MiR-98靶向MTDH调控鼻咽癌恶性进展的实验研究

目的探讨miR 98对鼻咽癌细胞体外增殖和侵袭能力的影响及其可能机制。方法利用脂质体介导的miR 98 mimic（及阴性对照）转染鼻咽癌CNE 1和CNE 2细胞，CCK 8检测其体外增殖能力的改变，划痕愈合及Transwell侵袭小室实验检测鼻咽癌细胞的体外迁移及侵袭潜能变化，生物信息学软件预测miR 98可能的靶基因，并经双荧光素酶及Western blotting验证靶基因。结果MiR 98过表达能抑制鼻咽癌CNE 1和CNE 2细胞的体外生长增殖、迁移及侵袭能力；miR 98对MTDH具有直接靶向调控作用。结论本研究表明miR 98能够靶向MTDH调控鼻咽癌细胞株的体外生长增殖及侵袭能力。     

葡萄糖调节蛋白78上调MMP-2和MMP-9促进鼻咽癌细胞CNE1的增殖与侵袭

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）对鼻咽癌细胞CNE1的增殖与侵袭的作用机制。方法 收集2018年6月—2019年6月手术切除病灶的56例经病理确诊鼻咽癌患者的肿瘤组织作为鼻咽癌组织的研究对象,男40例,女16例;均为初次确诊鼻咽癌,并且尚未经过放/化疗干预。另同期选取进行治疗的50例慢性鼻咽炎组织作为比对,男38例,女12例。用免疫组化分别检测鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中GRP78的表达。CNE1细胞实验分为对照组（CNE1鼻咽癌细胞常规培养,不进行外界干预）、NC组（CNE1鼻咽癌细胞转染LvGFP-Puro-GRP78-NC后,常规培养）、Sh-GRP78组（CNE1鼻咽癌细胞转染LvGFP-Puro-GRP78后,常规培养）,转染完成48 h后,可在荧光显微镜下观察到各组细胞内的绿色荧光蛋白（GFP）,PCR检测各组细胞中GRP78的mRNA的表达。Brdu标记检测各组细胞的增殖能力,Transwell小室检测各组细胞的侵袭能力,小管形成实验检测各组细胞的血管形成能力;双荧光素酶实验分析GRP78和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9的作用,Western blot检测各组细胞GRP78、MMP-2和MMP-9表达水平。结果 与慢性鼻咽炎组织相比,GRP78在鼻咽癌组织中的表达明显升高,Sh-GRP78组CNE1细胞增殖、侵袭和迁移能力、血管形成能力明显增强,差异均具有统计意义（P<0.05）。双荧光素酶实验结果显示MMP-2和MMP-9是GRP78作用的靶基因。与对照组相比,Sh-GRP78组细胞中GRP78、MMP-2和MMP-9的表达水平明显上升,差异均具有统计意义（P<0.05）。结论 GRP78在鼻咽癌组织中存在高表达的现象,并且GRP78靶向调控MMP-2和MMP-9的表达增强CNE1细胞的增殖、侵袭与血管新生的能力。     

miR-34b基因在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的检测鼻咽癌组织中miR 34b的表达,并探讨其与鼻咽癌临床病理的关系。方法收集2016年1月～2017年10月海口市人民医院经病理确诊的114例鼻咽癌患者标本作为鼻咽癌组,另选取同期行鼻内镜鼻息肉手术切除的良性鼻咽标本40例作为对照组。采用荧光定量PCR检测miR 34b在两组中的表达,并分析其与鼻咽癌临床病理特征的关系。结果鼻咽癌组织中miR 34b的相对表达量2 △Ct值为0.136±0.021,显著低于对照组织的0.294±0.052（P<0.01）;miR 34b的相对表达量2 △Ct值与鼻咽癌患者的性别、年龄和病理分级无显著相关性（P>0.05）;miR 34b的相对表达量2 △Ct值在临床Ⅲ、Ⅳ期患者为0.126±0.015,显著低于Ⅰ、Ⅱ期患者的0.183±0.046（P<0.05）;miR 34b值在淋巴结有转移的患者为0.116±0.013,显著低于无转移的0.162±0.041（P<0.05）。结论鼻咽癌组织中miR 34b呈低表达,其表达变化可能参与鼻咽癌的发生、发展和转移过程。     

SGK1在鼻咽癌中的表达及其对鼻咽癌细胞生物学特性的影响

DOI:10.11798/j.issn.·鼻咽癌专栏·基金项目：第目的探讨SGK1在鼻咽癌（NPC）中的表达及其对肿瘤细胞存活、增殖和迁移的影响。方法采用免疫组织检测NPC组织和慢性鼻咽炎组织中SGK1的表达。使用lipofectamine 2000瞬时转染NPC细胞系HNE 1，Western blot检测siRNA干扰组、阴性对照组及未转染组细胞中的SGK1表达，筛选SGK1沉默效果最佳的NPC细胞。CCK8法检测转染细胞的增殖能力，Transwell细胞迁移实验检测SGK1沉默对细胞迁移能力的影响，流式细胞术检测其凋亡水平。结果NPC组织中SGK1的表达明显高于慢性鼻咽炎组织。Western blot结果显示转染SGK1 siRNA后HNE 1细胞中SGK1蛋白水平明显下降。SGK1基因沉默后，HNE 1细胞表现出较强的细胞增殖和迁移抑制作用。此外，沉默SGK1后，HNE 1细胞的凋亡率增加。结论SGK1在NPC组织中呈高表达。沉默SGK1基因可抑制NPC细胞系HNE 1的增殖、迁移和存活能力。     

MicroRNA-107抑制喉癌细胞的迁移及侵袭能力的临床分析

目的通过观察microRNA 107（miR 107）在喉癌及癌旁组织中的表达，并且在喉癌细胞系选择性上调及敲减miR 107，检测其对喉癌细胞迁移及侵袭能力的影响。方法收集40例喉癌及其邻近癌旁组织标本，运用RT qPCR检测miR 107的表达，并分析其在喉癌中的临床意义。在人喉癌细胞TU212及TU686中过表达或敲减miR 107，通过Transwell法检测其对喉癌细胞迁移及侵袭能力的影响。结果MiR 107在喉癌组织中的表达显著低于癌旁组织，差异具有统计学意义（P<0.05），miR 107的表达水平与肿瘤细胞分化程度、淋巴结转移及原发部位相关（P<0.05）。细胞实验显示，过表达miR 107后喉癌细胞迁移及侵袭能力明显下降（P<0.05），而敲减miR 107后细胞迁移及侵袭能力明显增强（P<0.05）。结论MiR 107在喉癌中表达显著下调，它能够抑制喉癌细胞的迁移和侵袭能力。     

长链非编码RNA母系表达基因3在鼻咽癌细胞中的表达及临床意义

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（maternally expressed gene3,MEG3）在鼻咽癌细胞中的表达及临床意义。方法　采用qRT-PCR检测鼻咽癌细胞CNE-2、C666-1和TW03中MEG3的含量,用MEG3在鼻咽癌细胞株的敲除和过表达分析其表达,采用CCK-8与Transwell检测鼻咽癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果　MEG3在鼻咽癌细胞株中的表达水平明显低于正常鼻咽上皮细胞系NP69的表达量（0.99±0.05）（P 均<0.05）,其中在CNE-2中的表达水平最低为（0.64±0.03）（F =58.137,P <0.01）。转染后pcDNAMEG3显著促进MEG3的表达（5.43±0.13）（F =447.052,P <0.01）,进而抑制鼻咽癌CNE-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力并促进细胞凋亡,与对照组相比差异有统计学意义（P 均<0.01）;而si-MEG3明显下调MEG3的表达（0.373±0.01）（F =593.452,P <0.01）,促进鼻咽癌CNE-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力并抑制细胞凋亡,与对照组相比差异有统计学意义（P 均<0.01）。结论　长链非编码RNA-MEG3在鼻咽癌细胞中呈低表达,过表达MEG3可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并可促进癌细胞凋亡,其有望成为鼻咽癌治疗的新靶点。     

CK13基因与EB病毒DNA在鼻咽癌中的表达及临床意义

目的 探讨细胞角蛋白基因13（CK13）和EB病毒DNA在人鼻咽癌（NPC）组织中的表达及意义。方法 应用Northern杂交对32例NPC和8例慢性鼻咽炎（CINE）组织进行CK13mRNA水平检测,同时应用PCR方法进行EB病毒DNA检测。结果 ＣＫ１３基因在鼻咽炎组织中高表达,在ＮＰＣ组织中的表达显著下调。下调的频率达６５.63%(21/32)。结论 ＮＰＣ组织的分化可能与ＣＫ１３基因的表达下调有关。     

环状RNA BCRC-3对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响研究

目的　观察鼻咽癌组织和细胞株中环状RNA（circular RNA，circRNA）BCRC-3的表达，探讨环状RNA BCRC-3对细胞周期依赖性激酶抑制蛋白B（cyclin dependent kinase inhibitors B，DKNIB）基因表达的调控及对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法 荧光实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分别检测circRNA BCRC-3在83例鼻咽癌组织及62例慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及人永生化鼻咽上皮细胞中的表达。以circRNA BCRC-3表达最低的细胞株为转染对象，分别转染阴性对照质粒（对照组） 或载有circRNA BCRC-3序列的质粒（实验组）。MTS法和细胞划痕实验分别检测上调circRNA BCRC-3对细胞增殖和迁移能力的影响。qPCR检测上调环状RNA BCRC-3对DKNIB基因mRNA表达的影响，Western blot检测DKNIB蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。结果 与慢性鼻咽炎组织相比，circRNA BCRC-3在鼻咽癌组织中表达显著降低（P <0.01）。与人永生化鼻咽上皮细胞相比，环状RNABCRC-3在鼻咽癌细胞株中表达显著降低（P <0.01），在HONE-1细胞中的表达最少（P <0.01）。与对照组比较，实验组HONE-1细胞增殖能力从第2天开始明显下降（P <0.05），HONE-1细胞迁移能力明显降低（P <0.01），HONE-1细胞中DKNIB在mRNA和蛋白水平的表达明显上升（P <0.01），PI3K/AKT信号通路蛋白PIP3、PDK1、p-AKT和AS160表达明显下降。结论 circRNA BCRC-3在鼻咽癌组织和细胞株中呈低表达，上调circRNA BCRC-3可抑制鼻咽癌HONE-1细胞的增殖和迁移能力，其机制可能是circRNA BCRC-3通过上调DKNIB基因表达，抑制PI3K/AKT信号通路转导。     

沉默变异性浆细胞瘤异位１抑制鼻咽癌细胞增殖作用的机制研究

目的探讨变异性浆细胞瘤异位１（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏ ｍａｖａｒｉａｎｔｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ１，ＰＶＴ１）抑制鼻咽癌细胞增殖的分子机制。方法构建特异性的shRNA PVT1慢病毒载体，包装慢病毒（LV/shRNA PVT1）并转导鼻咽癌C666 1细胞，检测Smad4的表达；LV/shRNA PVT1转导C666 1细胞24 h后转染Smad4 siRNA，通过细胞计数、四甲基偶氮唑蓝（MTT）法及流式细胞术分析沉默Smad4对LV/shRNA PVT1介导的鼻咽癌细胞生长及细胞周期的影响，并检测细胞周期相关调控因子的表达。结果下调PVT1后鼻咽癌细胞中Smad4的表达升高，而用siRNA沉默Smad4表达后，结果显示，抑制Smad4表达可阻断LV/shRNA PVT1介导的细胞生长抑制效应，同时细胞周期结果显示，与对照组相比，shRNA PVT1/Smad4 siRNA组细胞G1期比例降低，S期和G2期比例升高，并且CDK4、CDK6及c myc的mRNA水平升高。结论下调PVT1可抑制鼻咽癌细胞增殖，并升高Smad4的表达，沉默Smad4可阻断shRNA PVT1对鼻咽癌细胞增殖的抑制效应；提示Smad4可能是PVT1作用的一个下游靶基因，下调PVT1可能通过Smad4抑制鼻咽癌细胞增殖。     

长链非编码RNA KCNQ1OT1在鼻咽癌中的表达及对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响

目的　分析长链非编码RNA KCNQ1OT1在鼻咽癌组织和细胞中的表达，观察其对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法　采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测KCNQ1OT1在鼻咽癌组织和细胞株中的表达。选取表达量最低的鼻咽癌细胞株转染过表达KCNQ1OT1的质粒及空载质粒。qRT-PCR检测KCNQ1OT1和 SEMA3BmRNA的表达，Western blot检测SEMA3B蛋白的表达，采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）和Transwell迁移实验检测KCNQ1OT1对鼻咽癌细胞增殖能力和迁移能力的影响。结果　KCNQ1OT1在鼻咽癌组织的表达量（1.78±0.10）明显低于癌旁组织（3.24±0.29）（t =4.65，P <0.01），在鼻咽癌细胞株的表达量明显低于鼻咽上皮细胞NP69（P <0.05），其中CNE-2Z细胞表达量最低（t =12.61，P <0.01）。转染KCNQ1OT1质粒后可显著促进KCNQ1OT1的表达（P <0.01），SEMA3B 在mRNA和蛋白水平上的表达量明显升高（P <0.01）。KCNQ1OT1过表达后，鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖能力和迁移能力明显被抑制（P <0.01）。结论　KCNQ1OT1在鼻咽癌组织和细胞中呈低表达，过表达KCNQ1OT1可通过增加SEMA3B基因的表达，抑制鼻咽癌CNE-2Z细胞的增殖能力和迁移能力，有望成为鼻咽癌治疗的新靶点。     

LMP1诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗的体外实验

 目的探讨EBV膜潜伏蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因过表达后对肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand,TRAIL)凋亡诱导作用和凋亡信号传导的影响。方法利用脂质体介导的pGL6 LMP1上调LMP1低表达的TRAIL抵抗性鼻咽癌细胞CNE 1中LMP1的表达;通过MTT比色法、流式细胞术观察LMP1过表达后对CNE 1细胞TRAIL敏感性的影响;流式细胞术、Western blot、线粒体膜电位检测观察LMP1过表达后对死亡受体表达、细胞内外凋亡信号通路激活、线粒体膜电位改变的影响。结果死亡受体荧光标记后流式细胞术检测发现CNE 1和CNE 1 LMP1之间细胞膜蛋白死亡受体4（death receptor 4,DR4）,死亡受体5（death receptor,DR5）表达差异无统计学意义（P>0.05）。Western blot结果显示TRAIL(100 ng/ml)分别作用2、4、6、12 h后,CNE 1细胞中caspase 8 p43/p41,p18亚单位蛋白和caspase 3 p17,p10亚单位蛋白表达明显高于CNE 1 LMP1细胞,而Bcl 2相互作用域死亡激动蛋白的截短形式（truncated form of Bid,tBid）和caspase 9 p35亚单位蛋白表达无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。JC 1线粒体膜电位检测法结果显示TRAIL干预后,线粒体膜电位无明显改变,且两个细胞株间也无明显区别。结论LMP1过表达抑制TRAIL对鼻咽癌细胞的凋亡诱导作用和其细胞外凋亡信号的传导,提示LMP1是通过抑制细胞外信号通路激活诱导鼻咽癌细胞发生TRAIL抵抗。     

MiR-324-3p经上皮-间质转化调控鼻咽癌迁移侵袭的实验分析

摘要：目的探讨miR 324 3p对鼻咽癌细胞体外迁移侵袭能力的影响。方法MiR 324 3p转移上调其在鼻咽癌5 8F和6 10B细胞中的表达,采用划痕愈合实验及Transwell侵袭实验检测上调后的鼻咽癌5 8F和6 10B细胞迁移及侵袭能力;western blot检测上皮-间质转化（EMT）上皮细胞标志物E cadherin和间质细胞标志物Vimentin的表达。结果MiR 324 3p成功转移上调了其在鼻咽癌5 8F和6 10B细胞中的表达。过表达miR 324 3p的鼻咽癌5 8F和6 10B细胞的体外迁移及侵袭能力显著下降,可同时伴随着E cadherin的表达上调,Vimentin的表达下降。结论MiR 324 3p可能通过诱导EMT改变调控鼻咽癌细胞的侵袭转移能力。     

MiR-22经上皮-间质转化调控头颈鳞癌的侵袭转移

目的探讨miR 22对头颈部鳞状细胞癌（头颈鳞癌）上皮-间质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）和侵袭转移的影响。方法利用脂质体介导的miR 22 mimic及inhibitor（含阴性对照）分别转染头颈鳞癌Tu686细胞，划痕实验及Transwell侵袭实验检测其体外迁移及侵袭能力的改变，Western blotting检测EMT分子标志物的改变。结果hsa miR 22 mimic能抑制Tu686细胞的体外迁移及侵袭能力，相反hsa miR 22 inhibitor能促进Tu686细胞的体外迁移及侵袭能力。且miR 22过表达后能在Tu686细胞中抑制EMT的分子标志物改变，即E cadherin的表达上调和Vimentin的表达下调。结论本研究表明miR 22对头颈鳞癌细胞的体外迁移侵袭能力具有调控作用，该调控作用的发生与miR 22对EMT的抑制作用密切相关。     

PD-L1蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义

目的探讨PD L1在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学技术对收集的162例鼻咽癌组织进行PD L1蛋白的表达检测,并结合患者临床病理参数及预后信息,探讨其临床价值。结果PD L1蛋白表达水平与性别、年龄、PS评分、临床分期、吸烟情况等临床病理参数之间无显著差异(P>0.05)。PD L1阳性组与阴性组3年总生存率分别为92.3%与80.0%,差异具有统计学意义(P=0.026)。结论PD L1蛋白阳性鼻咽癌患者预后较好,有望成为鼻咽癌患者预后评估的生物标志物。     

血浆长链非编码RNA NEAT1和H19及MALAT1在鼻咽癌中的表达及临床意义

 目的探讨长链非编码RNA（long non coding RNA, lncRNA）3个分子NEAT1和H19及MALAT1在鼻咽癌患者血浆中的表达水平及其在鼻咽癌诊断中的价值。方法收集91例病理确诊的鼻咽癌患者和100例健康体检者血浆作为研究对象。采用定量逆转录PCR检测上述3个lncRNA分子在鼻咽癌患者及健康者血浆中的表达水平。统计分析鼻咽癌患者血浆lncRNA NEAT1、H19和MALAT1 的表达水平与临床因素之间的关系,受试者工作特征（ROC）曲线和曲线下面积（AUC）评估血浆这3个lncRNA分子诊断鼻咽癌的效能。结果鼻咽癌患者血浆lncRNA NEAT1、H19和MALAT1的相对表达量均显著高于对照组（P<0.001）。MALAT1表达水平与N分期相关。血浆NEAT1、H19和MALAT1检测诊断鼻咽癌的AUC分别为0.715、0.708和0.704;NEAT1与H19联合,诊断鼻咽癌AUC增加至0.734。结论鼻咽癌患者血浆lncRNA NEAT1、H19和MALAT1有可能成为鼻咽癌辅助诊断的标志物。     

Fat1蛋白在下咽癌中的表达及在侵袭转移过程中的作用

摘要：目的探讨Fat1蛋白在下咽癌中的表达及其生物学行为。方法应用免疫组织化学染色检测组织中Fat1蛋白的表达水平,采用Kaplan Meier法分析Fat1蛋白的表达与下咽癌患者生存期的关系。siRNA干扰下咽癌Fadu细胞中Fat1蛋白的表达;Western blot 法检测siRNA干扰后Fat1蛋白的表达;CCK 8实验检测细胞增殖能力;克隆形成实验检测细胞成瘤能力;划痕实验、Transwell 小室实验检测其侵袭、迁移能力。结果Fat1蛋白主要在胞浆中表达,在下咽癌复发病例中的表达强度明显低于未复发患者（P=0.001）;低表达组患者总生存时间明显低于高表达组（P=0.001）。体外实验提示,siRNA下调Fat1蛋白后,Fadu细胞生长能力明显高于对照组（P=0.004）,且细胞克隆数也明显高于对照组（P=0.001）;此外,下调Fat1蛋白后,Fadu细胞的迁移能力高于对照组,且细胞穿越小室的细胞数明显高于对照组（P=0.000）。结论Fat1蛋白表达下调提示下咽癌患者预后较差;Fat1蛋白能显著抑制下咽癌细胞的生长、增殖、侵袭、转移能力。