普通烟草NtNAC055基因的克隆、鉴定及表达分析

NAC家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物生长发育以及应对环境胁迫中起着至关重要的作用，克隆和验证烟草中NAC相关基因可为烟草抗性育种提供理论依据。本研究采用RT-PCR方法从普通烟草K326根部cDNA中克隆到NtNAC055基因，对NtNAC055及其编码蛋白进行了生物信息学分析、表达模式分析、亚细胞定位和转录激活等相关试验。结果发现，NtNAC055基因的CDS序列全长为1032 bp，NtNAC055蛋白具有典型的NAC结构域，编码一个具有343个氨基酸的NAC转录因子；通过进化分析发现，烟草NtNAC055与拟南芥ANAC055同源性较高，同属于RD26亚家族；通过亚细胞定位分析以及转录激活分析发现，NtNAC055蛋白在细胞核中且具有转录激活活性；运用qRT-PCR技术，对该基因不同组织和胁迫处理后的表达进行了分析，结果显示，NtNAC055基因在根、茎、叶、花和腋芽中均有表达，且在根部表达量最高；同时，该基因受干旱和热胁迫的诱导，表明烟草NtNAC055基因可能参与了烟草的非生物胁迫应答反应。     

普通烟草SBP转录因子家族的全基因组鉴定及其进化和表达分析

SBP转录因子家族作为植物特异性的转录因子具有重要的生物学功能,广泛参与花和果实发育等诸多生命过程。利用普通烟草(Nicotiana tabacum)TN90基因组数据,通过隐马尔科夫模型检索,SMART和Pfam分析,鉴定了普通烟草SBP转录因子家族成员;通过多序列比对鉴定并分析了普通烟草SBP结构域的结构特征;通过邻接法、极大似然法进行了系统发育分析;分别利用GSDS和MEME对SBP转录因子家族成员的基因结构和蛋白保守结构域进行了分析;利用普通烟草TN90转录组数据分析了SBP转录因子家族成员在不同组织和时期的表达情况,并对鉴定出的SBP转录因子家族成员进行了GO注释分析。结果表明,普通烟草基因组编码32个SBP转录因子家族成员,氨基酸序列长度差异较大;系统发育分析表明,所有的SBP转录因子家族成员可分为8个亚家族。转录组数据显示,SBP基因家族成员在不同组织和时期中表达迥异,但在花器官中均有较高的表达量。GO注释结果表明,该家族成员作为转录因子,在植物的生长发育、逆境响应等过程中发挥作用。本研究为烟草及其他植物中SBP转录因子家族基因的鉴定和功能研究提供了基础。     

普通烟草DREB转录因子的序列鉴定与表达分析

DREB转录因子含有一个保守的AP2/ERF结构域,在植物抗逆过程中起关键作用。利用生物信息学分析手段,以拟南芥DREB家族成员序列为参照,在普通烟草(Nicotiana tabacum)基因组公共数据库中鉴定出了68个DREB转录因子。对烟草DREB转录因子家族进行了理化性质、系统进化、保守结构域和表达分析。结果表明,普通烟草基因组编码68个DREB转录因子家族成员,氨基酸数目差异较大;系统发育分析表明,拟南芥和烟草的DREB转录因子共125个成员形成6个进化分支,其中烟草比拟南芥缺少A6分支;结构域分析表明,同一分支内的DREB转录因子的保守结构域以及motif具有高度的一致性;组织表达分析表明,大多数DREB家族基因在烟草中表达量较低,在衰老、干旱和病害胁迫下基因表达量较多。此研究将为烟草DREB转录因子的深入分析奠定了生物信息学基础。     

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。      

TaNAC提高转基因烟草的抗旱功能

NAC (NAM-ATAF-CUC)转录因子在植物逆境胁迫应答反应中发挥重要作用。通过同源克隆的方法从小麦中分离得到一个编码NAC转录因子的基因--TaNAC,该基因编码的蛋白序列结构特殊,N端为保守性差的NAC保守域,只包含A,B,D三个亚结构域,进化关系上与DREB家族更近,其C端共同享有多个基序。实时荧光定量PCR实验证实TaNAC基因受干旱诱导24 h后强烈表达。将该基因构建到PBI121双元植物表达载体的35S启动子下游,通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草,获得T1代转基因苗。模拟干旱胁迫处理实验表明,过量表达TaNAC的转基因烟草表现出明显优于野生型对照的抗旱功能,说明TaNAC基因的过量表达能够提高烟草抗旱能力,TaNAC可以作为烟草抗旱育种的优良候选基因资源。      

普通烟草NtNAC072基因的克隆、鉴定及表达模式分析

NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、衰老及生物或非生物胁迫中发挥着重要的调控作用。为明确烟草转录因子NtNAC072的生物学功能,在普通烟草中克隆了NtNAC072基因,利用生物信息学分析结合亚细胞定位和转录激活实验对该基因功能进行初步鉴定,并通过实时荧光定量PCR方法研究基因的表达模式。结果表明,NtNAC072转录因子N端有典型的NAC结构域并且较为保守;进化分析表明,普通烟草中NtNAC072与拟南芥AtNAC072同源;亚细胞定位和转录激活实验结果表明,NtNAC072定位于细胞核中并具有转录激活活性;表达模式分析发现,NtNAC072基因表达具有特异性,其在衰老叶片中表达量较高并且受干旱胁迫、盐胁迫、脱落酸处理诱导。因此,作为NAC型转录因子NtNAC072可能在烟草叶片衰老、落黄以及非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。     

普通烟草WOX转录因子家族的全基因组鉴定及分析

  背景  WOX（WUSCHEL-related homeobox）转录因子家族是植物特有的一类转录因子家族,被报道参与生长发育、细胞间通讯、干细胞分裂分化稳态调控和器官发育等过程。  方法  利用比较基因组学和生物信息学的方法,在烟草基因组中对WOX转录因子成员进行鉴定,并进行进化分析、共线性分析、保守基序分析以及表达模式等分析。  结果  （1）从烟草基因组中鉴定出23个WOX转录因子家族成员编码基因,其中15个NtWOX基因定位到染色体上;（2）系统发育分析表明,普通烟草和拟南芥的WOX转录因子被分成了3个亚支和9个亚家族;（3）共线性分析发现若干普通烟草NtWOX基因存在于普通烟草与拟南芥基因组的共线性区段中;（4）复制事件分析表明串联重复或者全基因组重复事件在普通烟草WOX家族扩张中起重要作用;（5）保守基序分析表明同一亚家族内NtWOX成员的保守基序的组织形式高度相似;（6）表达分析表明普通烟草NtWOX基因表达具有组织特异性;（7）GO注释分析发现普通烟草NtWOX转录因子参与组织器官发育、细胞间通讯过程和胁迫响应等生物学过程。  结论  本研究在普通烟草中鉴定并系统分析了WOX转录因子家族成员,为其功能研究奠定基础。      

普通烟草Dof转录因子家族的全基因组鉴定及分析

Dof（DNA binding with one finger）蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物的多种生命进程中发挥着重要作用。为解析烟草中Dof家族成员在生长发育过程中的潜在作用,本研究利用比较基因组学、进化分析、共线性分析等方法解析烟草中的Dof家族成员的潜在生物学功能。结果表明,在烟草基因组中共鉴定到69个Dof转录因子,其Dof功能域在进化上十分保守,根据系统进化分析结果将其划分为9个亚家族。共线性分析表明,烟草中的16个Dof基因与拟南芥17个Dof基因有27个共线性基因对,同时,25个NtDof基因被检测到存在17个全基因组复制对,表明复制事件在烟草Dof基因家族的扩张中起关键作用。此外,表达模式分析表明NtDof基因的表达存在明显的组织特异性,其中NtDof05和NtDof28基因可能与根系生长发育有关。本研究对烟草基因组中的Dof转录因子进行了系统的鉴定和分析,为烟草Dof转录因子家族成员的功能研究奠定了基础。     

烟草ABF转录因子基因的克隆与生物信息学分析

为获得烟草AREB/ABF(ABA响应元件结合蛋白/ABRE结合因子)家族转录因子基因序列,进一步提高烟草的抗渗透胁迫能力,通过同源比对和RT-PCR技术,从烟草品种红花大金元中克隆到烟草AREB/ABF家族转录因子NtABF1(GenBank登录号为KF736849),NtABF2(GenBank登录号为KF736850)基因编码序列,并进一步利用生物信息学分析软件对这两个转录因子的蛋白理化性质、高级结构和生物学功能进行了预测。结果表明:NtABF1基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长999 bp,编码332个氨基酸,蛋白分子量36.45 kDa,等电点9.04;NtABF2基因ORF长1305 bp,编码433个氨基酸,蛋白分子量46.92kDa,等电点9.35。NtABF1和NtABF2均为含有BRLZ(Basic Region and Leucine Zipper)保守结构域的亲水蛋白,不含信号肽与跨膜结构。其高级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主,β转角和延伸链含量较少。在亚细胞水平上,NtABF1和NtABF2均定位于细胞核。磷酸化位点分析表明,两蛋白均含有丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸等激酶识别位点。进化分析和多序列比对结果表明,NtABF1与AtAREB3的进化关系最近,序列相似性达54.49%;NtABF2与SlAREB1,StABF1和StABF的亲缘关系较近,序列相似性分别为83.63%,83.52%和83%。功能预测结果显示,NtABF1和NtABF2均为转录调控因子。     

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.5基因的克隆及功能分析

  背景和目的  低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因在植物吸收和转运硝态氮过程中发挥重要作用,为研究烟草NRT1家族基因在烟草氮素利用中的作用。  方法  从栽培烟草品种K326中克隆获得NtNRT1.5的全长cDNA序列,利用生物信息分析、qRT-PCR技术和转基因技术系统分析NtNRT1.5基因的序列特征、表达模式及在提高烟草氮素利用效率方面的功能。  结果  NtNRT1.5全长序列包含1800 bp开放阅读框、编码599个氨基酸,编码的蛋白质具有NRT基因家族的共有结构特征,与拟南芥AtNRT1.5相似性达到59.28%。亚细胞定位结果表明NtNRT1.5蛋白定位在细胞膜上,其启动子中包含多个与硝酸盐（A(C/G)TCA）、胁迫（MYB）、根系特异表达（ROOT MOTIF BOX）相关的响应元件。表达模式分析结果表明NtNRT1.5主要在根部表达,其次是衰老叶片和茎,新叶基本不表达;低氮抑制其在根系中的表达,说明NtNRT1.5主要负责正常条件下的硝酸盐的吸收;低氮条件下,NtNRT1.5过表达显著提高了转基因烟株的氮素利用率。  结论  NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运上行使重要功能,通过提高过表达烟草的氮素利用率,增加植株的生物量。本研究为后期培育烟草氮高效利用新品种提供了理论依据。      

编辑烤烟多酚氧化酶基因NtPPO8后的效应分析

  目的  探究NtPPO8基因在烟草中的功能以及对烟叶耐烤性和烤后烟质量的影响。  方法  以烤烟品种NC89为材料,利用CRISPR/Cas9技术对NtPPO8进行定向编辑,获得纯合突变植株,测定并分析原品种和突变体在叶龄60 d时的基因表达量和植物多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）活性差异,探究NtPPO8基因对烘烤过程中的PPO活性以及烤后烟的多酚物质含量的影响。  结果  （1）共获得6株T₀代纯合突变体,突变均发生在靶位点上,为1个碱基的插入突变。（2）4个T₁代编辑株系的NtPPO8表达水平显著下降,所有编辑株系的PPO活性显著下降。（3）T₁代编辑株系烘烤过程中的PPO活性低于原品种,烤后中部叶总酚含量显著高于原品种。  结论  定向编辑NtPPO8基因后,降低了其在烟叶中的表达量,抑制了烟叶在烘烤过程中的PPO活性,有助于烤后烟多酚类物质的积累。      

烟草HQT基因超量表达对次生代谢物质一咖啡酰奎尼酸和黄酮醇合成的影响

  背景和目的  一咖啡酰奎尼酸（CQAs）和黄酮醇是植物重要的苯丙烷类次生代谢物质,对人体健康有益,然而在烟叶中含量甚微。  方法  NtHQT是烟草中调控一咖啡酰奎尼酸合成最后一步的一种酰基转移酶,为验证NtHQT是否参与黄酮醇的合成,本研究构建了pCXSN::NtHQT超量表达载体,转化野生烟草三生烟。  结果  转基因烟叶中一咖啡酰奎尼酸的含量最高可提高10.34倍,芦丁和山奈酚芸香糖苷含量最高可分别提高17.83和16.97倍,而生长表型与野生型烟草没有明显差异。  结论  NtHQT基因在不影响烟草的生长发育的前提下,不仅参与调控一咖啡酰奎尼酸的合成,也具有正向调控黄酮醇的生物合成的功能,提高烟叶中芦丁和山奈酚芸香糖苷含量。      

外源添加肉桂醛提高烟草幼苗抵御盐胁迫机理的研究

  目的  为了探究添加肉桂醛对Na₂SO₄胁迫下烟草幼苗生长的影响机制。  方法  以烤烟K326为材料,在烟草幼苗期用不同浓度的Na₂SO₄和肉桂醛进行处理,结合烟草幼苗根系发育状况、活性氧含量、抗氧化酶活性及相关基因表达量等指标进行分析。  结果  Na₂SO₄浓度越高,对烟草生长的抑制作用越明显,烟苗根系发育越缓慢,H₂O₂积累越多;75 mmol/L Na₂SO₄胁迫下,0~25 μmol/L肉桂醛可以促进烟草幼苗根系生长,降低H₂O₂和MDA含量,诱导降低SOD和POD的酶活,提高CAT酶活,从而提高幼苗的抗氧化能力,增强烟苗的抗盐能力。  结论  在烟草幼苗阶段,20 μmol/L的肉桂醛可以有效提高烟草幼苗对75 mmol/L Na₂SO₄的抵抗能力,主要通过促进根系发育,调节活性氧含量,诱导抗氧化物质活性变化,缓解盐胁迫的抑制作用。      

普通烟草生长素抑制因子NtIAA17的克隆与功能分析

  背景和目的  盐胁迫会抑制作物的生长发育, 从而影响作物的产量和品质。生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白是响应生长素信号的关键因子, 参与调控植物的生长发育和响应非生物胁迫。  方法  为了研究烟草生长素反应基因NtIAA17在烟草生长发育过程中的功能, 以烟草K326为试验材料, 通过克隆获得烟草NtIAA17基因, 利用生物信息学分析其序列特征, qRTPCR技术分析NtIAA17在烟草不同组织及盐胁迫处理0~12 h的表达模式, 利用转基因技术获得过表达NtIAA17-OX(NtIAA17-overexpression)转基因烟草, 对其进行响应盐胁迫的功能鉴定。  结果  NtIAA17基因片段为624 bp, 编码207个氨基酸; 相对分子质量为23.07 kD, 理论等电点为8.24, 该基因启动子区含有顺式作用元件与激素及胁迫相关; 具有Aux/IAA家族蛋白的四个结构域(I-IV)和保守序列。NtIAA17基因与菠菜生长素抑制基因MoIAA13亲缘关系最近; 亚细胞定位分析表明, NtIAA17蛋白是核定位蛋白。qRT-PCR结果表明, NtIAA17基因在茎和老叶中高表达, 盐胁迫2 h时表达量最高。在盐胁迫条件下, NtIAA17-OX转基因烟草与野生型相比, 生物量显著增加, 脯氨酸含量积累增加, 而MDA含量减少, 抗氧化酶基因NtSOD、NtPOD表达量增加。  结论  NtIAA17基因可以响应盐胁迫信号, 通过提高转基因烟草的抗氧化性来抵御盐胁迫带来的伤害, 增加植株的生物量; 本研究为后续耐盐胁迫分子育种提供候选基因和理论依据。      

外源添加麝香草酚提高烟草幼苗抵御盐胁迫机理的研究

  目的  土壤中盐分含量过高严重影响植物生长,引起盐胁迫。为探寻可以提高烟草耐盐性的外源缓解物质,课题组前期筛选了大量化合物,选用缓解效果最优的麝香草酚进行耐盐胁迫机理的研究。  方法  以烤烟K326为材料,对烟草根尖进行根尖细胞死亡的鉴定和钠钾离子流速的测定,并结合烟草幼苗根长、活性氧含量、抗氧化酶含量等生理指标,探究麝香草酚缓解烟草幼苗盐胁迫的机理。  结果  （1）添加麝香草酚显著降低了盐胁迫对烟草幼苗根系生长的抑制。（2）麝香草酚降低了盐胁迫下植株体内H₂O₂和MDA的积累、缓解了盐胁迫造成的根尖细胞死亡。（3）麝香草酚缓解了盐胁迫造成的Na+吸收和K+外排。  结论  外源添加麝香草酚可以通过降低H₂O₂造成的氧化损伤,维持细胞内钠钾离子平衡来缓解盐胁迫对烟草幼苗的伤害。      

喷施外源EBR和H2O2对低温胁迫烟苗恢复生长期生理特性的影响

  目的  探讨表油菜素内酯（EBR）和过氧化氢（H₂O₂）对低温胁迫后烟草幼苗生理和生长特性的影响。  方法  以烤烟品种K326为材料,研究低温胁迫后喷施外源表油菜素内酯（EBR,0.01 mg/L）和过氧化氢（H₂O₂,340 mg/L）对烤烟苗期抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性、渗透调节物质、丙二醛（MDA）和生物量的影响。  结果  （1）烟草苗期低温胁迫（CK1）4 d与正常生长（CK2）烟株相比SOD活性降低,POD、CAT活性升高,MDA、可溶性糖和脯氨酸含量上升,可溶性蛋白含量下降,生物量降低;（2）低温胁迫结束后,喷施外源EBR（T1）和H₂O₂（T2）相比低温对照（CK1）,恢复生长12 d烟苗SOD、POD、CAT活性分别提高61.87%和47.37%、239.06%和193.11%、168.07%和139.63%,MDA含量分别降低60.00%和50.00%,渗透调节物质含量和生物量显著增加;（3）喷施外源EBR（T1）和H₂O₂（T2）与正常生长（CK2）烟株相比,在恢复生长8 d和12 d时SOD、POD、CAT活性与可溶性糖含量无显著差异,MDA含量降低,脯氨酸含量显著上升。  结论  喷施外源EBR（0.01 mg/L）和H₂O₂（340 mg/L）能加快低温胁迫后烤烟K326幼苗的生理和生长恢复进程。