嵌合抗CD20 Fab′诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD2 0基因工程抗体Fab′的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制 ,利用3H掺入法测定嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞生长的影响 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′对Raji细胞的生长具有抑制作用 ,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD2 0Fab′诱导Raji细胞凋亡作用 ,结果显示嵌合抗CD2 0Fab′可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD2 0Fab′通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。     

嵌合抗CD20抗体Fab‘片段三维结构的同源模建

分别以抗CD20Fab‘轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白储备参考蛋白,利用Insight II/MSI的同源蛋白质结构模建系统（homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后,搭建成抗CD20嵌合抗体片段Fab‘的空间构象,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

嵌合抗CD_(20)抗体Fab’片段三维结构的同源模建

分别以抗CD2 0 Fab’轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针 ,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白作为参考蛋白 ,利用InsightII/MSI的同源蛋白质结构模建系统(homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后 ,搭建成抗CD2 0 嵌合抗体片段Fab’的空间构象 ,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示 ,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

嵌合抗CD20抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD20抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD20抗体的轻链和重链可变区，将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中，构建抗CD20抗体IgG的轻链和重链表达载体PK100VL和PGL05VH，并用质脂体法共转染CHO细胞，RT－PCR和ELISA检测结果证实了抗CD20抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD20抗体IgG全分子可与CD20阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。     

抗CD3基因工程嵌合抗体片段Fab′的构建、表达和活性测定

PCR扩增抗CD3单抗轻链可变区(VL)和重链可变(VH)片段基因,将其重组到Fab ′表达载体中,构建成抗CD3嵌合抗体Fab′表达载体,转化大肠杆菌16C9进行可溶性表达 . 产物经蛋白G亲和层析柱纯化.免疫荧光竞争结合实验和3H掺入实验证实能与小鼠抗CD3 IgG HIT3a竞争性结合表达CD3的T淋巴细胞,并促进细胞增殖.     

新型基因工程抗CD20抗体片段F（ab′）2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab′表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重键恒定区CH1C－末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab′表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab′）2表达载体。将该载体转化缩主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab′）在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明：抗CD20F(ab′）2片段具有比Fab′更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体H147与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明：F(ab′）2与Fab′更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长。     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab'')2的构建、表达和活性测定

从抗CD2 0 Fab’表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C 末端的DNA序列 ,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab’表达载体中 ,构建成抗CD2 0抗体片段F(ab’) 2 表达载体。将该载体转化宿主大肠杆菌 16C9,实现了抗CD2 0 抗体片段F(ab’) 2 在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD2 0 特异结合的F(ab’) 2 活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明 :抗CD2 0 F(ab’) 2 片段具有比Fab’更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI4 7与Daudi细胞表面CD2 0 相结合的能力 ;用MTT法检测所得到的数据说明 :F(ab’) 2 比Fab’更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长     

雌黄纳米粒对K562细胞的体外治疗作用及其机制

采用MTT法、细胞形态学观察和流式细胞术检测纳米雌黄对白血病K562细胞生长的影响;通过免疫组化、RT-PCR方法检测雌黄纳米粒处理K562细胞后凋亡相关基因的表达变化．结果表明,雌黄纳米粒能强烈抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,效果明显优于普通雌黄;雌黄纳米粒对K562细胞的bcl-2蛋白、bcl-2mRNA、survivin蛋白以及survivin mRNA表达均有抑制作用,对bax蛋白与mRNA表达均有促进作用,提示其抗肿瘤作用可能与凋亡抑制基因bcl-2、survivin表达减少、促凋亡基因bax表达增强有关,并从mRNA水平上发挥作用,     

抗CD20嵌合抗体Fab''''片段在大肠杆菌中高效表达

利用ＰＣＲ方法从抗ＣＤ２０ＳｃＦｖ表达载体上扩增重链可变区、轻链可变区基因,然后将ＶＨ、ＶＬ基因重组到Ｆａｂ’表达载体中,构建成抗ＣＤ２０嵌合抗体Ｆａｂ’片段表达载体ｐＹＺＦｃｄ２０,用ｐＹＺＦｃｄ２０转化大肠杆菌１６Ｃ９,在１６Ｃ９菌中分泌表达可溶性抗ＣＤ２０Ｆａｂ’片段,经分离纯化获得具有ＣＤ２０抗原特异结合活性的Ｆａｂ’片段,竞争性竞争荧光抑制实验表明,抗ＣＤ２０Ｆａｂ’片段竞争性抑亲本属源     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab'''')2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab'表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C-末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab'表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab')2表达载体.将该载体转化宿主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab')2在工程菌中的可溶性分泌表达.经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F(ab')2活性片段.竞争性免疫荧光实验的结果表明抗CD20F(ab')2片段具有比Fab'更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI47与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明F(ab')2比Fab'更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长.     

CD59活性位点相关性基因突变的构建与表达

构建了野生型和突变型CD59重组质粒,建立了高效真核表达系统,探讨了W40位点的生物学活性。采用基因点突变技术使CD59W40基因位置缺失（突变1,M1）及C39W40K41→W39W40W41（突变2,M2）,重叠延伸PCR（overlap extension PCR）定点诱变扩增突变基因,重组入真核表达质粒pIRES,利用阳离子脂质体（Lipfectamine2000）将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）进行表达。酶切鉴定及序列测定证实成功构建了pIRES-MICD59、pIRES—M2CD59和pIRES-WTCD59,突变基因约500bp。G418筛选出了CHO转染细胞的稳定细胞克隆,免疫荧光、ELISA检测筛选MICD59、M2CD59和WTCD59蛋白高表达株,连续传代30代有高表达;补体溶细胞反应显示与野生型CD59相比,突变型M1CD59失去对补体的抑制功能,而M2CD59抗补体活性略增高。证实CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭此位点可提高补体活性,有望用于肿瘤治疗。     

联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明,来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应,但上述基因抗肿瘤的机制不同,本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因,IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因,构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型,并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射,共注射3次,每次100μg质粒,拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用,但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示,上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。     

壳寡糖通过降低线粒体膜电位促进A549细胞凋亡

壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)分子量小,可溶性好,具有抗肿瘤等多种生物活性.以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,探究COS对A549细胞线粒体膜电位、细胞生长与死亡的影响.MTT结果表明COS浓度越高,刺激时间越长,其对A549细胞生长的抑制作用越明显;流式细胞仪检测结果显示,1mg/mL的COS明显地降低了细胞线粒体膜电位水平;活死细胞荧光染色实验表明,COS组死亡细胞比率提高,与对照组相比具有显著性差异.结果提示,COS可能通过降低线粒体的膜电位而促进A549细胞凋亡.     

Nano-HA涂层与HA/CTS复合涂层抑制胶质母细胞瘤细胞活力作用的比较

实验采用电化学沉积法在钛合金表面制备了纳米羟基磷灰石涂层(nHA)、纳米和微米级羟基磷灰石/壳聚糖复合涂层(nHA/CTS,mHA/CTS),并应用XRD、SEM和FTIR对涂层的理化特性进行了表征。然后将人脑胶质母细胞瘤细胞系U87(U87)与3种涂层共培养,并比较3种涂层诱导U87细胞凋亡的能力。通过MTT法细胞生长抑制实验检测以及电镜下膜层表面细胞形态观察,发现nHA膜层比nHA/CTS和mHA/CTS能更有效地抑制胶质瘤细胞的增殖,具有明显的体外抗肿瘤作用。     

As2O3纳米粒的制备和体外治疗肺癌及其抗转移机制实验

采用改良的溶胶-凝胶法制备系列的As2O3纳米粒,用透射电镜、扫描电镜、能谱仪、图像分析系统等进行表征及特性检测．应用MTT法研究As2O3纳米粒体外对细胞的增殖抑制作用;用流式细胞仪测定As2O3纳米粒及亚砷酸诱导细胞的凋亡率;用免疫组织化学半定量法检测As2O3纳米粒及亚砷酸处理细胞后Bcl-2、Bax、CD44v6和P53基因的表达改变．研究结果表明,制备的As2O3纳米粒在电镜下呈圆形或椭圆形,分散性较好,平均直径约为80nm、110nm、130nm、150nm和450nm;体外细胞实验证实As2O3纳米粒抗肺癌A-549细胞的效应强于亚砷酸溶液;免疫组织化学半定量法显示As2O3纳米粒有较强的诱导肺癌细胞凋亡的作用,可能与其改变Bcl-2和Bax基因表达（Bcl-2／Bax比值降低）及促进P53基因的表达、抑制CD44v6基因表达有关．     

生物可降解镁植入物——骨肿瘤患者的潜在支架

骨癌患者切除术后可能发生复发和转移.传统的金属支架可以对骨缺损部位提供力学支撑,但无法有效清除复发的肿瘤细胞.本文中,我们介绍了一种可以抑制骨肉瘤生长的生物可降解镁丝植入物.简而言之,镁丝释放镁离子激活锌指蛋白Snail1从胞浆到细胞核的转运,通过下游的miRNA-181d-5p/TIMP3和miRNA-181c-5p/NLK两条平行的抗肿瘤信号通路诱导骨肉瘤细胞凋亡,抑制骨肉瘤细胞增殖.同时,镁丝释放出的氢气消除了细胞内过多的活性氧,从而抑制了骨肿瘤细胞的生长.裸鼠骨肉瘤细胞皮下荷瘤实验进一步证实镁丝能有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期.此外,镁丝对正常细胞和组织无毒性,揭示了镁植入物是骨肉瘤患者潜在的抗肿瘤支架材料.     

藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究

探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白(PC)对Hela细胞CD59基因表达的调控作用.以正常人CD59cDNA基因为模板,经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX,然后利用阳离子脂质体(Lipfectamine-2000)将重组质粒和PcDNA共转染人子宫颈癌细胞(Hela)和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)进行表达.用不同浓度的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白作用于转染细胞,通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测.结果表明:成功构建了重组质粒pALTER-MAX-CD59,并将其导入真核细胞(Hela,CHO),经G418筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆.用藻蓝蛋白作用于筛选出的转基因细胞,证实藻蓝蛋白可促进Hela细胞表面CD59蛋白的表达并抑制Hela细胞的增殖,而对于正常CHO细胞无明显作用.     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

石墨烯作为活细胞生长基底的药效研究

分别以盖玻片(Glass),Glass/rGO,Glass/GO为Hela细胞和MDCK细胞生长基底,研究了抗癌药物阿霉素和缺氧试剂FCCP分别诱导Hela和MDCK细胞的凋亡作用。结果表明,相同浓度的药物在Glass基底上均可造成细胞大量死亡;而在Glass/rGO,Glass/GO基底上药物的毒性下降,药效减弱,细胞状态良好;据推测:一是石墨烯对药物的物理吸附作用;二是石墨烯改变了细胞膜的状态而造成的药效降低,具体的机制需要进一步试验来验证。     

全反式维甲酸对染反义IGF—Ⅱ基因人胃癌细胞凋亡的观察

探讨不同状况下全反式维甲酸对转染IGF—Ⅱ基因胃癌细胞生物学行为的影响。方法以人胃癌细胞系SGC7901细胞分别转染IGF—Ⅱ反义基因.以不同浓度全反式维甲酸处理,观察细胞生长曲线。以MTT法测细胞生长抑制,DAPI染色计数细胞凋亡。扫描及透视电镜观察细胞形态。结果在全反式维甲酸干预后,转染IGF—Ⅱ反义基因细胞凋亡指数上升,且与药物浓度正相关j细胞生长抑制;电镜显示细胞结构改变。结论反义基因IGF—Ⅱ转染胃癌后联合维甲酸可协同抑制胃癌细胞恶性表型,诱导细胞凋亡。