微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中的诱导表达研究

目的:研究重组毕赤酵母GS115PJ5诱导表达微小毛霉凝乳酶过程中酵母生长、产酶及培养液总蛋白变化情况。方法:测定毕赤酵母生长曲线、凝乳酶凝乳活性、蛋白水解活性、培养基上清液总蛋白含量。结果:毕赤酵母在开始诱导24h后即进入稳定生长期,并保持到240h,然后进入衰亡期。SDS-PAGE显示在分子量约为47000处有目的凝乳酶条带,凝乳酶在培养144h后开始大量积累,酶活性迅速提高,192h时凝乳活性达到最大值300SU/mL,蛋白水解活性为10.75U/mL,凝乳活性与蛋白水解活性的比值(C/P)达到最大值27.9,上清液总蛋白含量为0.189mg/mL。结论:微小毛霉凝乳酶基因在毕赤酵母中得到了有效的表达。     

微小毛霉凝乳酶基因的克隆与表达

微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶是微生物凝乳酶的主要来源之一,但与传统的牛凝乳酶比较具有一定的缺陷。为将其采用基因工程的方法进行改造获得理想的凝乳酶,本研究克隆到微小毛霉凝乳酶基因,将其插入原核表达载体pTWlN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/M。转化大肠杆菌BL21(DE3),后经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析,获得了重组蛋白。     

微小毛霉与米黑毛霉凝乳酶的制备及其凝乳质构特性研究

将经乙醇分步沉淀所制得的微小毛霉和米黑毛霉凝乳酶以小牛皱胃酶为对照在不同温度、不同时间和不同pH值下凝乳,以下压过程的平均力为衡量标准,对其物性进行了比较,得出在相同条件下,米黑毛霉凝乳酶的凝乳要好于微小毛霉凝乳酶,并在高温和酸性环境要比微小毛霉凝乳酶稳定。     

微小毛霉发酵制取凝乳酶的培养基优化研究

利用响应面分析法优化微小毛霉的发酵培养基,提高微小毛霉凝乳酶的凝乳活力。在单因素实验的基础上,用Design-Expert软件对实验数据进行多元回归分析,建立了3种因素与凝乳酶活力之间的函数关系,得出在基础发酵培养基中加入的氯化钙、乳清粉和葡萄糖的最佳浓度分别为0.58%、0.64%和1.13%,此时,微小毛霉凝乳酶的凝乳活力的理论值为1150.81SU/mL,验证平均值为1109.7SU/mL,与预测值基本一致。     

不同因素对凝乳酸活力的影响

对犊牛羔羊第四胃及微小毛霉（Ｍｕｃｏｒｐｕｓｉｌｌｕｓ）三种凝乳酶进行了最适温度、ｐＨ稳定范围、热稳定性、不同ｐＨ对效价的影响及各种离子影响的研究．结果表明，牛、羊、微小毛霉凝乳酸的最适温度分别为６０℃、５５℃和６５℃；ｐＨ稳定范围分别是２－７、３－６和３－８；其热稳定性依次为，牛＜羊＜微小毛霉，牛凝乳酸５５℃处理１０ｍｉｎ基本失活，羊凝乳酸６０℃处理１０ｍｉｎ完全失活，微小毛霉凝乳酶６５℃处理１０ｍｉｎ活力全部丧失，三种酶随奶液之ｐＨ值降低而凝乳加快；Ａｌ－－－对上述三种凝乳酸都有较强的促凝乳作用，Ｃａ（＋＋）、Ｆｅ（＋＋）有一定促进作用，而Ｚｎ（－－）、Ｃｕ（－－）对三种酶却有一定抑制凝乳作用，对微小毛霉凝乳酶更为明显，Ｋ＋、Ｌｉ－、Ｍｇ（＋＋）及Ｎａ－均无明显作用。     

豆渣菌糠浅盘发酵制备微小毛霉凝乳酶的研究

为考察将豆渣和金针菇菌糠这两种废弃资源应用于微小毛霉凝乳酶固态浅盘发酵的效果,以医用托盘作为发酵容器,以干燥后的豆渣菌糠1∶1(质量比)混合物为培养基,以固液比1∶1(质量比)加水润湿培养基,121℃灭菌冷却后接种微小毛霉进行发酵.发酵72 h时,加水提取酶,将酶液进行浓缩、盐析、透析以及冷冻干燥后获得凝乳酶粉末.结果显示,以豆渣和菌糠混合物为发酵培养基时,其单位发酵面积最大产酶量可达到1 860 SU/cm2,略高于对照麦麸1 618 SU/cm2的发酵水平,这表明豆渣和菌糠混合物能够替代麦麸用于微小毛霉凝乳酶的固体浅盘发酵.此外,酶提取液经初步分离纯化,可获得凝乳活力为7 497 SU/mg、水解酶活为0.22 Ucas/mg、纯度大于50％的凝乳酶粉末制剂.     

微生物凝乳酶固体发酵条件的研究

目的:研究微小毛霉产凝乳酶的固体发酵奈件.方法:研究了固体发酵中的固液比,考察了碳氮源、无机盐及发酵时间、发酵温度、起始pH、接种量等对产酶的影响.结果:培养基固液比为1:0.8,产酶最适培养基为:麸皮10g、水8g、硝酸铵1 g、氯化钙0.08g;最佳产酶条件为28℃、接种量为10%、培养72h、起始pH6.5.结论:微小毛霉诱变菌株HL-1可高效产凝乳酶.     

微小毛霉凝乳酶的酶学性质研究

目的：研究微小毛霉(HL-1)凝乳酶的酶学性质。方法：研究了酶的最适温度,酶的pH值稳定性和热稳定性,探讨了金属离子、化学物质和钙离子对酶活力的影响,加酶量对酶反应的影响,测定了酶的蛋白水解活力、相对分子量和酶的Km与Vm值。结果：酶的最适温度为60℃; 最适pH值为5.5;酶在65℃保温5min活力损失95%;钙离子是酶的激活剂,其含量与酶活力正相关,而钾离子则对酶有抑制作用;氯化钠对酶活力的影响不大,但是SDS可导致酶严重失活;加酶量与反应时间成反比;酶的蛋白水解活力为485.3U/g;相对分子质量是42000,Km为0.02380mol/L,Vm为1.1227mg/min。结论：得出了微小毛霉(HL-1)凝乳酶的酶学性质。     

豆渣及金针菇菌糠混合发酵制备凝乳酶的研究

将干燥后的豆渣和干金针菇菌糠以1:1(m/m)比例混合,再以固液比1:1(m/m)加水混合,接种微小毛霉,于30℃、相对湿度75%下固体发酵3 d,获得微小毛霉凝乳酶,最高酶活力达到9412 SU/g,略高于对照麦麸固体9081 SU/g的发酵水平。此外,本文还考察了发酵时间、发酵温度、培养料水分、无机盐、碳源、氮源以及接种量等参数对豆渣和金针菇菌糠混合固体发酵产凝乳酶的影响。     

重组微小毛霉凝乳酶的分离与纯化

用硫酸铵分级沉淀分离提取重组微小毛霉凝乳酶(GS115/pPICZαA-Mucor pusillus rennet),经过Sephadex G-75分子筛和DEAE-52离子交换2次柱层析纯化,酶的比活力由2078U/mg提高为10526U/mg,纯化倍数超过5倍,纯化的重组凝乳酶经SDS-PAGE电泳分析纯化的重组凝乳酶分子质量约为46kDa。     

重组毕赤酵母产凝乳酶发酵参数优化的研究

以重组毕赤酵母GS115PJ5(含微小毛霉凝乳酶基因)为研究对象,通过单因素实验确定其最佳生长条件:培养温度30℃、培养基pH值5.2、摇床转速280r/min、培养基装瓶量5%(12.5mL/250mL)。在单因素实验的基础上通过Plackett-Burman实验筛选出培养基装瓶量、甲醇添加量、培养基pH值等3个影响重组毕赤酵母产凝乳酶的主要因素,并通过响应面实验确定三者有利于产酶的最佳值分别为13.06%、1.52%、6.15,在此条件下,凝乳酶活力达到最大值即491.7SU/mL,验证实验证明模型预测值准确、可靠。     

凝乳酶的基因克隆、序列分析及初步表达

PCR扩增得到微小毛霉凝乳酶结构基因并测定其核苷酸序列，用DNAman软件分析其核苷酸序列及推衍得到的多肽序列，结果表明扩增得到的片段为凝乳酶基因。构建了重组菌Pichia pastoris KM71／PIC9K-mcp，通过G418抗性筛选得到具有多拷贝基因的整合重组菌MK3。用甲醇诱导进行初步发酵试验，测得重组菌MK3酶活为5．4U／ml。     

重组微小毛霉凝乳酶的发酵条件及其酶学性质

通过对重组微小毛霉凝乳酶(recombinant Mucor pusillus rennet,RMPR)发酵条件的研究,确定甲醇诱导体积分数1%、初始OD600nm 0.5、装瓶量100mL/500mL 摇瓶、诱导时间96h 为发酵最适条件。培养液离心取上清用硫酸铵分级沉淀获得粗酶液,并对其酶学性质进行研究,经测定该酶的最适反应温度为60℃,30～45℃酶较稳定,保温90min,剩余凝乳酶活力达86.5%;酶在pH5.5～7.0 范围内,随pH 值升高,凝乳酶活力逐渐降低,pH5.5时凝乳酶活力最高。当Ca2+ 浓度为0.03mol/L 时凝乳酶活力最高,Na+ 浓度对凝乳酶活力没有明显影响,Ni2+ 和Fe2+对酶有抑制作用,Mn2+、K+、Mg2+ 对酶有一定的促进作用。     

响应面法优化“曲拉”凝乳酶干酪素凝乳工艺

以"曲拉"为原料,采用筛选的微小毛霉凝乳酶为凝乳剂,在酶添加量、凝乳温度、凝乳pH值、CaCl2添加量4个单因素试验基础上,利用响应面试验设计法进行试验设计,取得曲拉凝乳酶干酪素出品率与各单因素的函数关系,并建立曲拉凝乳酶干酪素凝乳工艺模型。回归方程和响应曲面结果表明:4个因素对曲拉凝乳酶出品率影响大小依次为:凝乳pH值>凝乳酶添加量>CaCl2添加量>凝乳温度;最佳凝乳工艺为凝乳pH6.2、凝乳酶添加量0.05g/kg、CaCl2添加量2.5%、凝乳温度42℃。在此条件下,曲拉凝乳酶干酪素的理论出品率为75.23%,实验验证出品率为73.54%。     

响应面法优化微小毛霉固态发酵生产凝乳酶工艺研究

采用麦麸培养基进行固态发酵,以研究发酵条件对产酶活力的影响,在此基础上应用Plackett-Burman、最陡爬坡实验和Box-Behnken实验设计,对微小毛霉的固态发酵培养基进化以达到最佳产酶量。实验结果表明,最佳发酵条件为:发酵时间5d,发酵温度30℃,固液比值0.75,接种量为3份,测得凝乳酶酶活为828U/mL。并且当麸皮质量为15.50g、(NH4)2SO4质量为0.15g、KH2PO4质量为0.08g时,微小毛霉产凝乳酶活力达到1200U/mL。较未优化前活力提高了66.67%。     

甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶（I3EB99）的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21（DE3）表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为（15 870±1.17）SU/g,蛋白水解活力为（263.81±0.94）U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。     

干酪用牛凝乳酶替代品的研究进展

牛凝乳酶具有高凝乳活性和低非特异蛋白水解活性而广泛用于干酪制备。随着干酪市场的逐年增长,牛凝乳酶出现供不应求,其替代品应运而生,包括其他动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶、重组凝乳酶。在这些替代品中,重组牛凝乳酶显示出与天然牛凝乳酶相似的酶学特性,并且纯度更高,制作的干酪品质更好。目前已经有重组牛凝乳酶上市出售,成功替代了天然牛凝乳酶,但关于提高重组牛凝乳酶表达量与催化活性的研究远未止步。文中主要综述了凝乳酶结构、牛凝乳酶的替代品和重组凝乳酶的研究进展,详细综述了一些提高重组牛凝乳酶的表达方法,为外源蛋白在宿主中的高水平表达提供了有效参考。     

牛凝乳酶原基因在大肠杆菌中的高效表达及活性检测

以实验室保存的携带凝乳酶原前体基因的重组载体pMD 19-T/bPPC为模板克隆凝乳酶原基因,经双酶切后与载体pET-30a连接得到重组载体pET-30a/bPC,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。重组蛋白经变性/复性、DEAE-Sepharose Fast Flow纯化和自催化后检测凝乳活性。结果表明,重组凝乳酶原基因在大肠杆菌中高效表达,表达量占菌体总蛋白的68%,采用Arima K方法检测,其凝乳活力达到80 SU/mL。因此,通过大肠杆菌表达系统大量制备具有生物活性的重组牛凝乳酶原的策略是可行的,研究结果为弥补国内天然牛凝乳酶的短缺提供一种途径。     

枯草芽孢杆菌克隆与表达微小毛霉凝乳酶基因

从自制的酒酿利用酪蛋白培养基分离纯化到了一株产凝乳酶的微小毛霉菌株（ZZMZ-19）,从ZZM-19菌株的cDNA文库筛选到了两个凝乳酶基因chl和ch2并实现了凝乳酶基因ch1和ch2在枯草芽孢杆菌菌株（ZZMZ-01）中的的克隆与表达。chl和曲2阳性克隆菌株在酪蛋白培养基r1]发酵30h左右的时间凝乳酶酶活达到最人,分别为48．27SU／mL和41．02SU／mL,相比出发菌株发酵时间缩短了15h。用交联葡聚糖凝胶柱G100分离纯化其发酵卜清液后,用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测得CHII和cHIII分子草分别为32ku和30ku。     

不同凝乳酶对切达干酪成熟的影响研究

本文比较了米黑毛霉凝乳酶、小牛皱胃酶和木瓜蛋白酶制备的切达干酪成熟期间的感官品质和理化性质。结果表明,小牛皱胃酶和米黑毛霉凝乳酶制作的干酪在成熟期60d和90d时,感官评价值达到最大,在90d成熟期内,木瓜蛋白酶干酪的感官评分值始终低于小牛皱胃酶和米黑毛霉凝乳酶;在干酪成熟期间,三种干酪在水分含量、pH、总氮、pH 4.6-SN以及12%TCA-SN含量的变化趋势一致;在成熟期0-90d内,三种干酪蛋白降解程度是小牛皱胃酶干酪米黑毛霉凝乳酶木瓜蛋白酶;在成熟期0-30d时,小牛皱胃酶和米黑毛霉凝乳酶对总氮影响差异不显著(P0.05),成熟期0-30d和60-90d时,这两种酶对干酪pH 4.6-SN以及12%TCA-SN影响差异不显著(P0.05)。