表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的 优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件.方法 以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件.结果 最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6％,培养温度37℃,诱导表达时间5h.蛋白表达量比优化前提高近30％,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg·protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/ (mg·protein)为对照,重组酶的酶活性提高66％.结论 工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高.     

重组α-1,3-葡萄糖苷酶的毕赤酵母表达及发酵优化

Acremonium sp. S4G13来源的α-葡萄糖苷酶基因连接到p PIC9K载体上并在Pichia pastoris GS115中表达。在此基础上对重组菌P. pastoris GS115/pPIC9K-AGL产重组α-葡萄糖苷酶的发酵条件进行了单因素优化试验,结果表明最优条件为:生长阶段接种量10%,甘油体积浓度3%,初始pH 6.0;诱导阶段甲醇初始添加量1%,甲醇补加量0.5%,装液量10%,诱导温度25°C,山梨醇添加量6 g/L。在最优条件下发酵120 h,酶活可达7.8 U/mL,相比优化前酶活1.22 U/mL提升了5.4倍。     

产β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其发酵条件优化

构建β-苯丙氨酸变位酶基因表达重组质粒pET-28apam,并转化大肠杆菌BL21,获得β-苯丙氨酸变位酶基因重组菌。考察培养基初始pH、摇床转速、种龄、发酵时间以及装液量5个因素对β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌产酶活性的影响,确定较佳发酵条件为:培养基初始pH 7.0、摇床转速200r/min、发酵时间24h、装液量50mL/500mL、种龄10h。采用Box-Behnken试验设计,选择了种龄、初始pH、发酵时间3个对β-苯丙氨酸变位酶活力影响较大的因素进行响应面优化。优化结果为:在种龄12.8h、初始pH 6.7、发酵时间25.2h条件下,PAM活力达到11.15 U/mL,比优化前酶活4.87U/mL提高了128.9%。     

重组大肠杆菌产脂肪氧合酶发酵条件优化

为进一步提高重组大肠杆菌（pET-23a-pse-LOX）产脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）的酶活力,利用响应面法对其发酵条件进行优化。通过单因素试验确定诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、接种量、培养基初始pH值和装液量对其发酵产酶的影响。在此基础上,采用Plackett-Burman试验设计从7 个因素中筛选出对LOX产量具有显著效应的因素为诱导时机、诱导时间和培养基初始pH值,并利用Box-Behnken试验设计和响应曲面法分析以确定其产酶的最优发酵条件,即诱导时机为菌液OD600 nm达到1.6、诱导时间34 h、培养基初始pH 7.0。在此条件下,LOX酶活力为（21 261.60±264.03） U/mL,比优化前的（13 553.96±46.64） U/mL提高了56.87%。     

基于关键因素调控发酵生产过氧化氢酶

采用正交试验策略,分析了不同关键因素对重组E.coli发酵生产过氧化氢酶(CAT)的影响,确定CAT合成的最优摇瓶发酵条件为:甘油5 g/L、酵母粉35 g/L、初始pH 7.5、诱导温度为30℃。在3 L发酵罐发酵生产CAT过程中,当转速为300 r/min时,酶活力最高为201 17.2U/mL,最适发酵产酶初始甘油质量浓度为10 g/L。以0.67 g/(L·h)的速率进行流加甘油时,最高酶活达28 243.0 U/mL。在诱导开始时一次性补入16.7 g/L甘油,当发酵至47 h时CAT酶活达到最大值为50 369.5 U/mL,为优化前酶产量的2.5倍。     

苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌的培养

为了提高苯丙氨酸解氨酶的产量和活力,对高效表达圆红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因的重组大肠杆菌JM109进行培养,优化了发酵培养基成分、培养条件以及发酵工艺,结果表明,最佳葡萄糖浓度为20 g/L,碳氮比为7.86,添加5 g/L酵母粉和蛋白胨有利于菌体产酶,最佳发酵液初始pH为7.5,接种量为10 %.通过以上优化,重组大肠杆菌培养18 h时酶活可达到70 U/g(DCW),酶活比原工艺提高了1.6倍.     

重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶发酵条件的优化

利用重组毕赤酵母诱导表达可产生耐高温α-淀粉酶,在摇瓶发酵基础上,从诱导时间、甲醇添加量、pH值、接种量4个因素考察发酵条件对耐高温α-淀粉酶酶活力的影响,结合四元线性回归正交试验设计研究方法构建出甲醇诱导重组毕赤酵母生产耐高温α-淀粉酶的回归模型;优化最佳工艺参数为：诱导时间96h、甲醇添加量0.5%、接种量150mL/100mL、摇床转速200r/min。确定最优工艺条件下,耐高温α-淀粉酶酶活为217.2U/mL。     

非特异性过氧合酶发酵优化及在H2O2检测中的应用

非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase,UPO）能够利用过氧化氢（H2O2）催化多种氧化反应,在工业中具有很大的应用潜力。针对AaeUPO 在毕赤酵母中表达量低以及发酵工艺不清的问题,通过摇瓶发酵优化以及正交试验确定发酵培养基条件,并进一步通过5 L 发酵罐进行放大。结果表明,毕赤酵母摇瓶水平高效表达AaeUPO 的基本发酵条件：甲醇浓度1.00%、培养基初始pH5.5、蛋白胨浓度1.5%、酵母粉浓度1.5%,最优发酵条件下粗酶液酶活达到18.2 U/mL。在摇瓶水平发酵试验的基础上进行5 L 发酵罐放大试验,优化后以接种量10%、诱导温度30 ℃、流加甲醇作为最终工艺条件。最终得到的细胞湿重244 g/L,最高酶活为25.1 U/mL,相较于初期未优化酶活提升了91.6%。将AaeUPO 用于H2O2 检测,AaeUPO 对于H2O2 具有较好的检测性能,检测限达到5 μmol/L,抗干扰性能强。     

固态发酵制备富含纳豆激酶豆渣的工艺优化

本试验通过单因素试验和正交试验,以豆渣纳豆激酶活性为指标,就固态发酵工艺参数进行优化。试验结果表明,最适的发酵条件为培养基初始含水量65%,培养基初始pH 7,发酵温度35℃,接种量4%,发酵时间28h,此条件下通过固态发酵得到的豆渣中纳豆激酶活性为1734U/g。     

基于人工神经网络和遗传算法的普鲁兰酶重组大肠杆菌高密度发酵工艺优化

基于人工神经网络和遗传算法,对重组大肠杆菌（Escherichia coli）BL 21表达热稳定普鲁兰酶的高密度发酵工艺进行优化。在5 L的发酵罐中,通过比较不同发酵温度、pH值及培养基碳氮比（C/N,mol/mol）对细胞量和产物产量的影响,确定最佳发酵工艺。结果表明,诱导前适合细胞生长的发酵条件为发酵温度34.4 ℃、pH 6.87、培养基C/N 6.1;诱导后适合产物表达的发酵条件为发酵温度32.5 ℃、pH 6.69、培养基C/N 5.3,最终获得细胞质量浓度56.5 g/L,重组蛋白产量3.21 g/L,酶活力为268.3 U/mL。     

高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌的构建及其发酵条件优化

通过基因重组技术构建重组苯乙烯单加氧酶基因的高产靛蓝色素大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli AB,研究优化工程菌E. coli AB生物合成靛蓝色素的发酵条件。单因素试验分别考察不同发酵温度、底物质量浓度、起始pH值和接种量4 个因素对于靛蓝色素合成的影响,选取发酵温度、底物浓度和起始pH值3 个对靛蓝色素产量影响显著的因素进行响应面设计试验优化。经模型分析获得优化发酵条件为：底物质量浓度0.95 mg/mL,发酵温度29 ℃,起始pH 6.9。在该条件下,工程菌E. coli AB催化合成靛蓝色素产量为67.65 mg/mL。优化发酵条件的实验结果与预测值相符,说明回归模型切实可行。     

重组麦芽糖转葡萄糖基酶工程菌发酵条件的优化

对重组麦芽糖转葡萄糖基酶工程菌的发酵条件进行优化,通过单因素试验确定该菌株产麦芽糖转葡萄糖基酶的最佳发酵培养基为：糖蜜0.025g/mL、胰蛋白胨0.015g/mL、MgSO4 ·7H2O与K2HPO4的质量为7:1、FeSO4 ·7H2O 0.5g/L;以葡萄糖氧化酶法为指标测得最佳摇瓶发酵条件为：装液量100mL/250mL、转速200r/min、接种量5%、初始pH 7.0、最佳温度37℃、诱导阶段OD600nm=0.6、诱导温度30℃、诱导时间5h、诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度1mmol/L。经优化,重组麦芽糖转葡萄糖基酶的酶活力可达950U/mL,比初始条件下提高了近7倍。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

β- 葡萄糖苷酶基因工程菌发酵工艺优化

以菌体生物量和酶比活力为参考指标,通过单因素和响应面分析法优化β- 葡萄糖苷酶基因工程菌发酵条件,得到最优的发酵条件：温度37.9℃、pH6.6、接种量10%、转速200r/min、诱导时间10h,在此条件下发酵可以使β- 葡萄糖苷酶酶活力达到147.8U/L。     

乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达

以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶（catalase,CAT）。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx．HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

蔗糖异构酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达及重组菌的细胞固定化

分别利用IPTG和乳糖两种诱导物诱导蔗糖异构酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中实现表达,对诱导温度、诱导时机、诱导物浓度、诱导持续时间进行比较分析并优化,确定了二者的最佳诱导条件,在E.coli培养3h后(OD600约为0.9)添加终浓度为0.8mmol/L的IPTG(0.5mmol/L乳糖)在20℃(24℃)条件下诱导14h(12h)能获得最高的蛋白表达量及SIase酶活。在最优条件下以IPTG为诱导物时目的蛋白占总蛋白的41.6%,单位体积培养液中SIase酶活为12.37U/mL,以乳糖为诱导物时分别为27.2%,14.72U/mL,从收获酶活角度考虑可见乳糖作为诱导物的优势;而后利用海藻酸钠包埋法固定化重组菌,转化初始浓度为500g/L的蔗糖溶液,转化10～11h后异麦芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均转化率大于99%,固定化细胞能够连续稳定转化25批次,转化效率相对于原始菌提高了近55%。     

热稳定性过氧化氢酶工程菌株发酵条件的研究

重组大肠杆菌UM2 1携带来自嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的基因 ,在以IPTG作为诱导物时 ,在IPTG浓度为 0 75mmol/L、起始 pH6 5、装液量 5 0mL/2 5 0mL三角瓶的条件下 3 7℃诱导 3h ,酶的表达水平最佳 ;在以乳糖作为诱导物时 ,在乳糖质量浓度为 10 g/L、起始 pH7 5、装液量 5 0mL/2 5 0mL三角瓶的条件下 ,3 7℃诱导 5h ,酶的活力最高。乙酸的存在能够抑制酶的表达。工程菌在最适条件下酶活力可达 3 0 0 0 0～ 3 5 0 0 0U/L以上 ,约是原始菌株嗜热脂肪芽孢杆菌的 10倍。工程菌在无选择压力的条件下连续传代 60代 ,基本保持稳定 ,连续传代 10 0代 ,仍有 80 %左右的菌株携带重组质粒。     

重组融合蛋白MBP-PAI的表达、纯化及酶活测定

为了解决亚油酸异构酶(Linoleic Acid Isomerase,PAI)在大肠杆菌中形成包涵体的问题,选择麦芽糖结合蛋白(Maltose-Binding Protein,MBP)标签和低温诱导表达系统pColdV,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli BL21(pCold-Mpai),并对其诱导表达条件进行了优化。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白MBP-PAI成功表达,重组菌的最佳诱导表达条件为:诱导温度15℃、IPTG添加量0.1 mmol/L、诱导时间12 h,在该诱导条件下,与未融合MBP的PAI相比,MBP-PAI的可溶性表达量为后者的18倍、酶活为后者的1.5倍。经过MBPTrap HP亲和层析柱纯化后,MBP-PAI纯蛋白质的比酶活为1.58 U/mg,能够转化亚油酸形成反10,顺12-共轭亚油酸。