嵌合抗CD20Fab‘诱导Raji细胞凋亡

为了研究嵌合抗CD20基因工程抗体Fab‘的抗肿瘤活性及其抗肿瘤机制,利用^3H掺入法测定嵌合抗CD20Fab‘对Raji细胞生长的影响,结果显示嵌合抗CD20Fab‘对Raji细胞的生长具有抑制作用,利用流式细胞仪测定嵌合抗CD20Fab‘诱导Raji细胞凋亡作用,结果显示嵌合抗CD20Fab‘可诱导Raji细胞凋亡作用。这些实验结果证明嵌合抗CD20Fab‘通过诱导Raji细胞凋亡的机制抑制Raji细胞生长。     

新型基因工程抗CD20抗体片段F（ab′）2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab′表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重键恒定区CH1C－末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab′表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab′）2表达载体。将该载体转化缩主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab′）在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F（ab′）2活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明：抗CD20F(ab′）2片段具有比Fab′更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体H147与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明：F(ab′）2与Fab′更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长。     

嵌合抗CD20抗体分子在CHO细胞中的表达

利用PCR方法从抗CD20抗体Fab′片段的表达载体上扩增抗CD20抗体的轻链和重链可变区，将轻链和重链可变区组装到含有人抗体恒定区的表达载体中，构建抗CD20抗体IgG的轻链和重链表达载体PK100VL和PGL05VH，并用质脂体法共转染CHO细胞，RT－PCR和ELISA检测结果证实了抗CD20抗体IgG全分子在CHO细胞中的分泌表达。免疫结合结果表明CHO细胞分泌表达的抗CD20抗体IgG全分子可与CD20阳性的B淋巴瘤Raji细胞结合。     

抗CD3基因工程嵌合抗体片段Fab′的构建、表达和活性测定

PCR扩增抗CD3单抗轻链可变区(VL)和重链可变(VH)片段基因,将其重组到Fab ′表达载体中,构建成抗CD3嵌合抗体Fab′表达载体,转化大肠杆菌16C9进行可溶性表达 . 产物经蛋白G亲和层析柱纯化.免疫荧光竞争结合实验和3H掺入实验证实能与小鼠抗CD3 IgG HIT3a竞争性结合表达CD3的T淋巴细胞,并促进细胞增殖.     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab'')2的构建、表达和活性测定

从抗CD2 0 Fab’表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C 末端的DNA序列 ,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab’表达载体中 ,构建成抗CD2 0抗体片段F(ab’) 2 表达载体。将该载体转化宿主大肠杆菌 16C9,实现了抗CD2 0 抗体片段F(ab’) 2 在工程菌中的可溶性分泌表达。经分离纯化获得具有与抗原CD2 0 特异结合的F(ab’) 2 活性片段。竞争性免疫荧光实验的结果表明 :抗CD2 0 F(ab’) 2 片段具有比Fab’更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI4 7与Daudi细胞表面CD2 0 相结合的能力 ;用MTT法检测所得到的数据说明 :F(ab’) 2 比Fab’更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长     

嵌合抗CD_(20)抗体Fab’片段三维结构的同源模建

分别以抗CD2 0 Fab’轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针 ,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白作为参考蛋白 ,利用InsightII/MSI的同源蛋白质结构模建系统(homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后 ,搭建成抗CD2 0 嵌合抗体片段Fab’的空间构象 ,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示 ,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

嵌合抗CD20抗体Fab‘片段三维结构的同源模建

分别以抗CD20Fab‘轻链和Fd段的氨基酸一级序列为探针,在PDB数据库中搜寻与其同源性高的蛋白储备参考蛋白,利用Insight II/MSI的同源蛋白质结构模建系统（homology)在SGI计算机图形工作站上模建轻链和Fd段的三维空间结构后,搭建成抗CD20嵌合抗体片段Fab‘的空间构象,并对模建蛋白进行分子力学和分子动力学优化。对优化后的模建蛋白的合理性验证显示,模建蛋白的三维结构是合理而可信的。     

雌黄纳米粒对K562细胞的体外治疗作用及其机制

采用MTT法、细胞形态学观察和流式细胞术检测纳米雌黄对白血病K562细胞生长的影响;通过免疫组化、RT-PCR方法检测雌黄纳米粒处理K562细胞后凋亡相关基因的表达变化．结果表明,雌黄纳米粒能强烈抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,效果明显优于普通雌黄;雌黄纳米粒对K562细胞的bcl-2蛋白、bcl-2mRNA、survivin蛋白以及survivin mRNA表达均有抑制作用,对bax蛋白与mRNA表达均有促进作用,提示其抗肿瘤作用可能与凋亡抑制基因bcl-2、survivin表达减少、促凋亡基因bax表达增强有关,并从mRNA水平上发挥作用,     

As2O3纳米粒的制备和体外治疗肺癌及其抗转移机制实验

采用改良的溶胶-凝胶法制备系列的As2O3纳米粒,用透射电镜、扫描电镜、能谱仪、图像分析系统等进行表征及特性检测．应用MTT法研究As2O3纳米粒体外对细胞的增殖抑制作用;用流式细胞仪测定As2O3纳米粒及亚砷酸诱导细胞的凋亡率;用免疫组织化学半定量法检测As2O3纳米粒及亚砷酸处理细胞后Bcl-2、Bax、CD44v6和P53基因的表达改变．研究结果表明,制备的As2O3纳米粒在电镜下呈圆形或椭圆形,分散性较好,平均直径约为80nm、110nm、130nm、150nm和450nm;体外细胞实验证实As2O3纳米粒抗肺癌A-549细胞的效应强于亚砷酸溶液;免疫组织化学半定量法显示As2O3纳米粒有较强的诱导肺癌细胞凋亡的作用,可能与其改变Bcl-2和Bax基因表达（Bcl-2／Bax比值降低）及促进P53基因的表达、抑制CD44v6基因表达有关．     

不同浓度Mg-6Zn合金浸提液对肠上皮细胞凋亡及其相关基因Caspase-3表达的影响

研究不同浓度Mg-6Zn合金浸提液对大鼠肠上皮细胞IEC-6的凋亡及凋亡相关基因Caspase-3表达的影响。将Mg-6Zn合金制成不同浓度(20%和40%)的浸提液体外培养大鼠肠上皮细胞IEC-6,并以含10%胎牛血清的高糖DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)培养基作为阴性对照。采用噻唑蓝(MTT)法通过计算细胞相对增殖率检测不同浓度合金浸提液对IEC-6细胞的毒性作用;采用流式细胞仪检测不同浓度合金浸提液对IEC-6细胞凋亡的影响;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测不同浓度合金浸提液对IEC-6细胞凋亡相关基因Caspase-3mRNA表达的影响。实验结果表明,20%和40%两种浓度的镁合金浸提液在体外培养IEC-6细胞第七天时细胞毒性分级分别为0级和1级,属于无毒性,符合医用材料细胞毒性分级的合格标准。40%和20%浓度镁合金浸提液中,IEC-6细胞的凋亡比例及Caspase-3活化度相对于对照组都增高,差异有统计学意义(P0.05),40%浓度组中,IEC-6细胞的凋亡比例及Caspase-3活化度相对于20%浓度组增高,差异有统计学意义(P0.05),说明Mg-6Zn合金浸提液在一定范围内处于较高浓度时易诱导IEC-6细胞的凋亡及Caspase-3的表达,且随浓度升高影响越大。     

联合应用凋亡素基因、新城疫病毒HN基因及IL-18基因对黑色素瘤的抑制效应研究

以前的研究结果表明,来自于鸡贫血病毒的凋亡素基因、来自于鸡新城疫病毒的HN基因和IL-18基因具有不同的抗肿瘤效应,但上述基因抗肿瘤的机制不同,本研究在双启动子真核表达质粒pIRES中的CMV启动子下游插入凋亡素基因,IRES启动子下游插入IL-18HN嵌合基因,构建能同时表达三种基因的真核表达质粒pIRVP3IL-18HN。复制C57BL／6小鼠荷黑色素瘤模型,并将质脂体包裹的重组质粒进行瘤内注射,共注射3次,每次100μg质粒,拟观察凋亡素、新城疫病毒HN基因和IL-18基因以核酸疫苗的形式联合应用对小鼠黑色素瘤的抑制效应。结果显示pVIL-18HN、pVlL-18和pVVP3IL-18均有抑制肿瘤作用,但pIRVP3IL-18HN组抑瘤率高于pVIL-18HN组、pVIL-18VP3组、pVIL-18组和Hanks液对照组。研究结果提示,上述3种基因联合应用具有协同抑瘤效应。     

小鼠对HIV-2嵌合结构基因重组鸡痘病毒的免疫反应

将HIV-2嵌合结构基因gag-gp105插入到转移载体pUTA2复合启动子ATI-P7.5×20下游,构建出鸡痘病毒重组转移质粒pA-gg;经转染和BrdU加压筛选,以基因组PCR和Western blot法鉴定重组病毒;将获得的重组病毒大量制备并纯化后,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠血清HIV-2抗体,流式细胞仪测定CD4 、CD8 T淋巴细胞亚类数量,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾特异性CTL杀伤活性.结果表明,成功筛选出一株可稳定表达HIV-2嵌合蛋白Gag-gp105的重组鸡痘病毒rFPV-gg;该重组病毒免疫组小鼠的血清出现HIV-2抗体,脾T细胞亚类数量增加,并产生针对HIV-2靶细胞的特异性CTL杀伤活性.本研究提示,HIV-2 gag-gp105重组病毒能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答.     

作用于线粒体和细胞核的聚合物纳米材料及其在化疗/光热治疗联合抗癌中的应用

开发本身即具有线粒体靶向能力的亚细胞精准纳米诊疗试剂对于改善癌症治疗效果具有重要意义.本文使用可靶向癌细胞表面过度表达的CD44抗原的透明质酸、胆固醇-聚乙二醇-氨基和可作用于线粒体的花菁类染料IR825-NH2,构建了一种可实现光热治疗的自组装纳米材料(HA-IR825-Chol).相较于游离的IR825-NH2,该结构具有更好的光稳定性、更高的光热转换效率和对癌细胞的识别能力.HA-IR825-Chol可以有效靶向细胞线粒体,并可以在近红外激光照射下诱导线粒体损伤.此外,我们通过疏水作用包裹了化疗试剂10-羟基喜树碱(HCPT)(所形成的药物命名为HAIR825-Chol/HCPT).相关实验结果显示,包裹于纳米材料后HCPT被细胞摄取的效率显著提高,并能够同时分布于线粒体和细胞核中,从而诱导线粒体中细胞色素c的释放和细胞中cleaved caspase-3的上调,最终促进细胞凋亡与死亡.另外,HA-IR825-Chol/HCPT优异的体内肿瘤靶向能力为光化疗联合治疗消除肿瘤提供了必要保证.该工作实现了定位于线粒体的精准亚细胞药物递送,并发展了利用胆固醇提高药物摄取速率和效率的策略,预期将为提高纳米药物抗癌效果提供借鉴.     

新型基因工程抗CD20抗体片段F(ab'''')2的构建、表达和活性测定

从抗CD20Fab'表达载体上利用PCR方法扩增并修饰其重链恒定区CH1C-末端的DNA序列,然后将修饰后的CH1DNA序列重组到原Fab'表达载体中,构建成抗CD20抗体片段F(ab')2表达载体.将该载体转化宿主大肠杆菌16C9,实现了抗CD20抗体片段F(ab')2在工程菌中的可溶性分泌表达.经分离纯化获得具有与抗原CD20特异结合的F(ab')2活性片段.竞争性免疫荧光实验的结果表明抗CD20F(ab')2片段具有比Fab'更强的竞争性抑制亲本鼠源性单克隆抗体HI47与Daudi细胞表面CD20相结合的能力;用MTT法检测所得到的数据说明F(ab')2比Fab'更为有效地抑制在体外培养的Daudi细胞的生长.     

Nano-HA涂层与HA/CTS复合涂层抑制胶质母细胞瘤细胞活力作用的比较

实验采用电化学沉积法在钛合金表面制备了纳米羟基磷灰石涂层(nHA)、纳米和微米级羟基磷灰石/壳聚糖复合涂层(nHA/CTS,mHA/CTS),并应用XRD、SEM和FTIR对涂层的理化特性进行了表征。然后将人脑胶质母细胞瘤细胞系U87(U87)与3种涂层共培养,并比较3种涂层诱导U87细胞凋亡的能力。通过MTT法细胞生长抑制实验检测以及电镜下膜层表面细胞形态观察,发现nHA膜层比nHA/CTS和mHA/CTS能更有效地抑制胶质瘤细胞的增殖,具有明显的体外抗肿瘤作用。     

壳寡糖通过降低线粒体膜电位促进A549细胞凋亡

壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)分子量小,可溶性好,具有抗肿瘤等多种生物活性.以人肺腺癌A549细胞系为研究对象,探究COS对A549细胞线粒体膜电位、细胞生长与死亡的影响.MTT结果表明COS浓度越高,刺激时间越长,其对A549细胞生长的抑制作用越明显;流式细胞仪检测结果显示,1mg/mL的COS明显地降低了细胞线粒体膜电位水平;活死细胞荧光染色实验表明,COS组死亡细胞比率提高,与对照组相比具有显著性差异.结果提示,COS可能通过降低线粒体的膜电位而促进A549细胞凋亡.     

生物可降解镁植入物——骨肿瘤患者的潜在支架

骨癌患者切除术后可能发生复发和转移.传统的金属支架可以对骨缺损部位提供力学支撑,但无法有效清除复发的肿瘤细胞.本文中,我们介绍了一种可以抑制骨肉瘤生长的生物可降解镁丝植入物.简而言之,镁丝释放镁离子激活锌指蛋白Snail1从胞浆到细胞核的转运,通过下游的miRNA-181d-5p/TIMP3和miRNA-181c-5p/NLK两条平行的抗肿瘤信号通路诱导骨肉瘤细胞凋亡,抑制骨肉瘤细胞增殖.同时,镁丝释放出的氢气消除了细胞内过多的活性氧,从而抑制了骨肿瘤细胞的生长.裸鼠骨肉瘤细胞皮下荷瘤实验进一步证实镁丝能有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期.此外,镁丝对正常细胞和组织无毒性,揭示了镁植入物是骨肉瘤患者潜在的抗肿瘤支架材料.     

抗CD3/抗B细胞肿瘤的双功能小抗体的抗肿瘤活性研究

为评价已研制的抗CD3/抗B细胞肿瘤 (CD2 0 + )双功能小抗体的生物学活性 ,采用多种实验方法在体内外对其进行研究。结果表明 :该型双功能小抗体能同时与Ju rkat和Daudi细胞结合 ,并交联两种细胞形成玫瑰花环。它与Jurkat(CD3+ )和Daudi细胞 (CD2 0 + )的结合的亲和常数Ka分别为 3.2× 10 8M- 1和 8.9× 10 8M- 1。在体外该抗体能激活并介导T细胞杀伤Daudi细胞。裸鼠体内分布实验结果表明 :该型抗体可在移植瘤部位富集 ;在人B淋巴瘤裸鼠移植瘤腹腔模型中 ,联合人的PBMC和IL 2 ,该抗体可以杀灭人B淋巴瘤细胞 ,明显延长荷瘤裸鼠的生存时间。     

山波苓搞癌作用分析

目的:探讨山波苓体外抗肿瘤作用的活性部位。方法:MTT染色法对山波苓五种溶剂提取物体外抗肿瘤活性进行初步的研究。结果:氯仿提取物对乳腺癌细胞(Bre-04)、神经癌细胞(N-04)、肺癌细胞(Lu-04)有较好的抑制生长作用,IC50分别为0.2699mg/ml、0.2634mg/ml、0.4961mg/ml,对肝癌细胞HepG2抑制作用差,IC50为0.9379mg/ml;山波苓石油醚提取部位对乳腺癌细胞(Bre-04)、神经癌细胞(N-04)、肺癌细胞(Lu-04)、肝癌细胞HepG2的IC50分别为0.5902mg/ml、0.5725mg/ml、0.7938mg/ml、0.6374mg/ml;乙酸乙酯提取物对肺癌细胞(Lu-04)有一定的抑制作用,IC50为0.7343mg/ml;水溶性提取物以及正丁醇提取物无明显抑制肿瘤作用。结论:山波苓氯仿提取部位、石油醚提取部位体外抗肿瘤作用较好,值得对其提取部位进一步分离纯化并研究其抗肿瘤作用机制。     

石墨烯作为活细胞生长基底的药效研究

分别以盖玻片(Glass),Glass/rGO,Glass/GO为Hela细胞和MDCK细胞生长基底,研究了抗癌药物阿霉素和缺氧试剂FCCP分别诱导Hela和MDCK细胞的凋亡作用。结果表明,相同浓度的药物在Glass基底上均可造成细胞大量死亡;而在Glass/rGO,Glass/GO基底上药物的毒性下降,药效减弱,细胞状态良好;据推测:一是石墨烯对药物的物理吸附作用;二是石墨烯改变了细胞膜的状态而造成的药效降低,具体的机制需要进一步试验来验证。