、非生物逆境诱导,并参与相应的生物和非生物逆境胁迫响应。     

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。      

烟草抗冷相关基因在两种不同育苗方式下的低温应答差异分析

为探究水旱两段式育苗技术抗低温胁迫的分子机制,利用生物信息学方法分析了烟草低温应答关键转录因子CBF（C-repeat binding factor）基因家族的进化关系、基因结构、保守结构域及其启动子顺式作用元件,进一步利用qRT-PCR分析两种育苗方式下（常规漂浮育苗和水旱两段式育苗）NtCBF基因家族、CBF-regulon基因和非CBF-regulon相关基因的低温应答模式。结果表明,NtCBF15~NtCBF21基因与拟南芥CBF5、CBF6基因进化关系相近,NtCBF1~NtCBF14基因与拟南芥CBF1~CBF4基因进化关系相近。NtCBF基因家族成员均具有motif 1/2/4/5保守蛋白结构域,表明该家族在进化过程中较为保守;其中,NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8个基因启动子区具有低温响应元件。低温处理后,NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及CBF-regulon基因中NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3的表达量均显著升高。推测NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及其下游调控基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在水旱两段式育苗抗低温胁迫过程中起重要作用。      

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

NAC (NAM-ATAF-CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因--TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D三个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24 h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明TaNAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,TaNAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。      

烟草过氧化氢酶基因CAT1的克隆及表达特征分析

基于GeneBank中已有的植物Catalase 1（CAT1）基因序列设计烟草CAT1的特异性引物,通过RT-PCR扩增克隆获得Nicotiana tabacum var. NC89 CAT1全长mRNA序列,可编码492个氨基酸残基。遗传进化分析显示NC89 CAT1中与N .benthamiana CAT1基因亲缘关系最近。利用real-time RT-PCR技术对CAT1基因在烟草中的组织表达特异性和烟草NC89应对生物和非生物胁迫的表达差异进行了分析。结果表明CAT1基因在烟草NC89的根、茎、叶、花瓣、花萼、种子中均有表达,其中在根部表达量最低,在叶中相对表达量最高。生物和非生物胁迫处理烟株,其CAT1诱导表达分析显示,机械损伤、渗透压、低温和高温、干旱、和感染TMV CAT1表达量上调,紫外胁迫下表达量下调。上述研究表明烟草CAT1基因可能参与了植物的生长发育、应对非生物和生物胁迫的过程。      

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.7基因的克隆、亚细胞定位及表达模式分析

为研究硝酸转运蛋白(Nitrate transporter, NRT)在烟草吸收和转运硝酸盐中的作用,以烟草K326的cDNA为模板,克隆了一个全长1 839 bp、编码612个氨基酸的硝酸盐转运蛋白基因,命名为NtNRT1.7。生物信息学分析表明烟草NtNRT1.7具有典型跨膜结构域。同源性分析结果显示,NtNRT1.7与拟南芥AtNRT1.7的同源性达57.23%。亚细胞定位结果表明该蛋白定位在细胞膜上,是一个典型的膜蛋白。启动子分析和不同胁迫处理的qRT-PCR结果显示,NtNRT1.7主要在成熟叶中高表达,并受低氮诱导抑制表达,受干旱、低温、高盐等胁迫诱导增强表达,表明NtNRT1.7基因可能参与非生物胁迫条件下硝酸盐的再利用。      

烟草OSCA基因家族鉴定及非生物胁迫诱导表达模式分析

高渗门控钙渗透通道(OSCA,hyperosmolal-gatedcalcium-permeable channel)是一种Ca²⁺非选择性阳离子通道,OSCA家族含有钙依赖性通道DUF221结构域。为了进一步了解烟草OSCA基因家族特征和功能,本研究从栽培烟草K326基因组中鉴定到23个OSCA家族基因,并对NtOSCA家族系统进化关系、基因结构与蛋白结构域、启动子、不同组织器官及干旱和盐胁迫下表达模式进行分析。根据进化关系,NtOSCA基因家族被分为4个亚家族,并且同一亚家族成员间蛋白及基因结构相似。启动子分析结果表明,NtOSCA家族基因启动子中存在着多种不同的胁迫响应元件,其中干旱响应元件和脱落酸响应元件较多。进一步组织表达分析结果表明,NtOSCA基因家族成员在不同组织的表达量不同。干旱和盐胁迫表达模式分析表明,20个NtOSCA基因在干旱胁迫下表达量上调,15个NtOSCA基因在盐胁迫下表达量上调。这说明OSCA基因家族在烟草抗旱和抗盐胁迫中具有重要作用。     

普通烟草NAC转录因子家族抗逆基因筛选与表达分析

[背景和目的]NAC(NAM/ATAF/CUS2)家族是植物特有且最大的转录因子家族之一,广泛参与植物的生长发育调控和逆境胁迫应答.为筛选烟草抗逆NAC目标基因.[方法]以公开的普通烟草品种K326的注释蛋白序列为参考,与拟南芥NAC蛋白序列同源比对,结合功能域分析,进行普通烟草的NAC转录因子鉴定,并利用生物信息学软...     

普通烟草脂氧合酶基因家族鉴定及表达模式分析

脂氧合酶（LOX）是脂肪酸代谢途径的关键酶,在植物的生长发育及多种逆境胁迫响应过程中发挥重要作用。本研究对烟草基因组中的LOX家族成员进行鉴定,并利用进化分析、共线性分析和表达分析等方法解析LOX家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在普通烟草中共鉴定得到18个LOX基因,其中12个LOX基因被锚定在染色体上。系统进化分析表明,普通烟草中新鉴定的LOX家族成员被分为9-LOX和13-LOX两个亚家族,其中13-LOX又可被分为Type I和Type II两个亚类。共线性分析表明,烟草NtLOX07、NtLOX10基因分别与拟南芥AtLOX05、AtLOX01基因形成同源基因对,并且大部分同源基因之间具有相似的表达模式。表达模式分析发现,普通烟草LOX基因表达具有一定的组织特异性,并且NtLOX06等基因能够被机械损伤和茉莉酸甲脂（MeJA）处理显著诱导。因此,普通烟草LOX家族成员可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要的作用。     

烟草祖先种及重要野生种PDR1基因的生物信息学分析

植物的多向耐药性（Pleiotropic drug resistance, PDR）转运蛋白隶属于ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族的G亚家族。该类蛋白参与植物多种初生、次生代谢物的跨膜运输,在植物的生长发育、响应逆境胁迫、解毒过程中起着重要作用。近年的研究还表明,该蛋白与多种植物对真菌病原的抗性有关。本文以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥PDR12蛋白、烟草的PDR1基因为探针,通过搜索同源序列,从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的PDR基因、蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构、功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以本氏烟（Nicotiana benthamiana）NbPDR1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以普通烟草（Nicotiana tabacum）NtPDR1基因为例,预测了其基因编辑位点。结果表明,这些PDR基因相似性高,均编码跨膜蛋白,具有典型的跨膜结构域和核酸结合结构域。该基因启动子区有多个与病原真菌诱导、干旱等逆境胁迫响应相关的元件,暗示该基因可能是抗真菌病害、响应逆境胁迫的广谱抗性基因。最后,本文预测的基因编辑位点,为烟草PDR基因的功能研究、基因编辑及抗病育种提供理论基础。      

普通烟草GATA转录因子家族鉴定及基因表达分析

GATA转录因子在调控植物的生长发育和逆境胁迫应答等过程中具有重要作用。为了明确烟草中GATA基因的结构与功能,基于同源搜索和结构域鉴定的方法从普通烟草基因组中鉴定出57个GATA基因家族成员,分别命名为NtGATA1~NtGATA57。基因结构、保守结构域和系统进化的生物信息学分析表明:烟草GATA基因家族成员可分为4个亚族,且同一亚族成员核心结构域氨基酸序列组成非常保守,各基因成员的外显子数目在1~17之间。转录组数据分析表明:大多数NtGATA基因在烟叶衰老的不同时期均有表达,而且不同家族成员的表达模式存在差异;实时荧光定量PCR分析发现:10个NtGATA基因对冷、盐和干旱等非生物胁迫存在不同程度的响应。说明烟草GATA基因家族成员在烟叶成熟衰老及逆境响应过程中可能发挥了重要作用。      

普通烟草抗渗透胁迫基因NtP5CS的克隆与表达分析

从普通烟草中克隆脯氨酸合成的关键酶基因P5CS,分析其序列特征、进化关系、表达模式,以期为烟草的抗逆研究奠定基础。设计兼并引物获得P5CS基因中间片段,利用RACE技术扩增其全长cDNA;采用生物信息学技术分析该基因的序列结构及其编码蛋白的保守域及基本特性;利用RT-PCR研究其表达模式。从受干旱胁迫诱导的普通烟草品种中烟14中克隆到全长为2584bp的烟草P5CS基因,命名为NtP5CS,GenBank登录号为HM854026,开放读码框为2160 bp,编码719个氨基酸。经Blast同源性比对分析,该序列与番茄tomPRO2基因在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。系统进化树分析显示,NtP5CS与番茄tomPRO2基因可能是直系同源基因。RT-PCR分析表明,干旱、低温、ABA、高盐等胁迫条件均可诱导NtP5CS基因的上调表达,且在旺长期和胁迫条件下根和叶中表达量最高。首次从普通烟草中克隆得到P5CS基因,该基因对水分胁迫响应,可能参与普通烟草抗渗透胁迫反应。