尿激酶原糖基化对其表达稳定性的研究

目的：探讨尿激酶原糖基化对其表达稳定性的影响。方法：构建非糖基化尿激酶原，收取无血清培养上清为检测标本。用嗜热杆菌金属蛋白酶（thermolysin）激活尿激酶原。用抑肽酶（aprotinin）终止激活反应。生色底物S-2444用于显色反应。在405nm波长处测定分光光度值（OD值）以确定双链成分的比例。在不用thermolysin激活的条件下，用公式计算单链尿激酶原比例。将重组尿激酶原和天然尿激酶原的培养上清置于4℃和37℃。每隔12h测定总活性和单链成分比例。经过阳离子层析和凝胶层析纯化后，测定蛋白产品浓度、活性。SDS—PAGE电泳鉴定蛋白质分子质量和蛋白含量。结果：在37℃下天然尿激酶原（Asn302位带有糖基化侧链）的活性远高于重组尿激酶原（非糖基化）。无论4℃或37℃。糖基化尿激酶原的单链比例均高于非糖基化尿激酶原。纯化后的天然尿激酶原蛋白产品浓度和活性均高于重组尿激酶原。SDS-PAGE提示天然尿激酶原浓度高于重组尿激酶原，分子质量低于重组尿激酶原。结论：较高的温度加速尿激酶原降解。Asn302位的糖基化位点有益于尿激酶原在培养上清中的稳定性。     

快速聚合酶链式组装法（PCA）理性化全新合成内皮细胞蛋白-C受体基因和凝血酶受体基因

通过快速PCA和常规PCA方法合成完整的内皮细胞蛋白C受体基因（EPCR-1，612bp）、突变的EPCR-2（缺少4N链接的糖基化位点，576bp）和凝血酶受体基因（TM，1548bp），对合成的全长基因进行快速PCR和常规PCR扩增，测序分析，结果发现通过快速PCA联合快速PCR扩增法得到的DNA序列的出错几率较常规方法的低。利用快速PCA法合成的基因不仅能够直接表达，     

G156A MGMT体外定点诱导突变及逆转录病毒载体的构建

目的：获得含突变位点G156A（第156位点的甘氨酸突变为丙氨酸）的六氧甲基鸟嘌呤－DNA－甲基转移酶（O^6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)，并构建含G156A MGMT（△MGMT)的逆转录病毒载体。方法：通过体外定点诱导突变技术产生G156A突变的MGMT，将其克隆入pGEM-T载体，进一步亚克隆至G1Na逆转录病毒载体。结果：通过DNA测序分析证实预期位点GGC（甘氨酸）突变为GCC（丙氨酸），经PCR及酶切分析证实成功构建了逆转录病毒载体G1Na-△MGMT。结论：通过体外定点诱导突变技术成功获得了G156A MGMT，并运用基因重组技术构建了逆转录病毒表达载体G1Na-△MGMT，为进一步将G156A MGMT转导造血干细胞对化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

突变选择窗内筛选的大肠埃希菌耐药突变体靶位变异位点的研究

目的研究不同药物浓度、不同化学结构的氟喹诺酮类药物对突变选择窗（MSW）内筛选的大肠埃希菌耐药突变体的靶位基因的影响。方法应用5种氟喹诺酮类药物在突变选择窗内接种约1×10^10菌量的ATCC25922筛选耐药突变体；用琼脂平板二倍稀释法测定ATCC25922和耐药突变体的MIC；用PCR及DNA测序方法确定ATCC25922和耐药突变体耐药决定簇（QRDRs）的gyrA、parC的突变位点和相应的氨基酸变化。结果在ATCC25922的MSW中，筛选53株耐药突变体，所有突变体均为gyrA位点突变，无parC位点突变。其中有79％（42株）为Set-83→Leu位点突变，19％（10株）为Asp-87→Asn，2％（1株）为Gly81→cys位点突变；83位和87位为大肠埃希菌的常见突变位点。氟喹诺酮对Set-83→h突变体的MIC。较Gly81→Cys突变体的MIC90高2～8倍，较Asp-87→Asn突变体的MIC90高1～2倍；Ser-83→Leu是所有的突变位点中对耐药影响最重要的位点。结论氟喹诺酮对大肠埃希菌的主要靶位是GyrA；83位和87位突变为大肠埃希菌最常见突变位点。     

人破骨细胞分化因子基因启动子报告载体的构建

目的：构建能够报告人破骨细胞分化因子（ODF）基因启动子活性的表达载体。方法：以人基因组DNA为模板，PCR扩增含有ODF基因启动子的2段序列（-2433-1243 bp和-1262-＋100bp）。通过T-A克隆将这2个序列片段分别连接到pGEM-TEasy克隆载体上。利用特定的限制性内切酶位点。将这2个序列片段酶切后进行正确拼接并定向克隆到不含启动子的pEGFP-1报告基因载体上。将该重组质粒pEGFP-1-ODF瞬时转染成骨细胞系UMR106．检测其能否在ODF基因启动子（-2358-＋100bp）的调控下表达报告基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。结果：pEGFP-1-ODF经酶切鉴定和序列分析证实与设计完全一致。细胞瞬时转染结果表明，pEGFP-1-ODF转染的UMR106能表达EGFP。结论：人ODF基因启动子报告载体的成功构建。为进一步研究ODF基因表达转录水平的调控机制奠定了基础。     

用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体及其功能的研究

目的 用PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL—39基因突变体，并比较研究FALL—39及其突变肽的功能。方法 采用PCR体外定点突变技术(PCR—SDM)，设计一对方向相反的引物，其中一个引物引入一个突变点，应用高保真的Polybest DNA多聚酶进行含FALL—39肽的PGEXAlT质粒的PCR扩增，使FALL—39第24位密码于由CAG变为AAG，将扩增片段自身连接后克隆人工程菌JMl09中表达其突变肽(FALL—39—lys24)，纯化后与FALL—39进行抗菌活性比较。结果 DNA测序结果表明在预期位点发生突变，突变后FALL—39——lys24抗菌活性增强，在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。结论 用高保真的Polybest DNA多聚酶进行PCR定点突变技术简单、有效，获得一个FALL—39—lys24突变子；其表达分子的抗菌活性明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，这些结果提示在FALL—39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性，但必须注意避免溶血的副作用。     

用PCR定点突变方法研究人抗菌肽FALL-39功能与结构的关系

目的：构建人抗菌肽FALL-39的原核表达系统，解决抗菌肽获取困难的难题；用：PCR定点突变法构建人抗菌肽FALL-39基因突变体，并比较研究FALL-39及其突变肽的功能：方法：应用RT-PCR从人肺腺上皮细胞株SPC-A-1总RNA中扩增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT为载体，构建抗菌肽FALL-39基因大肠杆菌表达载体；采用一步法和两步法PCR体外定点突变技术，用赖氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天门冬氨酸，构建FALL-39突变体大肠杆菌表达载体；该载体表达的融合蛋白经亲合层析、凝血酶酶切、胶回收和高效液相色谱分离纯化，获得高度纯化的重组FALL-39以及突变肽；对纯化产物进行的：MEC、MIC、MBC和溶血性实验等比较抗菌作用以及对红细胞膜的溶解性，用RT-PCR测定人单核巨噬细胞株THP-1：iNOS的表达，研究FALL-39及其突变肽的抗内毒作用。结果：重组质粒pGEX-1λT-FALL-39测序结果说明其插入片段序列与GenBank登录的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正确；DNA测序结果表明在预期位点发生突变，用一步法得到突变体质粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32，用两步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32；重组原核表达质粒pGEX-λT-FALL-39及其突变体融合蛋白有高效表达，经提取纯化可得到高纯度的活性蛋白FALL-39，FALL-39-Lys24，FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32(约4Kd)：突变后的FALL-39蛋白对大肠杆菌ATCC25922和耐氨苄青霉素ML-35p的抗菌活性明显增强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)值FALL-39-Lys24’32最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39两种蛋白均在含：Medium E的LB培养基中表现出较高活性，在LB培养基中抗菌活性最低，但在同一种培养基中FALL-39-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突变后FALL-39蛋白在抗菌剂量时对红细胞的溶解作用未见明显增加，较大剂量时对红细胞的溶解作用略有增加。突变后FALL-39-Lys32蛋白对LPS引起的iNOS mRNA的表达量增强抑制作用明显。结论：用FALL-39基因大肠杆菌表达载体可得到高效表达的蛋白；用高保真的Polybest DNA多聚酶进行一步法PCR定点突变技术简单、有效；突变质粒表达分子的抗菌活性和抗内毒素明显增强，对红细胞的溶解作用在抗菌剂量时未见明显增加，较大剂量时略有增加，提示在FALL-39分子中增加碱性氨基酸可以增强其抗菌活性。     

耐氟喹诺酮类铜绿假单胞菌的gyrA基因突变研究

目的：研究临床分离的耐氟喹诺酮类药物铜绿假单胞菌gyrA基因突变情况。方法：测定临床分离的55株铜绿假单胞菌的MIC值，从中筛选出1株敏感菌和8株耐药菌。以标准敏感菌株ATCC27853作为质控菌株，用聚合酶链反应（PCR）扩增gyrA基因的喹诺酮耐药决定区（QRDR），扩增产物片段长度为350bp。用限制性内酶SacⅡ消化PCR产物，同时对上述10株菌的gyrA基因的喹诺酮决定区（QRDR）进行PCR－DNA直接测序分析。结果：临床分离铜绿假单胞菌敏感菌株的gyrA基因QRDR经限制性内切酶SacⅡ消化后出现118bp,232bp两条片段，表明该酶切位点未发生突变，此结果经DNA序列析证实。而耐药菌在酶切后均为一条片段，表明该酶切位点消失，经DNA序列分析发现，8株耐药株在83位（ACC→ATC）均有突变，该单位突变引起氨基酸由Thr→Ile的改变；其中有3株高度耐药菌同时发现在87位（GAC→GGC）有突变，该单位点突变引起氨基酸由Asp→Gly的改变，但没有发现87位点突变单独存在，且双位点突变菌株的MIC值与单一位点突变的MIC值相比，有显著的升高，MIC增加4－32倍，除此之外，有6株耐药菌株在132位有一静止突变（CAC→CAT），该 突变未引起氨基酸的改变。结论：gyrA基因突变是铜绿假单胞菌对氟喹酮类药物产生耐药的主要机制之一，铜绿假单胞菌gyrA上83位和87位突变最为常见。     

突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织EGFR基因突变

目的：建立突变体富集PCR法检测非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。方法：选取55例细支气管肺泡癌和59例非小细胞肺癌病理组织蜡块，提取基因组DNA，采用不同的突变体富集PCR法（PCR-PAGE和PCR-RLFP）检测EGFR基因常见的19和21外显予突变，并经过直接测序验证。结果：在59例非小细胞肺癌中共检测出EGFR基因突变22例,突变率为37．3％（22／59）。55例细支气管肺泡癌中共检测出24例基因突变，突变率为43．6％（24／55）。经直接测序验证，EGFR19外显予有3种类型缺失突变。EGFR21外显予的错义突变为L858R。结论：突变体富集PCR法准确、快速、经济，便于临床筛查非小细胞肺癌病理组织中的EGFR基因突变。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的：探讨治疗性双质粒HBV DNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法：以脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000介导，将带有preS2＋S基因的重组疫苗质粒pS2，S和带有hIL2＋hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞，同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组，于转染后24，48，72，96h采用EL／SA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素（IL-2）及干扰素（IFN-1）的表达，并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性，采用ECL Western blotting分析和鉴定目的蛋白preS2＋S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果：双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达。且48h时目的蛋白的表达量达峰值，其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性，pS2．S和pFP的转染上清分别在30．6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论：HBVDNA疫苗质粒pS2．S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h，并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30．6ku和110ku。     

瑞替普酶(reteplase)在海带中表达的鉴定分析

为验证本实验室构建的瑞替普酶（reteplase，r-PA）基因是否成功转入海带，本文通过FAPA、PCR、Southern blotting和Western blotting等方法分别从体外纤溶活性、DNA的整合以及目的蛋白的表达等三个方面进行鉴定，并运用固定化金属离子亲和层析对表达的蛋白进行了初步分离纯化。FAPA结果表明转基因海带蛋白具有溶栓活性，PCR和Southern Blotting显示在1100bp处有特异性条带，Western blotting在39ku处有蛋白条带，证明r-PA基因已成功转入海带而且获得稳定表达，海带中表达的r-PA不需复性就具有溶栓活性，同时说明在r-PAN端设计的（His）6有助于我们利用亲和层析分离纯化目的蛋白。     

pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。     

甲型H5N1禽流感病毒血凝素在sf9昆虫细胞中的表达及其鉴定

目的  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达甲型H5N1禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）并对其进行鉴定。方法  根据sf9昆虫细胞密码子偏好性,对A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）禽流感病毒的HA基因进行序列优化并全长合成。构建重组供体质粒pFastHA,经PCR及测序鉴定后,转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒BacmidHA,用M13引物进行PCR鉴定。采用脂质体法转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBacHA。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）、蛋白质印迹法以及间接免疫荧光法对rBacHA表达产物进行分析。结果  供体质粒pFastHA经双酶切后产生了1条与预期大小相符的1 707 bp条带,序列测定证实目的基因无突变。穿梭质粒BacmidHA经PCR扩增,得到1条与预期大小相符的3 180 bp条带。SDS-PAGE结果显示,rBacHA表达产物的相对分子质量约为65 000。蛋白质印迹法分析表明,表达产物能与禽流感病毒阳性血清结合。在荧光显微镜下,感染rBacHA的sf9细胞呈现绿色荧光,提示HA基因得到表达。结论  利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统成功制备了具有良好抗原性的重组HA蛋白。     

人VEGF165基因的克隆、表达和活性鉴定

目的 克隆人VEGF165基因,构建其真核表达质粒,转染293细胞,并鉴定表达VEGF的生物学活性。方法采用PCR法从人心脏cDNA文库钓取人VEGF165基因,插入pUC19载体测序后与真核表达质粒pAdTrackCMV连接,阳离子脂质体Lipofectamin介导VEGF基因转染293细胞,Northern blot和Western blot法分别检测VEGFmRNA和蛋白的表达,Miles试验进行活性鉴定。结果(1)琼脂糖凝胶电泳分析得到两个片段,分别为582bp的VEGF165DNA和2．68kb的pUC19线性质粒,结果与理论值相符,VEGF165测序结果与GENE BANK中VEGF165序列完全一致。(2)转染293细胞后表达绿色荧光蛋白,转染后第3天(1024pg／ml)和5天(986pg／ml)VEGF表达最高,明显高于转染前(102pg／ml)。(3)Miles试验结果显示,用转染AdTrackCMV-VEGF165细胞培养上清皮下注射后10分钟左右皮丘变为蓝色,成倍连续稀释后,出现蓝斑的时间延长,蓝斑范围也相应缩小。而注射未转染293细胞培养上清和生理盐水组则未见蓝斑出现。结论成功克隆人VEGF165基因,并表达出具有生物学活性的VEGF蛋白。     

应用PCR方法直接检测痰中耐甲氧西林葡萄球菌

目的建立直接用痰标本通过PCR方法快速检测耐甲氧西林葡萄球菌的方法。方法利用聚合酶链反应技术（PCR）快速检出耐甲氧西林葡萄球菌，建立一种从痰中快速提取DNA方法，以粗提DNA作为PCR模板，检测编码耐甲氧西林葡萄球菌青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的mecA基因和细菌中均有的16SrRNA基因。结果364份临床痰标本经PCR方法检出mecA基因的38份，药敏法检出耐甲氧西林的葡萄球菌33份；38份mecA基因阳性的痰标本中有31份药敏法检测为耐甲氧西林的葡萄球菌，药敏法检出耐甲氧西林的葡萄球菌33份痰标本中有2份mecA基因阴性。16SrRNA基因片段在PCR中作为内部对照避免了假阴性结果的出现。结论用PCR直接检测痰中的mecA基因，是判断痰中是否含有耐甲氧西林的葡萄球菌的一种快速有效的方法。     

PCR-based site-specific mutagenesis of peptide antibiotics FALL-39 and its biologic activities

AIM: To construct PGEX-1λT-FALL-39 expression vector and its mutant vector, and study the relationship of function and structure. METHODS: A cDNA encoding mature FALL-39 was cloned from SPCA-1 cell mRNA and the prokaryotic expression vector PGEX-1λT-FALL-39 was constructed. Two kinds of polymerase chain reaction(PCR) for the site-direction mutagenesis were used to construct FALL-39 mutant expression vector, FALL-39-Lys-32 and FALL-39-Lys-24. Minimal effective concentration, minimal inhibitory concentration, and minimal bactericidal concentration were used to assay the antibacterial activities of these peptides. Effects of different solution on the antibacterial activity of FALL-39 and FALL-39-Lys-32 were observed by CFU determination. The hemolytic effects of these peptides were also examined on human red blood cells. RESULTS: Two site-specific mutants FALL-39-Lys-32 and FALL-39-Lys24 were obtained by PCR-induced mutagenesis. In comparison with two-step PCR which required two pairs of primers, one step PCR which required one pair of primers is a simple and efficient method for the PCR based site-specific mutagenesis. Using the prokaryotic expression system, the E coli-based products of recombinant FALL39 and its mutant peptides were also obtained. The antibacterial assay showed that FALL-39-Lys-32 and FALL-39-Lys24 were more potential in the antibacterial activity against E coli ML35p and Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 than that of FALL-39, and no increase in hemolysis was observed at the antibacterial concentrations, The antibacterial activity of FALL-39-Lys-32 against E coli was more potent than that of FALL-39 in NaCl-containing LB medium, while its activity was almost the same as FALL-39 in SO4^2 containing Medium E. CONCLUSION: PCR-based mutagensis is a useful model system for studying the structure and function relationship of antimicrobial peptides. Keeping α-helical conformation of FALL-39 and increasing net positive charge can increase the antibacterial activity of FALL-39 without increasing hemolysis at the antibacterial concentrations.     

Influence of heparin on the chemotactic activity of human thrombin

Abstract— Chemoattractant properties of human thrombin have been studied, by polymorphonuclear leucocyte migration under agarose gel, in the presence of various sulphated macromolecules such as standard heparins, low molecular weight heparins, CY216, K2165, PK10169 and pentosane polysulphate. These compounds did not attract polymorphonuclear leucocytes within the range of concentrations used, whilst thrombin alone is a cytotaxin for these cells. Addition of heparins to thrombin led to an increase in the chemoattractant activity of this enzyme for at least one of the doses studied. Augmentation of the chemoattractant activity of thrombin by heparins was shown at concentrations equivalent to those found in-vivo after administration of therapeutic doses of heparin. Pentosane polysulphate, at the studied concentrations, did not lead to a significant rise in the chemoattractant activity of thrombin.     

金荞麦无色花色素还原酶基因FdLAR的克隆和表达分析

无色花色素还原酶(leucoanthocyantin reducase,LAR)基因是植物类黄酮代谢途径中催化缩合单宁合成的一个关键结构基因,本研究通过简并PCR结合RACE的方法,获得了1个金荞麦(Fagopyrum dibotrys(D.Don)Hara)无色花色素还原酶基因FdLAR(GenBank accession:JN793953),序列全长1 581 bp,其中开放阅读框长1 176 bp,编码391个氨基酸的蛋白质,在N端存在1个保守结构域,属于RED蛋白家族。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,结果表明金荞麦无色花色素还原酶基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,电泳检测到1条大约66 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。利用实时荧光定量PCR技术检测FdLAR基因在金荞麦根茎中不同生长发育时期的表达情况,同时测定相应根茎中类黄酮的含量,结果表明FdLAR基因的表达量与类黄酮积累之间的关系在营养生长和生殖生长阶段呈现出不同的变化趋势,推测该基因可能在金荞麦类黄酮次生代谢产物积累中起作用。     

在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M_2及M_5受体重组突变体

目的为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台。方法用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记。将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白。Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能。结果通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体。将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变。Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力。结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究。