时间分辨荧光免疫分析法测定人胰岛素生物学活性

目的:利用时间分辨荧光免疫分析系统建立人胰岛素基于转基因细胞的生物学活性检测方法。方法:以CHO-INSRB1284转基因细胞2.5×10~5个·mL^-1作为靶细胞,以400 pmol·mL^-1作为初始浓度对人胰岛素进行3倍系列稀释,随后药物与靶细胞作用20 min,通过时间分辨荧光免疫分析系统,进行生物学活性检测,对该方法进行关键参数的优化,并依据2020年版《中华人民共和国药典》四部通则9401和ICH指导原则Q2(R1)、Q6B进行验证。结果:人胰岛素在本方法中存在良好的量效关系,符合四参数方程：y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D。本方法专属性强,5个效价水平(64%、80%、100%、125%及156%)的相对生物学活性(n=8)的几何平均值分别为(55.8±2.06)%、(82.1±5.52)%、(94.4±5.46)%、(121.4±5.94)%、(154.4±8.37)%,相对偏倚及其90%置信区间分别为-12.8%(-16.3%,-9.9%)、2.6%(-4.4%,9.5%)、-5.6%(-11.2%,-0.3%)、-2...     

人源化抗叶酸受体抗体的抗原结合活性测定

目的:采用直接ELISA法检测人源化抗叶酸受体抗体的抗原结合活性。方法:以固定量的重组人叶酸受体a做包被抗原,辣根过氧化酶标记的抗人IgG(H+L)为二抗,直接测定不同浓度参比品和供试品与抗原的结合活性,通过数据处理软件对结果绘图,根据供试品及参比品EC50值计算供试品的相对结合力。结果:同一批次的3支供试品分别经3次测定,相对结合活性分别为参比品的(80.61±12.19)%,(88.82±12.70)%,(103.57±6.07)%,平均值(91.0±13.72)%。3次试验的RSD分别为15.12%,14.30%,5.86%。结论:直接ELISA法精密性良好,结果客观,影响因素少,可用于人源化叶酸受体抗体抗原结合活性的常规检测。     

抗白介素-13单克隆抗体生物学活性测定方法的建立

目的:建立抗白介素-13单克隆抗体(抗IL-13单抗)的生物学活性检测方法。方法:利用L-BEAS-2B细胞系,通过荧光素酶检测系统进行抗IL-13单抗的生物学活性检测,通过抗IL-13单抗参比品与样品对比以平行线分析的方法计算样品相对百分效价,并对该方法的精密性和准确性进行验证。结果:抗IL-13单抗在该方法中存在量效关系,在半对数坐标纸上呈平行的直线分布。6批抗IL-13单抗样品经3次测定,相对百分效价平均值在(91.10±1.10)%~(105.27±7.17)%之间,RSD均小于12%;1批样品经9次测定平均相对百分效价为(110.77±7.01)%,板间和日间RSD均小于7%;2批回收率样品经3次测定,回收率分别为(96.17±8.50)%和(91.53±15.46)%。结论:研究建立的抗IL-13单抗生物学活性检测方法准确性高,精密度及重复性好,可作为抗IL-13单抗生物学活性的常规检测方法。     

利用Nb2-11细胞建立PEG化重组人生长激素生物学活性测定方法

本研究利用Nb2-11细胞,通过实验条件参数优化和方法学验证,成功建立了测定聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)体外生物学活性分析方法,并用该方法开展了PEG-rhGH注射液相对效价检测。研究表明, PEGrhGH与Nb2-11细胞增殖存在量效关系且符合四参数模型,用该方法检测PEG-rhGH的生物学活性准确度高、精密度好。以PEG-rhGH参比品为对照,对6批PEG-rhGH注射液进行相对效价测定,所得曲线线性、回归性和平行性均通过统计学检验,相对效价在95%～105%。本研究建立的PEG-rhGH生物学活性检测方法,可用于PEG-rhGH产品的质量控制。     

斜率比法测定水蛭抗凝血活性的方法学验证研究

目的:进行斜率比法测定水蛭抗凝血活性的实验室内方法学验证研究。考察斜率比法测定水蛭抗凝血活性作为质量控制方法的可行性。方法:选用7批蚂蝗和日本医蛭饮片，分别用蚂蝗对照药材和菲牛蛭对照药材，平行制备不同浓度浸提液，测定活化的部分凝血活酶时间(APTT)后用斜率比法测定抗凝血活性。在实验室内进行专属性、线性与范围、精密度、准确度、耐用性等多个方面的系统考察。结果:使用斜率比法测定水蛭抗凝血活性，专属性考察：该条件下土鳖虫不显示其抗凝血活性，水蛭浸提液100℃加热后活性降低，添加低分子肝素后试验不成立，用蚂蝗对照药材做对照测定日本医蛭抗凝血活性则试验不成立，说明本法的专属性和选择性较好。准确度考察：采用蚂蝗对照药材和菲牛蛭对照药材，64%、80%、100%、125%和156%的5个相对水平值测定值的相对偏差均<±20%,效价理论值对数(横坐标)和对应的效价测定值对数(纵坐标)呈现明显的直线关系，相关系数>0.95,斜率在0.95～1.05,说明方法的准确度较好。精密度考察：各相对效价水平的几何变异系数(GCV,%)均<20%;采用多批次的饮片测定RSD均<20%,说明...     

冬凌草甲素在不同种属血浆中蛋白结合率的HPLC法测定

目的:建立冬凌草甲素在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白中蛋白结合率的测定方法,并计算不同种属血浆蛋白的相关参数。方法:采用HPLC法测定血浆中药物总浓度及游离药物浓度,应用平衡透析法测定蛋白结合率。结果:大鼠血浆中冬凌草甲素高、中、低3个浓度的血浆蛋白结合率分别为(69.66±12.8)%,(59.62±12.6)%,(57.94±4.1)%;人血浆中冬凌草甲素高、中、低3个浓度的血浆蛋白结合率分别为(78.15±3.6)%,(77.92±8.8)%,(76.72±7.3)%;牛血清白蛋白中冬凌草甲素高、中、低3个浓度的血浆蛋白结合率分别为(35.58±7.2)%,(34.59±10.8)%,(32.03±6.0)%。结论:在体外冬凌草甲素与大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白属中等结合型药物,且蛋白结合率随着药物血浆浓度的增加无明显的浓度依赖性。     

抗白介素-13单克隆抗体生物学活性测定方法的建立

目的：建立抗白介素-13单克隆抗体(抗IL-13单抗)的生物学活性检测方法。方法：利用 L-BEAS-2B细胞系，通过荧光素酶检测系统进行抗IL-13单抗的生物学活性检测，通过抗IL-13单抗参比品与样品对比以平行线分析的方法计算样品相对百分效价，并对该方法的精密性和准确性进行验证。 结果：抗IL-13单抗在该方法中存在量效关系，在半对数坐标纸上呈平行的直线分布。6批抗IL-13单抗样品经3次测定，相对百分效价平均值在(91.10±1.10)%~(105.27±7.17)%之间，RSD均小于12%； 1批样品经9次测定平均相对百分效价为(110.77±7.01)%，板间和日间RSD均小于7%；2批回收率样品经3次测定，回收率分别为(96.17±8.50)%和(91.53±15.46)%。结论：研究建立的抗IL-13单抗生物学活性检测方法准确性高，精密度及重复性好，可作为抗IL-13单抗生物学活性的常规检测方法。     

基于报告基因的抗CD20单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立

利用Jurkat/NFAT-luc+FcγRIIIa转基因细胞系作为效应细胞,WIL2-S细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(Bio GloTM Luciferase Assay System)进行抗CD20单抗的ADCC生物学活性检测,并对实验条件进行优化及方法学验证。结果显示抗CD20单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D。方法经优化确定靶细胞为WIL2-S细胞,抗体稀释浓度为18 000 ng·m L-1,1∶5倍的稀释倍数,效靶比为6∶1,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性,8次独立实验的回归分析、线性及平行性均通过统计学检验;4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(44.39±3.93)%、(72.74±2.78)%、(128.28±7.01)%和(168.19±2.70)%,变异系数均小于10%,对应回收率分别为(88.78±7.85)%、(96.99±3.70)%、(102.63±5.61)%和(112.12±1.80)%。本研究利用转基因细胞法成功建立抗CD20单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗CD20单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。     

比浊法在线自动测定阿奇霉素制剂的效价

目的:建立比浊法测定阿奇霉素制剂的效价。方法:肺炎克雷伯菌为实验菌,加菌量1.5%～2.5%,(37±0.5)℃培养3.5～4.5 h 测定。结果:抗生素线性浓度为0.96～2.34 u·mL~(-1),高、中、低3种浓度的平均回收率分别为101.6%,99.4%与101.7%;RSD 分别为3.3%,1.4%,2.3%(n=3)。结论:本方法方便、快速、灵敏,可信限率低,结果准确,精密度好,可作为阿奇霉素原料及其制剂效价的测定方法。     

人促红素注射液生物学活性体外法的ELISA验证

本研究用双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)检测人促红素注射液(Human erythropoietin injection, EPO)中EPO效价，并对其进行方法学验证。研究从准确度、重复性、中间精密度、线性、耐用性等各方面，对ELISA检测EPO建立的体外生物活性测试方法进行方法学验证。在准确度验证中，不同浓度供试品测定的回收率在87.20%～118.40%之间，同一浓度的6份样品的加标回收率为93.5%～107.2%之间；将5个不同浓度的供试品分别为2.5,5,20,50,100 mIU/mL进行3次重复性试验，结果RSD均<20%;在中间精密度验证过程中，在不同时间由不同人员各操作测定，检测结果的RSD=0.019%,<20%,人员和时间对结果均无统计学意义影响(P>0.05,F=0.043);线性验证实验结果表明，人促红素国家标准品和EPO成品重复3次的R²分别为0.987 2,0.996 8,0.989 3,0.997 8,0.998 8,0.985 6,均>0.98;在试验加入终止液后，不同长度时间间隔内的生物学活性测定结...     

妥布霉素微生物效价测定方法及验证

目的：用微生物效价测定方法测定妥布霉素的效价并对方法进行验证。方法：参照《欧洲药典》，用微生物管碟法测定妥布霉素的效价。结果：妥布霉供试品及标准品的浓度（Ig浓度）与抑菌圈区域直径呈线性关系，供试品的精密度测定结果令人满意。结论：用微生物效价测定方法测定妥布霉素的效价具有较高的准确性和重现性。     

5种TNFα单抗及其类似物的TNFα杀伤抑制活性的比较

目的:比较5种以TNFα为治疗靶位的治疗性单抗及其类似物的TNFα杀伤抑制活性。方法:以Anti-TNFαrhmMcAb为参比品,采用TNFα杀伤抑制法测定其他4种制品的TNFα杀伤抑制活性,剂量-反应曲线进行四参数拟合后,测定抑制1.0 ng·mL-1TNFα杀伤的半数有效浓度(EC50)。以Anti-TNFαrhmMcAb的EC50值除以待测样品EC50值计算样品的相对活性。结果:相对于Anti-TNFαrhmMcAb,TNFαⅡR-Fc、Anti-TNFαrhuMcAb、Anti-TNFαsrhmMcAb和Anti-TNFαarhuM-cAb的TNFα杀伤抑制活性分别为4860%,248%,505%,90%。结论:TNFα杀伤抑制方法可以快速测定治疗性抗TNFα单抗及其类似物的TNFα杀伤抑制活性,不同制品的测定结果之间具有一定可比性,可以根据测定结果对不同制品的生物学活性进行评价和比较。     

重组人淋巴毒素α衍生物活性测定国家标准品的研制

目的:建立重组人淋巴毒素α衍生物(rhLT α)生物学活性测定用国家标准品.方法:标准品按WHO重组细胞因子要求制备、检测,采用L929细胞毒法测定rhLT α的生物学活性,并以NBSB提供的国际标准品为标准,由2家实验室对rhITα国家标准品的效价进行协作标定.结果:rhLT α国家标准品经检定各项指标均符合要求,效价协作标定结果经统计学分析,均数的95%可信区间为4.21×104～4.52×104IU/支,单次测定的95%标准值范围为3.07×104～6.19×104IU/支.这批国家标准品效价确定为4.40×104IU/支.加速热稳定性实验表明活性在-20℃,4℃,25℃条件下20个月保持稳定.结论:该批rhLTα经协作标定,质量可靠,效价稳定,可作国家标准品使用.     

肝水解肽体外活性测定方法的探讨研究

目的:建立肝水解肽体外生物学活性测定方法。方法:将不同浓度肝水解肽作用于正常人肝L02细胞,WST-8比色法测定L02细胞增殖情况。同时对实验条件,包括稀释液、细胞接种密度、药物作用时间等进行探讨,建立肝水解肽体外活性测定方法,并用该方法对2个厂家生产的2批产品进行活性检测。结果:获得了比较稳定可靠的实验参数:稀释液为RPMI-1640培养液,细胞接种密度为4.0×104个.mL-1,药物作用时间为48～72 h,肝水解肽浓度为0.5,0.25,0.12,0.06,0.03,0.015 mg.mL-1。由这些实验参数建立了肝水解肽活性测定方法。用该方法检测的2批产品活性均合格,重复实验3次,每次实验结果均一致,RSD均低于10%。结论:该方法可用于肝水解肽体外生物学活性测定。     

基于生物活性测定的注射用丹参多酚酸质量控制方法研究

目的 以注射用丹参多酚酸（SAFI）体外抗血小板聚集活性为基础,建立该制剂的生物活性测定方法,并对30批样品进行测定,从而探索一种反映其有效性的新质控方法。方法 以家兔全血为试验系,一定浓度的SAFI与富血小板血浆混合后,采用光学比浊法检测二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集率,通过与丹酚酸B对照品的测定结果进行比较,运用斜率比例法计算相对效价,并进行方法学考察验证。结果 方法学验证结果表明,建立的体外抗血小板聚集生物活性测定法符合要求;30批次样品的相对效价均值为0.366 1,RSD为9.43%。结论 SAFI具有较强的抗血小板聚集活性,所建方法适用于SAFI体外抗血小板聚集活性测定,对于补充调整SAFI的全面质量控制具有重要意义。     

平衡透析法测定人体外血浆中原花青素B2、表儿茶素蛋白结合率

目的 建立检测原花青素B2、表儿茶素在血浆中药物浓度的方法,并测定其体外血浆蛋白结合率.方法 采用平衡透析法测定血浆蛋白结合率,建立HPLC法测定各成分的血药浓度及游离药物浓度,生物样本用乙酸乙酯溶液提取的方法.结果 在低、中、高3种浓度下,原花青素B2和表儿茶素在人体外血浆中的蛋白结合率分别为(44.21±2.80)%,(52.60±1.92)%,(48.11±3.09)%和(47.12±2.85)%,(55.03±2.47)%,(43.69±1.53)%.结论 采用HPLC法对原花青素B2、表儿茶素进行分离,方法简便、可靠、稳定.体外实验中原花青素B2和表儿茶素与人血浆属中等结合型药物,且蛋白结合率随着药物浓度的增加无明显的浓度依赖性.     

AlphaLISA方法测定抗白介素-17受体单抗生物学活性

目的：利用AlphaLISA方法建立抗白介素-17受体单抗的生物学活性测定方法。方法：以人包皮成纤维细胞系作为靶细胞,通过AlphaLISA检测系统建立抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法,根据四参数拟合分析计算抗IL-17R单抗的相对效价,并对该方法进行了验证。结果：抗IL-17R单抗在该方法中存在量效关系,并且符合四参数方程：y=（A-D）/[1+（x/C）^B]+D。6批抗IL-17R单抗经3次测定,相对效价平均值在（84.93±3.12）%~（107.51±1.66）%,相对标准偏差小于5%。2批回收率样品经3次测定,回收率分别为（100.66±13.65）%和（115.69±3.85）%。结论：本研究利用AlphaLISA方法在国内首次成功建立重复性好、准确性高的抗IL-17R单抗的生物学活性测定方法。     

数理统计在胰岛素类似物生物活性测定中的应用

创新实验大学生利用数理统计学的相关知识,按照《中国药典》2010年版附录Ⅻ中的要求,测定胰岛素类似物的生物活性。通过交叉设计的方差分析及假设检验,评判胰岛素标准品与胰岛素类似物供试品引起小鼠血糖下降的作用,对实验中同批小鼠的给药时间间隔、胰岛素类似物母液储备时间进行探索,并计算胰岛素类似物的效价。创新实验大学生通过此次胰岛素类似物生物活性测定实验增强实验技能,合理利用数理统计解决了实际问题,并培养了严谨求实的科学态度。     

胰高血糖素样肽-1及其类似物的生物学活性测定方法

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)因其独特的生理功能成为治疗2型糖尿病最有潜力的药物之一,有很好的开发前景。本文对GLP-1及其类似物的生物学活性,如稳定性、免疫学活性、体外和体内生物学活性的测定方法进行了综述,为GLP-1及其类似物的应用开发研究提供参考。     

单抗工作参考品的活性赋值研究

利用一级参考品对工作参考品的多次标定,对工作参考品进行生物学活性的赋值。本文先理论计算应标定次数,若工作参考品多次标定的均值位于预设相对效价水平内时,则定义工作参考品的效价为100%。结果显示:在活性方法的总中间精密度为11.66%、预设效价水平为95%105%、置信水平为95%时,应进行至少21次标定。实际22次标定的均值为101.96%,故定义工作参考品与一级参考品效价一致即100%。结果提示采用先计算应标定次数后进行标定的方式,通过判断均值是否位于预设效价水平对工作参考品进行活性赋值,该策略对于生物制药企业具有一定的参考意义。