重组赖脯胰岛素中四环素残留量微生物学检测方法的建立

目的建立重组赖脯胰岛素中四环素残留量微生物学定量检测方法。方法采用管碟法对重组赖脯胰岛素中四环素含量进行测定,以四环素浓度对数为纵坐标,抑菌圈半径平方值为横坐标绘制标准直线。同时验证方法的同质性、最低检出限及准确性。采用建立的方法检测3批重组赖脯胰岛素原料中四环素的残留量。结果重组赖脯胰岛素为4 mg/mL时,其作为基质不影响方法的准确性;浓度为10 mg/m L时,存在基质效应,影响检测的准确性。该方法的最低检出限为0. 12μg/mL,最低定量限为0. 24μg/mL。基质浓度为4 mg/mL时,0. 60、0. 84和0. 96μg/mL四环素标准品溶液的四环素回收率分别为95. 59%、98. 78%和96. 17%;基质浓度为10 mg/mL时,回收率分别为82. 55%、89. 38%和82. 30%。3批重组赖脯胰岛素原料中均未检出四环素的残留。结论成功建立了一种适用于定量检测重组赖脯胰岛素中四环素残留量的微生物学检测方法,且具有良好的准确性。     

高效液相色谱法检测破伤风抗毒素注射液中苯酚残留量

目的采用高效液相色谱法检测破伤风抗毒素注射液中苯酚残留量,并对方法进行验证及初步应用。方法色谱柱:C18色谱柱;流动相:甲醇-超纯水(体积比1∶1);流速:0.5 ml/min;检测波长:270 nm;柱温:35℃;进样量:5μl。对方法进行专属性、线性、检测限、准确性、精密性验证。用验证后的方法检测4批破伤风抗毒素注射液的苯酚残留量。结果供试品溶液中加入60μg/ml的苯酚对照品溶液和间甲酚对照品溶液的平均回收率为99.92%,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.139 3%;在1~60μg/ml范围内,苯酚对照品色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系,回归方程:Y=9.869 19 X+1.082 34 e-1,r=0.999 96;按照信噪比(S/N)≥3确定最低检测限为0.05μg/ml;供试品溶液中加入不同浓度苯酚对照品溶液的平均回收率分别为101.75%和97.03%,RSD分别为0.025%和0.796%;供试品溶液5次检测结果的RSD为1.485 9%。4批破伤风抗毒素注射液中的苯酚残留量均符合《中国药典》三部(2010版)≤890μg/ml的要求。结论高效液相色谱法检测破伤风抗毒素注射液中苯酚残留量快速、简便,且专属性、线性、准确性、精密性良好。     

多糖结合疫苗中残余CDAP检测方法的建立及验证

目的建立测定多糖结合疫苗中残余1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC),为多糖结合疫苗的质量监控提供依据。方法 HPLC色谱条件:色谱柱:TSK gel ODS-100V(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水-三氟乙酸(60∶40∶0.1);检测波长:300 nm;流速:1 ml/min;进样体积:15μl;理论塔板数按CDAP峰面积计算不低于2 000。以峰面积对浓度进行线性回归,确定该方法的线性范围,并对该方法进行专属性、检测限、定量限、精密度、稳定性及准确度验证。结果该方法检测CDAP专属性良好,最低检测限和定量限分别为35 ng/ml和40 ng/ml;CDAP浓度在160~4 000 ng/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R~2=0.999 9;供试品和CDAP标准品连续6次进样,RSD分别为0.26%、0.57%;供试品在8 h内稳定,平均加样回收率为94.5%,RSD为2.5%。结论建立了测定多糖结合疫苗中残余CDAP含量的HPLC测定方法,该方法准确、简便、可靠,能有效控制多糖结合疫苗的质量。     

重组赖脯胰岛素中四环素残留量微生物学定量检测方法

目的 建立重组赖脯胰岛素中四环素残留量微生物学定量检测方法。方法 以管蝶法为依据，在开展测定工作时，使用标准直线完成相关的任务，在36℃的环境中培养20～22 h，在开展测量工作时，使用的主要设备为CAM-ⅢB智能型抑菌圈测量仪，横坐标为四环素浓度的对数，纵坐标为抑菌圈半径的平方，实现对标准直线的有效绘制。结果 在使用相关的方法时，四环素的最低检出限和最低定量限分别为0.12μg/mL和0.24μg/mL。在基质浓度达到4 mg/mL以后，对0.96μg/mL、0.84μg/mL和0.60μg/mL四环素标准品溶液而言，四环素回收率能达到96.17%、98.78%和95.59%；在基质浓度达到10 mg/mL以后，对0.96μg/mL、0.84μg/mL和0.60μg/mL四环素标准品溶液而言，四环素的回收率则达到了82.30%、89.38%和82.55%。3批重组赖脯胰岛素原料中均未检出四环素的残留。结论 当重组赖脯胰岛素溶液的浓度标准达到4 mg/mL左右时，在使用该方法以后，能够准确地获取四环素含量的定量信息。     

屋尘螨变应原制品中铝含量微波消解-电感耦合等离子体原子发射光谱检测方法的建立

目的建立微波消解-电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)法检测屋尘螨变应原制品中铝含量,并进行验证。方法采用微波消解法对样品进行消解处理后,用ICPAES法测定样品中的铝含量,并对建立的方法进行线性范围、精密度、准确性验证,确定最低检出限和最低定量限;用建立的方法检测2批次屋尘螨变应原制剂中的铝含量。结果该方法铝元素浓度在0~0.30μg/ml范围内与分析线的响应值具有良好的线性关系(r=0.999 552);0.10μg/ml标准品溶液连续进样11次,铝含量平均值为0.100 2μg/ml,相对标准偏差(RSD)为1.2%;6份样品溶液的铝含量平均值为10.90μg/ml,RSD为1.4%;3份样品溶液的平均加标回收率为95.5%,RSD为4.9%;该方法最低检出限为0.008 5μg/ml,最低定量限为0.028μg/ml。2批次共5份屋尘螨变应原制剂样品中铝含量测定结果均符合该企业注册标准中铝含量标准要求。结论微波消解法对样品消解完全,采用微波消解-ICP-AES法可以对屋尘螨变应原制品中的铝含量进行准确定量,该方法操作简便,灵敏度、精密度、准确度良好。     

康柏西普制品中CHO细胞DNA残留量的检测

目的建立特异的CHO细胞DNA残留量荧光定量PCR(Q-PCR)检测方法。方法采用DNeasy Tissue Kit提取CHO细胞基因组DNA,制备DNA标准品;确定Q-PCR反应体系及反应条件,绘制标准曲线,建立CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,并验证其专属性、准确性及精密性;用建立的方法对1003b02、1008b05、1012b09、1104b04、1108b13、1112b24批康柏西普原液的CHO细胞DNA残留量进行检测。结果建立的标准曲线Ct值与模板DNA浓度的对数值之间呈良好的线性关系,相关系数为0.99以上;检测HUVEC、HEK293细胞的DNA残留量均无特异性扩增曲线;检测高、中、低浓度的DNA标准品(105、103、101pg/ml)的平均回收率均在Q-PCR方法可接受的回收率范围(50%²00%)内,批间变异系数分别为9.3%、21.8%、26.8%;检测100pg/ml浓度的DNA标准品的平均回收率为111.6%,变异系数为20.4%;康柏西普原液的DNA残留量远低于100 pg/剂量。结论已成功建立特异的CHO细胞DNA残留量Q-PCR检测方法,该方法专属性好,准确性及精密性高,可作为CHO宿主细胞DNA残留量的常规检测方法。     

HPLC法测定肺炎球菌多糖疫苗中的苯酚含量

目的建立测定肺炎球菌多糖疫苗中苯酚含量的HPLC法。方法采用Novo-Pak C-18色谱柱(3.9 mm×150 mm,4μm),以甲醇-水(20∶80)为流动相进行洗脱,流速为1.0 ml/min,检测波长为271 nm,柱温为25℃,进样量为10μl。对该方法的适用性、专属性、精密度、重现性、稳定性、准确性进行验证,并确定该方法的线性范围及定量限。用建立的方法检测6批23价肺炎球菌多糖疫苗中苯酚含量,并与溴量滴定法进行比较。结果苯酚浓度在0.031 25~0.500 2 mg/ml范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r=1.000),定量限为0.31μg/ml;供试品溶液的色谱峰与苯酚对照品溶液的主峰保留时间均约在4.5 min;苯酚对照品溶液连续进样6次,峰面积相对标准偏差(RSD)为0.09%,保留时间的RSD为0.02%;6份同1批供试品溶液中苯酚含量的均值为2.42 mg/ml,RSD为0.48%;同1份供试品溶液室温下放置,0~24 h测定12次,保留时间均值为4.485,RSD为0.53%,峰面积平均值为1 037 336,RSD为0.29%;9份加标供试品溶液的平均回收率为99.63%,RSD为1.18%。6批23价肺炎球菌多糖疫苗中苯酚含量的两种方法检测结果基本一致。结论建立的HPLC法操作简便,专属性、精密度、准确度、重现性、稳定性好,可对23价肺炎球菌多糖疫苗中的苯酚进行准确定量。     

液相色谱-串联质谱法测定粮谷中敌百虫、辛硫磷残留量

建立了应用液相色谱-串联质谱法测定粮谷中敌百虫、辛硫磷残留量的检测方法.试样用环己烷-乙酸乙酯(体积比1:1)提取,经凝胶色谱净化,用甲醇-水(体积比1:1)定容,供液相色谱-质谱/质谱仪测定和确证,外标法定量;在辛硫磷的测定与确证过程中,应注意避光.液相流动相为甲醇-水.串联质谱仪采用电喷雾离子源,在添加了0.002～0.100 mg/kg的敌百虫、辛硫磷标准品时的回收率为78.4%～96.7%;相对标准偏差(RSD)在5.4%～12.0%之间;最低检出限为0.002 mg/kg.     

A群脑膜炎球菌多糖原液中苯酚残留量气相色谱检测方法的建立及验证

目的建立A群脑膜炎球菌多糖原液中苯酚残留量气相色谱检测方法,并进行验证。方法采用标准溶液加入法,以乙酸丁酯为萃取剂制备对照品及供试品溶液,采用气相色谱法进行检测,色谱条件为:Agilent DB-WAX[聚乙二醇(PEG)强极性柱30 m×0.25 mm×0.25μm]色谱柱,柱温165℃,进样口温度250℃,检测器温度300℃,流速2 m L/min,载气为氮气,进样分流比5∶1,进样量1μL。对方法的专属性及系统适用性、检测限和定量限、线性范围、精密度、准确度进行验证。采用建立的方法检测9批A群脑膜炎球菌多糖原液苯酚残留量。结果苯酚的保留时间分别为5.046 min,拖尾因子为1.04,与乙酸乙酯的分离度为33.21,理论塔板数大于5 000;检测限为0.535×10-3mg/m L,定量限为1.070×10-3 mg/m L;浓度在4~20μg/m L范围内,与峰面积呈良好的线性关系,相关系数(r)为0.999 9;同一操作人员连续重复检测6次结果的相对标准偏差(RSD)为0.4%,2名试验员不同时间重复检测6次结果的RSD为1.5%;9份加标供试品溶液的回收率为95.8%~100.0%;9批A群脑膜炎球菌多糖原液中苯酚残留量均符合规定。结论建立的A群脑膜炎球菌多糖原液中苯酚残留量气相色谱检测方法,具有良好的重复性及准确性,可用于A群脑膜炎球菌多糖原液中的苯酚残留量检测。     

药用胶塞中二丁基二硫代氨基甲酸锌的 高效液相色谱分析方法研究

建立高效液相色谱(HPLC)法测定药用胶塞中二丁基二硫代氨基甲酸锌的残留量的方法。药用胶塞浸于液氮脆化后粉碎,经四氢呋喃-乙腈(体积比为10∶90)超声提取制得供试品溶液。以四氢呋喃-乙腈(体积比为35∶65)为流动相,供试品溶液经SunFire C₁₈色谱柱(4. 6 mm×250 mm,5 μm)分离后,用254 nm检测波长进行HPLC测试。试验结果显示：二丁基二硫代氨基甲酸锌的质量浓度在20～750 μg·mL^-1范围内与HPLC峰面积的线性相关性良好,相关因数为0. 999 9;高、中、低质量浓度的供试品溶液的HPLC峰面积的相对标准偏差小于3%,测试精密度高;本方法检出限和定量限分别为20和30 ng,加标回收率为98. 84～102. 58%,供试品溶液在6 h内稳定。本方法简便、准确、灵敏、稳定,适用于测定药用胶塞中二丁基二硫代氨基甲酸锌的残留量。     

比浊法检测疫苗中TritonX-100残留量的方法学验证

目的建立检测疫苗中Triton X-100残留量的比浊法,并进行方法学验证。方法将TritonX-100与5%苯酚溶液充分混匀后,室温静置15 min,采用比浊法测定340 nm处吸光度值,与经同样处理的标准品绘制的标准曲线比较,计算样品中残留TritonX-100的浓度。由4名试验人员连续3 d测定12次,评价不同试验人员建立标准曲线的成功率;由同一试验人员在同一试验内和不同时间内及由4名试验人员在不同时间内分别测定低(15μg/ml)、中(25μg/ml)、高(45μg/ml)3个不同浓度的TritonX-100的浓度,验证该方法的精密度和准确度;并检测BSA对试验准确度和精密度的影响。结果 4名试验人员连续3 d的12次检测结果均满足标准曲线的成立条件,成功率为100%;同一试验人员在同一试验内对低、中、高3个不同浓度的TritonX-100溶液重复测定10次,变异系数分别为分别为5.33%、1.19%和1.39%,回收率分别为99.33%、105.60%和110.67%;同一试验人员在不同时间内连续测定3次,变异系数分别为4.94%、7.49%和3.46%,回收率分别为87.75%、93.85%和95.51%,4名试验人员在不同时间内连续测定3次,变异系数在1.73%~12.17%之间,回收率在89.55%~99.26%之间,灵敏度为10μg/ml,具有良好的精密度和准确度;BSA对试验准确度和精密度无显著影响。结论该方法快捷、简便,可灵敏、准确地定量检测TritonX-100的含量,可用于疫苗样品中残留TritonX-100的质量控制。     

巨细胞病毒IgG定量ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)IgG定量ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用CMV IgG(50 U/ml)标准品建立CMV IgG ELISA定量检测方法,确定该方法的最佳线性范围;制备室内质控血清并进行标定。对该方法进行重复性、中间精密性、准确性、特异性验证,并与Dia.Pro CMV IgG ELISA试剂盒进行比较。用建立的ELISA法检测689人份健康献浆员血浆的CMV IgG抗体效价。结果建立的CMV IgG定量ELISA检测方法的最佳线性范围为0.000 78～0.05 U/ml;制备的室内质控血清的抗体效价为(5.67±0.55)U/ml;重复性试验检测结果的变异系数为4.6%～9.8%,中间精密性试验检测结果的变异系数为9.7%～10.6%;该方法检测3个浓度标准品的回收率为107.01%～112.97%;样品稀释液和血清中的其他一些干扰因素对检测结果影响较小;该方法与Dia.Pro CMV IgG ELISA试剂盒检测血浆样品的相关系数r=0.81。该方法检测689人份健康献浆员血浆样品的CMV IgG抗体效价≥10 U/ml的占30.8%。结论建立的CMV IgG定量ELISA检测方法操作简便,精密性良好,特异性强,可用于人血浆中CMV IgG的定量检测。     

气相色谱法测定甲型肝炎灭活疫苗中三氯甲烷残留量

目的应用顶空气相色谱法测定甲型肝炎灭活疫苗中三氯甲烷残留量。方法采用毛细管色谱柱DB-WAX(30m×0.53mm×0.50μm),ECD检测器,以氮气为载气,顶空进样。以不同基质稀释的三氯甲烷工作液绘制标准曲线,并对方法进行适用性及专属性、线性关系、精密度、定量限、检出限和准确性验证。结果通过绘制的2条标准曲线可见,存在基质效应的影响。甲肝疫苗中三氯甲烷与其他杂质峰的分离度为2.58;三氯甲烷在20～100ng/ml的浓度范围内线性关系良好(R2=0.9993);精密性良好,检测结果的RSD均小于5%;最低检出限为1.2ng/ml,最低定量限为4.8ng/ml;检测高、中、低3种浓度样品的加标回收率分别为(95.6±1.8)%、(95.5±3.1)%和(101.9±2.1)%。结论顶空气相色谱法简便灵敏,结果准确可靠,适用于甲型肝炎灭活疫苗中三氯甲烷残留量的测定。     

甲型肝炎灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠残留量HPLC检测方法的建立及验证

目的建立检测甲型肝炎(hepatitis A,HA)灭活疫苗(MRC-5细胞)中乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)残留量的HPLC法,并进行验证。方法色谱条件:选用反相色谱柱;流动相为水相-有机相,水相为四丁基氢氧化铵的磷酸盐溶液,有机相为乙腈;流速为1.0 mL/min;检测波长为257 nm;进样量为20μL;柱温为30℃;保留时间为10 min。筛选色谱柱并优化流动相条件(水相与有机相的比例、pH及磷酸盐)。验证方法的适用性、专属性、线性范围、准确度、精密度、耐用性、定量限和检测限。采用该方法检测3批HA灭活疫苗原液供试品中EDTA-2Na残留量。结果最适色谱条件:采用美国Thermo公司的C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),水相与有机相比例为9∶1,pH为2.4,磷酸盐为0.01 mol/L磷酸二氢铵。EDTA-2Na对照品色谱峰的理论塔板数大于10 000,分离度大于1.5;仅对照品有色谱峰,且无其他色谱峰干扰;对照品在0.2~20μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为Y=20 482.18 X+0.512 6,R²=0.999 9;准确性验证中,浓度为2、5、10μg/mL的加标样品平均回收率分别为97.44%、100.6%及100.4%,RSD为1.6%;5μg/mL的加标样品重复性及中间精密度的RSD分别为1.4%和1.6%;定量限及检测限分别为0.2和0.05μg/mL;不同pH(2.0、2.4、3.0)流动相的色谱峰面积的RSD分别为0.24%、0.31%及0.18%,相对误差(RE)分别为99.25%、99.12%及99.33%。3批供试品均未检出EDTA-2Na。结论成功建立了检测HA灭活疫苗中EDTA-2Na残留量的HPLC法,该方法具有良好的专属性、线性范围、准确度、精密度及耐用性,为HA灭活疫苗的质量控制研究奠定了基础。     

重组蛋白中G418残留量超高效液相色谱-蒸发光散射检测方法的建立

目的建立定量检测重组蛋白中G418残留量的超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)-蒸发光散射检测(evaporative light scattering detection,ELSD)法,并进行验证。方法G418经UPLC洗脱后,通过蒸发光散射检测器检测,首先将柱洗脱液雾化形成气溶胶,然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发,余下不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中进行检测,通过标准曲线计算质控品中G418浓度。对建立的方法进行专属性、重复性、中间精密度、定量限、耐用性、线性验证。结果G418浓度在0.01~0.20 mg/mL范围内,标准曲线的线性较好,R2>0.99,定量限为0.01 mg/mL;质控品的加样回收率在80%~120%之间;中间精密度试验回收率的RSD为3.44%;定量限试验回收率的RSD为5.38%;耐用性试验回收率的RSD为4.56%。结论UPLC-ELSD法精密度良好,可用于重组蛋白研发及生产过程中G418残留的监测。     

b型流感嗜血杆菌多糖ELISA检测方法的建立

目的建立b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)多糖(Polyribosylribitolphosphate,PRP)的ELISA检测方法。方法用灭活的Hib菌免疫家兔,1周免疫4次,共免疫6周,采血,检测血清抗体滴度。对兔免疫血清进行非特异性抗体免疫吸附,纯化兔抗PRP抗体,用纯化的兔抗PRP抗体包被酶标板,HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法检测PRP。确定标准曲线的最佳线性范围,并对方法进行特异性、准确性和精密性验证。结果兔免疫血清的抗体效价可达1∶2 800。该方法的线性检测范围为0.030～0.500 ng/ml,检测限为0.030 ng/ml。该方法检测大肠杆菌上清蛋白、牛血清白蛋白、LB培养基及破伤风-乙脑结合疫苗均无特异性反应;检测0.500、0.250、0.150 ng/ml的PRP标准品试验内变异系数(CV)在1.16%～2.40%之间,回收率在93.2%～107.2%之间;试验间CV在1.57%～4.11%之间,回收率在101.3%～101.6%之间。结论该方法特异性、准确性和精密性均较好,可以特异性检测b型流感嗜血杆菌多糖。     

Determination of Residual Monomers in Synthesized Acrylic PSAs by Gas Chromatography

The harmful residual monomers present in acrylic pressure sensitive adhesives (PSAs), used in transdermal drug delivery system (TDDS), should be quantified through a simple, rapid and accurate method. This paper introduces an optimized method for the determination of the residual monomers in acrylic polymers based on a gas chromatographic (GC) technique. Acetone was shown to be the optimum extraction solvent and the extraction time was 80 min. The recovery, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of the method were also studied. The method was relatively accurate and precise with recoveries ranging from 93.2 to 102.7% for each monomer with a relative standard deviation of (%RSD) < 7%. The method proposed in this paper for the determination of residual monomers in solvent-based acrylic PSAs is simple, accuracy and easy to carry out.     

粉唑醇在小麦和土壤中残留量的气相色谱测定方法研究

建立了粉唑醇在小麦和土壤中残留量的气相色谱定量检测方法。样品经乙腈提取,过SPEFlorisil小柱净化,采用HP–5,30m×0.32mm×0.25μm毛细管色谱柱、氮磷检测器、外标法定量气相色谱测定。方法的线性范围在0.05～10mg/L,方程y=8362.6x+151.1,相关系数0.9999;最小检出量为0.05ng,最低检出浓度0.01mg/kg,平均回收率为89.97%～97.47%,相对标准偏差(RSD)为1.31%～6.67%。     

检测重组人血小板生成素含量的改良双抗体夹心ELISA方法的建立

目的建立检测重组人血小板生成素(rhTPO)含量的改良双抗体夹心ELISA方法。方法用棋盘滴定法确定包被单抗、一抗和酶标二抗的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Lowry法检测结果进行比较。结果包被单抗的最佳包被浓度为1.0μg/ml,一抗和酶标二抗的最佳使用浓度分别为1∶5000和1∶10000;检测的线性范围为(125～4000)pg/ml,检测限为75pg/ml,定量限为189pg/ml;不同浓度rhTPO的回收率在(97.0±2.1)%～(105.0±8.5)%之间;6批样品的试验内变异系数在3.2%～8.1%之间,试验间变异系数在5.7%～10.4%之间,特异性良好;与Lowry法检测结果具有良好的相关性。结论已建立检测rhTPO含量的改良双抗体夹心ELISA法,准确性、精密性、特异性良好,可用于rhTPO研究及生产过程中的定量分析。