三种植物源增殖性底物对嗜酸乳杆菌发酵及蛋白表达的影响

为探究植物源增殖性底物对嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus CICC6005)生物量的影响,并在此基础上重点解析发酵菌体蛋白质表达水平上的变化,本研究通过采用正交优化方法,在TJA培养基中添加各种增殖性底物确定其生物量的水平,利用SDS-PAGE凝胶电泳技术对胞内胞外蛋白质进行纯化鉴定。结果显示,三种植物源增殖性底物最优浓度分别为番茄汁5%、土豆汁3%、苹果汁2%,发酵液活菌数达2.31×1010 CFU/mL;由R值分析得出,影响L. acidophilus CICC6005菌株生长的各因素的主次顺序为:番茄汁、土豆汁和苹果汁。发酵液中表达全蛋白质的图谱显示,L.acidophilus CICC6005菌株在该营养条件下表达蛋白的数量有明显的增加,并根据标准曲线得出各峰的蛋白分子量大小,即胞内蛋白的分子量为59、17 ku;胞外蛋白的分子量为66、35 ku,其表达量分别为2.144、0.744、2.394、4.644 mg/mL。综上,在TJA基础培养基上,适宜浓度的植物源增殖性底物对L. acidophilus CICC6005菌株的增殖以及蛋白质的表达水平均起到了一定的促进作用,同时纯化鉴定出该菌表达的两种主要蛋白质,对进一步其益生功能具有科学和实践意义。     

嗜酸乳杆菌胞外蛋白的分离纯化及抑制HT-29细胞增殖作用的研究

为探讨嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)分泌的相关蛋白质及其促进肠道稳态的功能作用,本研究以L.acidophilus作为研究对象,固体培养获得胞外蛋白粗提液,采用Sephadex G-100凝胶层析纯化,收集胞外蛋白各组分,用考马斯亮蓝法和SDS-PAGE方法分别测定各蛋白组分的含量及分子量,然后采用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)鉴定各蛋白组分抑制HT-29细胞增殖的能力。研究显示,分离L.acidophilus胞外蛋白获得两个蛋白峰,分子量分别为67 ku和37 ku,含量分别为0.066 mg/m L和0.021mg/m L,不同浓度(0.001μg/m L、0.01μg/m L、0.1μg/m L和1μg/m L)的67 ku和37 ku胞外蛋白分别对HT-29细胞作用12 h、24 h、48 h和72 h,均显示抑制细胞增殖的作用,且呈现明显的量效关系和时间依赖效应,其中1μg/m L的67 ku和37 ku胞外蛋白对HT-29细胞作用48 h的抑制率分别为(38.41±1.94)%和(45.06±1.58)%。综上所述,固体培养L.acidophilus可获得两种胞外蛋白(即37 ku和67 ku),其对HT-29细胞增殖具有不同程度的抑制作用,其中37 ku胞外蛋白的抑制作用较强。     

嗜酸乳杆菌胞外蛋白调控MAPK和PI3K-AKT信号途径关键蛋白活化水平

探讨并揭示嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CICC6005分泌的相关蛋白质促进肠道健康及分子机制具有重要研究价值。本实验在确定了L.acidophilus CICC6005分泌的胞外蛋白抑制HT-29结肠癌细胞增殖的基础上,进一步探讨67 ku和37 ku的胞外蛋白通过何种途径发挥抑制结肠癌细胞增殖。研究以HT-29细胞作为靶细胞,用丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B,PI3K-AKT)信号通路为考察对象,以Western Blotting为手段,分析两个通路中关键的靶点蛋白p38、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、磷酸化p38(phosphorylated p38,p-p38)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated AKT,p-AKT)、PI3K的表达水平,以探讨并阐述源于L.acidophilus CICC6005胞外蛋白调控结肠癌细胞增殖状况的分子机制。结果表明,不同质量浓度的67 ku和37 ku胞外蛋白分别作用HT-29细胞一定时间后,两种胞外蛋白均具有下调两个信号通路途径中p-ERK1/2、p-p38、p-AKT、PI3K蛋白的表达,且存在浓度依赖关系;但对p-JNK、ERK1/2、p38、JNK蛋白的表达没有影响。因此,源于L.acidophilus CICC6005分泌的37 ku和67 ku胞外蛋白表现出显著的抑制HT-29细胞增殖的功能,其机制可能与调控MAPK和PI3K-AKT两个信号通路中几个关键的靶点蛋白的活化水平相关。该研究结果提示,食用嗜酸乳杆菌其分泌的胞外蛋白质将达到维护肠道健康的目标。     

丰年虫水溶性蛋白的分离纯化及体外抗氧化性研究

目的:对丰年虫水溶性蛋白进行分离纯化,获得体外抗氧化活性最好的水溶性蛋白组分,并测定其分子质量。方法:丰年虫水溶性粗蛋白经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G-100凝胶层析分离纯化,对纯化后的蛋白质进行体外抗氧化活性的研究,利用SDS-PAGE电泳测定蛋白质分子质量。结果:丰年虫水溶性蛋白经DEAE-Sepharose FF离子交换层析,梯度洗脱得到4个洗脱峰(峰1～4),峰2的体外抗氧化活性最强。峰2经Sephadex G-100凝胶层析分离纯化得到3个洗脱峰(峰2-1～2-3),峰2-1的体外抗氧化活性最强。利用SDS-PAGE对峰2-1进行鉴定,得到单一蛋白条带,纯度较高,蛋白分子质量为82.47kD。体外抗氧化活性比较,峰2-1远远强于水溶性粗蛋白。结论:蛋白组分峰2-1体外抗氧化活性最强,为单一蛋白组分,其分子质量为82.47kD。     

文蛤多肽组分的分离及其抗氧化活性研究

采用两种蛋白酶水解文蛤,用Sephadex G-50凝胶层析分离文蛤水解液,SDS-PAGE 凝胶电泳系统分析水解液多肽的分子质量范围,并对水解液和分离后的多肽组分进行抗氧化活性研究。结果表明,水解液中主要包括两种组分,组分Ⅰ和组分Ⅱ,其分子质量主要分布在66ku和13ku左右。组分Ⅱ对氧自由基和羟自由基有较高的清除率,分别达56.36%和74.60%。     

无花果内生菌WHG1及其胞外蛋白的分离鉴定和抗菌作用的研究

对无花果内生菌WHG1及其胞外蛋白进行分离鉴定,并探讨其抗菌作用。通过形态和生理生化特性及16sRNA序列分析方法鉴定菌株。采用滤纸片和牛津杯法抑菌实验研究其抗菌作用。用80%硫酸铵盐析,Sephadex G-100凝胶层析,DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离纯化内生菌的胞外抗菌蛋白,通过SDS-PAGE电泳测定其分子质量。WHG1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),它对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、酵母菌、黑曲霉等5种食源性致病菌和食品中常见污染菌均有较强的拮抗作用。WHG1胞外蛋白对大肠埃希氏菌和黑曲霉有较强的抗菌作用,该抗菌蛋白分子质量25～53ku。无花果内生菌WHG1具有产胞外抗菌蛋白的特性。     

层析法分离纯化纳豆激酶的技术参数研究

采用柱层析技术对盐析后的纳豆激酶发酵液进行分离纯化,以确定层析分离纳豆激酶的技术参数.对比了Sephadex G-50及Sephadex G-7凝胶层析分离纳豆激酶的效果,并进行了不同pH值条件下的层析效果分析.结果表明,在pH值为6.4时,经Sephadex G-75凝胶层析及SP Sepharose FF离子交换层析后,能够得到较高纯度的纳豆激酶,使纳豆激酶纯化了9.2倍,回收率为51.5％.SDS-PAGE电泳显示所得纳豆激酶为单一蛋白带,其分子质量为28ku.     

嗜热链球菌CH9胞外多糖的分离纯化及结构分析

对嗜热链球菌CH9胞外多糖进行分离纯化,经DEAE-52离子交换柱及Sephadex G-100凝胶柱得到单一组分,利用高效液相色谱(HPLC)测其分子质量,结果表明:EPS1a为中性多糖,分子质量为1.8×106u;EPS2a、EPS3a为酸性多糖,分子质量分别为1.06×106、1.05×106u。经琼脂糖凝胶电泳及Sephadex G-100凝胶柱鉴定3种糖均为单一组分。紫外及红外光谱扫描结果显示:3种糖均具有多糖的特征吸收峰,且EPS2a、EPS3a可能为糖与蛋白的复合物。刚果红实验表明:EPS1a具有三股螺旋结构,而其他两种糖并未发现此现象。β消去实验证明:EPS1a、EPS3a为—O—连接,EPS2a为—N—连接。     

猪骨免疫活性肽的分离纯化

为了从猪骨中分离纯化出免疫活性肽,使用超滤、sephadex G-25凝胶层析、SP-sephadex C-25离子交换层析等手段对鲜猪骨的Alcalase碱性蛋白酶的酶解液进行分离纯化,采用MTT法测定各分离产物对小鼠脾淋巴细胞的增殖活性。结果显示:猪骨酶解液经超滤分离获得的分子质量小于2 ku的组分对小鼠脾淋巴细胞增殖率最高;对分子质量小于2 ku的组分采用凝胶过滤层析,对层析后活性最高的组分再进行离子交换层析,最终得到的组分质量浓度为100μg/m L时,对小鼠脾淋巴细胞的增殖率为114.30%。     

天麻和苦荞复配液对灰树花胞外多糖合成的影响及其发酵动力学研究

通过向灰树花发酵体系中单一添加天麻醇提物、苦荞醇提物及两种提取物的复配液,研究其对灰树花菌体生长和胞外多糖合成的影响,同时对添加复配液后发酵体系中的残糖(还原糖)含量、pH值的动态变化进行研究。结果表明:当复配液中天麻醇提物添加量为7 g/L、苦荞醇提物添加量为5 g/L时效果较佳,相比空白组(未添加提取物)和单一添加组(天麻、苦荞),胞外多糖产量分别增加了49.08%、13.76%、33.88%,菌丝体生物量分别增加了51.10%、11.35%、26.69%,均显著地高于空白组(P<0.01)和单一添加组(P<0.05)。发酵动力学研究表明,灰树花菌体生长和胞外多糖产量在第7天达到峰值,复配组相对于空白组能消耗更多的碳源物质促进胞外多糖的合成。因此,天麻和苦荞中的有效成分能够显著促进灰树花菌体生长与胞外多糖的合成。     

不同乳酸菌发酵杜仲叶水提液的香气成分分析

利用电子鼻辅助同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱（Simultaneous distillation-extraction-gas chromatography-mass, SDE-GC-MS）联用技术研究不同乳酸菌（植物乳杆菌、德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌）发酵杜仲叶水提液的主要香气成分差异性。SDE-GC-MS分析结果表明,未发酵液的挥发性成分共鉴定出31种,以醛类相对含量最高（14.3591%）;植物乳杆菌、德式乳杆菌、嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌发酵后鉴定出的挥发性成分依次为45、38、51和43种,分别以酮类（18.8255%）、杂环类（25.7828%）、醇类（18.3376%）和醇类（14.1481%）相对含量最高。通过电子鼻分析,PCA和LoA主成分贡献率均大于95%,说明传感器识别效应和样品间的风味区分度较好。同时,ROAV分析结果显示,乳酸菌发酵增加了杜仲叶提取液关键香气成分含量,降低原本杜仲叶的青叶味。经乳酸菌发酵后的杜仲叶提取液,不仅挥发性成分数量较多,且关键香气成分含量增加显著,更有利于杜仲叶提取液香气提升。研究结果为杜仲叶产品后期研发提供了参考依据。     

不同产地杜仲叶的水提取物体外抗氧化活性

研究陕西、四川和新疆产杜仲叶水提取物的DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性、抗脂质过氧化活性、金属离子络合力和还原力、杜仲叶萃取物中的总酚含量,以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、VE和VC为阳性对照。结果表明：四川和陕西产杜仲叶水提取物自由基清除力、羟自由基清除力、金属离子络合力和还原力以及总酚含量均高于新疆产杜仲叶,但是抗脂质过氧化活性略低于后者。陕西与四川产杜仲叶水提取物体外抗氧化活性样品特点相似,活性相近,新疆产杜仲叶与前两者特点不同。     

大孔吸附树脂对杜仲叶黄酮的富集纯化

应用大孔吸附树脂对杜仲叶超临界法提取液中的黄酮类物质进行富集和纯化,得到树脂富集杜仲叶黄酮的最优工艺条件。对4 种大孔吸附树脂NKA-2、X-5、D101、AB-8 的吸附和解吸能力进行比较的结果表明：AB-8 树脂的吸附率和解吸率都最高,最佳吸附洗脱工艺为上样液黄酮质量浓度193.92mg/mL、pH2、吸附流速2.6mL/min、洗脱流速1.6mL/min、解吸剂80%乙醇用量30mL。所得洗脱液中黄酮质量分数从纯化前的10.2%可增加到纯化后的42.6% 以上。     

超声波辅助提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙工艺优化

目的：研究超声波辅助提取杜仲翅果中桃叶珊瑚甙的较佳工艺条件,为杜仲翅果资源的综合开发利用提供参考。方法：在单因素试验的基础上,通过Box-Behnken试验设计确定乙醇体积分数、超声波功率、提取时间及液料比等因素的最佳工艺条件。结果：超声波辅助提取杜仲翅果中桃叶珊瑚甙的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数72.1%、超声波功率300W,提取时间20.5min、液料比12.3:1(mL/g),在该条件下杜仲翅果桃叶珊瑚甙的实际提取率为5.91%。在试验范围内各因素对桃叶珊瑚甙得率影响大小依次为乙醇体积分数＞料液比＞提取时间。结论：超声波辅助提取法能够较好地提取杜仲翅果桃叶珊瑚甙。     

杜仲叶、大蒜复合饮料的研制

以杜仲叶、大蒜为主要原料,添加适量的其它辅料,经过筛选配方和优化工艺,研制了杜仲叶大蒜复合饮料,并对其进行质量评价。结果表明:杜仲叶提取液、大蒜汁、白砂糖、柠檬酸的用量等因素对杜仲叶大蒜复合饮料的质量有较大影响。当以10%杜仲叶提取液、8%大蒜汁、15%白砂糖,0.25%柠檬酸为材料,可制得口感优良、风味独特、质量稳定、具有保健功能的杜仲叶大蒜复合饮料。     

纤维素酶辅助水解杜仲叶醋的发酵条件

杜仲叶含有多种生理活性成分。研究了纤维素酶辅助水解杜仲叶醋的主要发酵条件。结果表明,杜仲叶粉加水得到杜仲叶浆(1:5料液比),再添加0.8%的纤维素酶在45℃下振荡酶解4h后,得到的杜仲叶浆中总可溶性糖含量最高可达36.93g/L;对水解后的杜仲叶浆进行补糖(204g/L)、接种酵母菌进行酒精发酵,可得到酒精含量为10%～11%(V/V)的杜仲叶浆;再用蒸馏水调整杜仲叶浆中的酒精含量至4%(V/V),然后接种醋酸菌进行醋酸发酵,最后得到总酸(以乙酸计)为40～45g/L、酒精≤0.5%的杜仲叶醋。感官评价结果表杜仲叶醋中加入0.05%柠檬酸,0.015%苹果酸,4.5%葡萄糖配成的杜仲醋饮品风味更好。     

杜仲叶不同萃取物抗氧化活性比较分析

为研究杜仲叶抗氧化成分,深入开发杜仲叶资源,测定杜仲叶水提取物及其氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物和萃余相的DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性、抗氧化活性、金属离子络合力和还原力,并与抗氧化剂BHT、VE以及VC的抗氧化活性比较;同时测定杜仲叶萃取物中的总酚含量。结果发现：乙酸乙酯相和正丁醇萃取物总酚含量远大于水提取物,含量依次为465.1mg/g和286.4mg/g。二者在亚油酸乳浊液中抗氧化活性高于VE,接近BHT;DPPH自由基清除活性接近VC,显著高于BHT;正丁醇萃取物对羟自由基清除活性接近VE;乙酸乙酯萃取物对三价铁离子还原力高于BHT和VC;但是所有样品对二价铁离子络合力均较低。此结果表明乙酸乙酯和正丁醇可以富集杜仲叶抗氧化成分,杜仲叶提取物具有发展为抗氧化剂的潜力。     

应用纳米细化和复合生物酶解技术开发杜仲全叶系列产品

以杜仲叶为原料,利用纳米细化和复合生物酶解技术开发杜仲全叶系列产品,将杜仲叶中的粗纤维加工成细小的微晶纤维素,解决了食用时渣状口感,同时这些细小的微晶纤维素具有很强的吸附作用,能充分吸附杜仲叶中的活性成分并保护其不被破坏,全面利用杜仲全叶有效成分。处理后的杜仲叶通过配料、杀菌、灌装、造粒干燥和压片等技术处理,进一步加工成杜仲全叶汁、杜仲全叶冲剂和杜仲全叶咀嚼片等系列产品,符合天然、健康、营养的食品发展趋势,为杜仲叶的有效利用提供了一条新途径。