缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体的构建

目的：本实验旨在通过构建大鼠缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体的真核表达质粒载体,为研究大鼠肝组织因TGFβ1Ⅱ型受体缺陷而阻断TGFβ1的作用后,对人工免疫性大鼠的肝组织及其他组织的影响提供实验材料.方法：根据大鼠肝组织TGFβ1Ⅱ型受体的基因序列,设计在特异的位置添加终止密码,在此序列两端加入特异的限制性内切酶的酶切位点,从而构建大鼠的缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体基因序列,再利用基因重组技术,将其连接在真核表达质粒载体中,对此质粒载体进行酶切电泳鉴定和DNA测序加以验证.结果：运用分子生物学技术,成功获取突变体TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体,经过DNA测序鉴定,确认为实验预期所需.结论：TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体构建成功,其关键涉及基因片段及载体的选择.     

缺陷型转化生长因子β1Ⅱ型受体表达质粒阻断大鼠肝纤维化的实验研究

目的构建缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体的表达质粒,观察其对人工免疫性大鼠肝纤维化的影响。方法运用基因重组技术,构建大鼠缺陷型TGβ1Ⅱ型受体表达质粒载体,将其导入CCl4诱导肝纤维化的大鼠体内,观察其对大鼠肝纤维化的影响。结果经酶切和DNA测序鉴定缺陷型TGFβ1Ⅱ型受体真核表达质粒载体构建成功,经缺陷型TGβ1Ⅱ型受体表达质粒处理的大鼠肝纤维化程度轻,血清中PCⅢ、Ⅳ-C、HA和LN均较未经处理组低。结论经缺陷型TGβ1Ⅱ型受休表达质粒处理后可减轻CCl4导致的肝纤维化增生。     

人正、反义转化生长因子beta1基因真核表达载体的构建

目的 :构建人转化生长因子beta 1(TGFβ1)正、反义基因真核表达载体。方法 :从人胎脑的cDNA文库中扩增出TGFβ1共 12 84bp长的DNA片段后 ,与T载体直接进行高效连接 ,并测序证实无突变。接着利用TGFβ1引物两端所设计的酶切位点将目的片段定向亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1( )。构建的正反义表达重组体 (pcDNA3.1 TGFβ1和pcDNA3.1 antiTGFβ1)经限制性内切酶消化证实其中有目的片段完整插入。结果 :本实验成功构建了人正、反义TGFβ1基因真核表达载体。结论 :人正、反义TGFβ1基因真核表达载体的构建 ,为今后研究腹膜纤维化的防治奠定了实验基础。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体真核表达载体的构建及表达

目的:构建人转化生长因子βⅡ型受体胞外区(sTGFβRⅡ)基因的真核表达载体,转染真核细胞CHO以表达sTGFβRⅡ蛋白,并检测其生物学活性.方法:以TGFβRⅡ的重组质粒为模板,用PCR方法扩增得到人TGFβRⅡ胞外区(1-159位氨基酸)的cDNA,将该cDNA重组到真核表达载体pCDNA3.1/myc-his(-)B(pCDNA)的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点上,构建成pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染CHO细胞,用Western blotting法检测sTGFβRⅡ的表达,并测定其生物学活性.结果:CHO细胞转染pCDNA-sTGFβRⅡ重组质粒后,其培养上清经 Western blotting分析,显示有特异性的蛋白条带,所表达的蛋白能明显抑制TGFβ1对貂肺上皮细胞的增殖抑制作用.结论:成功克隆了sTGFβRⅡ基因,并获得有生物学活性的sTGFβRⅡ蛋白.     

HBD3基因真核表达质粒载体的构建及其体外表达和活性鉴定

目的构建人β防御素3(HBD3)基因真核表达质粒载体,观察其在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达,并检测其活性。方法利用RT-PCR方法从牙龈组织中扩增出HBD3基因片段,通过DNA重组技术将基因片段重组于pVIVO1-mcs真核表达质粒载体上,构建成pVIVO1-HBD3重组质粒载体,分别用酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组质粒载体进行鉴定。运用jetPEI转染试剂将重组质粒转染BMSCs后,RT-PCR、免疫荧光和蛋白质印迹法检测目的基因的表达。取转染重组质粒的BMSCs无血清上清的浓缩液,采用K-B纸片扩散法进行抗菌活性实验。结果 (1)酶切电泳分析得到相应的目的片段,大小与理论计算值一致,DNA测序证实目的基因序列正确无突变,成功构建真核表达质粒载体pVIVO1-HBD3。(2)RT-PCR和免疫荧光、蛋白质印迹法分别从mRNA和蛋白质2个水平证实转染的BMSCs高表达HBD3。(3)转染重组质粒的BMSCs无血清上清的浓缩液对白色念珠菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌产生明显的抑菌环,证实了表达分泌出的HBD3的抗菌活性。结论构建了pVIVO1-HBD3基因真核表达质粒载体,证实其转染BMSCs后基因的表达和活性。     

重组人转化生长因子-β1荧光质粒的构建及转染软骨细胞的基因表达

目的：探讨重组人转化生长因子（TGF）-β1荧光质粒的构建及经脂质体转染软骨细胞的表达情况.方法：体外酶消化分离法培养兔关节软骨细胞并采用特异性细胞外基质Ⅱ型胶原免疫细胞染色进行鉴定.双酶切法切取TGF-β1的cDNA片段,通过T4 DNA连接酶连接到pEGFP-C1载体上构建pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒.用构建的pEGFP-C1-TGF-β1表达质粒经脂质体转染软骨细胞,在12、24 h、2、4、6 d通过荧光显微镜观察细胞内TGF-β1基因的表达,应用荧光定量PCR检测表达水平.结果：成功分离培养软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞染色显示细胞胞质染成棕黄色,胞核基本不着色.pEGFP-C1-TGF-β1真核表达载体质粒成功构建,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.荧光显微镜观察转染后的软骨细胞有绿色荧光蛋白表达,软骨细胞的转染率分别为12 h：（8.22±2.02）%,24 h：（16.54 4±2.91）%,2 d：（14.06±3.67）%,4 d：（14.24±2.62）%,6 d：（12.36±2.28）%.荧光定量PCR检测转染软骨细胞TGF-β1基因拷贝数为16 277±1779,高于未转染软骨细胞的3095±205（P〈0.05）.结论：构建的TGF-β1荧光质粒可以转染软骨细胞并获得表达,为基因治疗骨性关节炎的研究提供基础.     

TGF—β1原核表达载体的构建

目的：克隆人TGF—β1基因,为TGF—β1的研究提供平台。方法：应用RT—PCR技术扩增人TGF—β1基因序列,将TGF-β1基因插入载体PET-28a,构建pET28a—TGF—β1重组质粒。结果：经限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,重组质粒PET-28a—TGF—β1序列及阅读框架正确。结论：获得了TGF—β1编码序列和表达载体,能满足进一步实验的需要。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建

目的：构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶（NTPase-Ⅱ）重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法：采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果：NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论：成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-haFGF。方法 PCR扩增人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）基因,BglⅡ和HindⅢ双酶切后克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建haFGF真核表达载体pEGFP-N1-haFGF,并经限制性酶谱分析和DNA测序对重组表达载体的正确性进行鉴定。结果重组真核基因表达载体pEGFP-N1-haFGF经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ酶切,DNA电泳显示465 bp的haFGF目的片段和4 700 bp的pEGFP-N1载体片段,重组载体经DNA测序显示所克隆的haFGF基因核苷酸顺序与Genbank中记载的haFGF序列一致。结论本实验成功构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体,为进一步研究haFGF的功能奠定基础。     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

神经营养素3基因克隆及其真核表达载体的构建

目的 克隆大鼠神经营养素-3(NT-3)基因的表达序列,构建大鼠NT-3基因真核表达载体.方法 应用RT-PCR从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中构建重组质粒pcDNA3-N3,用限制酶酶切鉴定和DNA序列分析鉴定重组质粒.结果 RT-PCR产物为822 bp的特异片段,重组质粒酶切后产生822 bp和5.2 kb片段,DNA测序证实822 bp片段的碱基序列与大鼠NT-3 cDNA序列完全一致.结论 成功克隆大鼠NT-3基因表达序列并构建了NT-3基因真核表达载体pcDNA3-N3.     

ZAK-β蛋白激酶基因真核表达载体的构建

目的 将人源ZAK-β基因定向克隆入MSCV-IRES-GFP质粒,构建真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β.方法 以肺癌A549细胞的cDNA为模板,通过PCR得到ZAK-β特异性基因产物,克隆入真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,获得重组真核表达载体pMSCV-IRES-GFP-ZAK-β,测序验证.结果 扩增了ZAK-β基因,经双酶切、测序鉴定证实目的基因克隆到真核表达载体pMSCV-IRES-GFP中,测序结果与预测完全一致.结论 成功构建了ZAK-β逆转录病毒表达载体,为进一步研究ZAK蛋白激酶的功能奠定了基础.     

果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体cDNA克隆及其载体的构建

目的克隆果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR-1)全长基因序列,构建其真核表达载体pdFR1。方法采用PCR方法扩增果蝇FGFR-1基因全长序列,克隆人载体pT—Adv,转化大肠杆菌XL1-Blue,挑选白色菌落行酶切鉴定及测序。重组质粒pT—Adv／FGFR-1酶切,回收目的基因片段,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中,命名为pdFR1,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pT-Adv／FGFR-1测序结果与GenBank完全一致,pdFR1行限制性内切酶酶切,酶切片段与预期值相符。结论克隆了果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体全长基因序列,构建了其真核表达载体pdFR1,为完善异种分子疫苗免疫理论莫定基础。     

人HIF-1α真核表达载体质粒的建立和鉴定

目的:建立低氧诱导因子1α(HIF-1α)真核表达质粒.方法:从人胎肝细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成HIF-1α cDNA,与T载体连接后转化感受态细胞TOP10,测序正确后克隆入pcDNA3真核表达载体,酶切鉴定重组子.结果:获得人HIF-1α真核表达载体质粒,酶切及测序结果证明表达质粒的DNA序列完全正确.结论:成功克隆和建立人HIF-1α基因真核表达质粒,为进一步研究HIF-1α对风湿性疾病的靶向治疗奠定了基础.     

重组Sox5蛋白cDNA克隆与真核表达载体的构建

目的 克隆人类睾丸组织特异的Sox5基因全长cDNA，构建重组Sox5真核表达载体pcDNA3-Sox5。方法 从成人睾丸组织提取总mRNA，采用RT-PCR技术扩增SoxScDNA片段，并将扩增的cDNA片段插入pcDNA3真核表达质粒，双酶切及测序鉴定重组质粒。结果 经RT-PCR获得1．1kb的产物，连接重组后经双酶切筛选阳性克隆，DNA测序验证，确定成功筛选出真核表达载体pcDNA3Sox5。结论 成功构建人Sox5基因全长cDNA真核表达载体，为进一步探索精细胞特异表达的Sox5转录因子是否参与ZNF30的转录调控打下了基础。     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

IL-1β反义RNA真核表达载体的构建

目的 通过构建IL-1β反义RNA真核表达载体,为进一步研究IL-1β奠定了基础.方法 采用RT-PCR法分别获取IL-1β的两段基因序列,利用基因工程方法构建IL-1β反义RNA真核表达载体,并对其进行反复PCR鉴定、单酶切鉴定和DNA序列分析.结果 经最终DNA序列分析证实,成功构建了人IL-1β反义RNA真核表达载体.结论 本研究为IL-1β尤其是肿瘤微环境中IL-1β作用的研究提供了证据.     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

人血管生成素1真核表达载体的构建

目的构建人血管生成素1(angiogenin-1,ang-1)的真核表达载体。方法提取人总RNA,RT-PCR特异扩增人的Ang-1cDNA,与pGEM-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α。筛选表达蓝白斑的阳性菌株扩增,提取质粒。选择正确的序列的产物,Xho I、BamH I双酶切产物和质粒,T4DNA连接酶连接,PCR扩增后转化大肠杆菌,抽提质粒进行测序。结果测序结果显示基因序列与人血管生成素1序列完全一致。结论成功构建了pEGFP/Ang-1真核表达载体。