基于核酸适配体的比色传感策略用于牛奶中沙门氏菌的快速检测

以鼠伤寒沙门氏菌作为研究模式菌,开发一种基于核酸适配体的可用于食品安全检测的可视化生物传感器。当待测分析物中有鼠伤寒沙门氏菌时,适配体与鼠伤寒沙门氏菌发生特异性结合,释放出的捕获探针吸附在纳米金表面避免其在后续盐诱导作用下发生聚集;当待测分析物中不含鼠伤寒沙门氏菌时,纳米金粒子在盐的诱导下发生团聚,通过裸眼观察溶液的颜色变化来实现对沙门氏菌的快速、便捷检测。对该方法的可行性、检测性能以及特异性进行表征,结果表明该适配体传感器对浓度为10～109 CFU/mL范围内的鼠伤寒沙门氏菌有良好的响应性能,线性方程为y=－0.129 98x＋1.244 11（R2=0.992 62）,检出限可达124 CFU/mL,同时也具备良好检测特异性。该方法检测灵敏度高、操作简便、快速、且成本低,在食品安全的现场快速检测应用中具有良好应用前景。     

基于核酸适配体杂交链式反应比色法检测鼠伤寒沙门氏菌

该研究探讨了基于核酸适配体特异性识别机制和杂交链式反应（hybridization chain reaction,HCR）扩增策略,以金纳米粒子（gold nanoparticles,AuNPs）颜色变化为比色信号,设计了一种无标记、无酶、灵敏的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S. typhimurium）比色检测法。根据鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体设计引发链和两个发夹探针,核酸适配体捕获鼠伤寒沙门氏菌,触发引发链打开发夹探针,发生杂交链式反应,在实现目标菌信号放大同时,利用反应前发夹探针粘性末端以及反应后形成的杂交长链对金纳米粒子结合差异性,产生比色信号,实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。通过对杂交链式反应时间、发夹探针与金纳米粒子结合时间以及发夹探针浓度等实验参数进行优化,提高实验灵敏度。在最优实验条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度对数值与紫外吸光比值（A630/525）在103~107 CFU/mL范围内呈现良好的线性关系,检测限为6.3×101 CFU/mL,在牛奶样品中加标回收率为90.05%~109.97%。本比色法操作方便,无需要化学修饰以及复杂仪器且实验结果可视,为鼠伤寒沙门氏菌监测提供一种新的方法。     

基于适配体识别的金黄色葡萄球菌定性检测试纸条的研制及应用

本研究以金黄色葡萄球菌为检测靶标,以核酸适配体为识别分子,基于双适配体夹心和侧流层析原理,构建了定性检测金黄色葡萄球菌的适配体试纸条,并对NaCl浓度、适配体浓度、纳米金-适配体包被量及捕获探针包被量等实验条件进行优化,获得适配体试纸条最佳制备条件。在优化条件下对试纸条的灵敏度、特异性进行分析测试,最后将试纸条对116份食品进行金黄色葡萄球菌检测,并与国标法（GB 4789.10-2016）对比验证。结果显示,适配体试纸条最佳制备条件为NaCl浓度为80 mmol/L、适配体偶联浓度为1 μmol/L、结合垫上纳米金-适配体的稀释体积比为1:2、捕获探针浓度为25 μmol/L。在最佳条件下,适配体试纸条对金黄色葡萄球菌的可视化检测限为2×103 CFU/mL,检测时间为5 min,且与其他食源性致病菌如鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、痢疾志贺氏菌等无交叉反应,具有较高的特异性。将本方法应用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检测,检测结果与国标法完全一致。该方法简便快速、准确可靠、成本低,适用于食品样品中金黄色葡萄球菌的定性检测。     

pH响应比色酶联免疫吸附法检测牛奶中猪霍乱沙门氏菌

人类常常因误食被猪霍乱沙门氏菌感染的食物而引发中毒。因此,急需构建适用于快速、灵敏检测食物中猪霍乱沙门氏菌污染的新方法。鉴于此,本文构建了一种pH响应比色酶联免疫吸附法灵敏检测牛奶中猪霍乱沙门氏菌。该方法利用葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖产生葡萄糖酸,导致溶液pH下降,进而引发溴甲酚紫（Bromocresol purple,BCP）溶液颜色由紫色变成亮黄色,随后通过记录BCP颜色变化（OD₄₃₀/OD₅₉₀）实现目标菌的定量检测。当菌浓度为2.54×103~6.17×105 CFU/mL,该方法定量检测猪霍乱沙门氏菌可用方程一表述:y₁=0.1051ln （x）+0.7024（R2=0.7513）;当菌浓度为6.17×105~1.67×107 CFU/mL,该方法定量检测猪霍乱沙门氏菌可用方程二表述:y₂=1.3216ln （x）-15.797（R2=0.9711）;当菌浓度大于1.67×107 CFU/mL时,BCP溶液呈现明显亮黄色,OD₄₃₀/OD₅₉₀值趋于稳定,无法实现猪霍乱沙门氏菌定量检测。将六个不同浓度的猪霍乱沙门氏菌（2.5×103~5.6×106 CFU/mL）加标至牛奶中,检测结果显示回收率介于72.16%~103.58%,相对标准偏差介于7.54%~15.30%。总之,本研究所构建的比色ELISA方法适用于牛奶中不同浓度的猪霍乱沙门氏菌快速、灵敏定量检测。     

基于核酸适配体的纳米金比色法快速检测肠炎沙门氏菌

该文以肠炎沙门氏菌为研究对象,开发基于核酸适配体的纳米金可视化检测方法。通过优化体系内适配体浓度,研究纳米金-适配体体系的肠炎沙门氏菌检测限、特异性及适用温度;同时以人工污染样品为例,评价纳米金-适配体的加标回收率。结果显示：该方法可以特异性检测肠炎沙门氏菌,对其他食源性致病菌无特异反应。通过条件优化,在适配体浓度200 nmol/L 下,肠炎沙门氏菌的最低检测限为9.3×101 CFU/mL,其线性范围为103～107 CFU/mL,线性方程为y=0.187 8x-0.146（R2=0.991 3）。检测人工污染样品的加标回收率为93.68%～117.89%。利用核酸适配体纳米金比色法进行肠炎沙门氏菌的检测操作简便、结果可视;通过调整核酸适配体可进行其他致病菌的检测,具有良好的推广意义。     

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离（immunomagnetic separation,IMS）联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明：经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对104 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对104 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×103 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×104 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。     

基于适配体识别的侧向层析法快速检测单核细胞增生李斯特氏菌

构建了一种快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的适配体试纸条。以单核细胞增生李斯特氏菌核酸适配体为识别分子,纳米金为显色信号,基于双适配体夹心原理,制备了用于检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌的适配体试纸条,并对制备条件如适配体浓度、胶体金溶液pH值、纳米金-适配体复合物和链霉亲和素-纳米金复合物的包被量等进行了优化。结果显示,在优化条件下,该试纸条对单核细胞增生李斯特氏菌的裸眼可视检测限为10~3cfu/mL,且具有很高特异性。可实现样品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速定性检测。     

SPR生物传感器快速检测沙门氏菌研究初探

使用集成化手持式SpreetaTM SPR传感器快速检测沙门氏菌,利用亲和素-生物素系统保证检测的准确性;利用沙门氏菌抗体的免疫吸附反应,保证结果的特异性;并引入复合抗体作为第二抗体以扩大检测的响应信号,检测到鼠伤寒沙门氏菌的浓度为105cfu/mL,整个检测过程在1h内完成,从一定程度实现了食品中病原微生物的快速检测。     

胶体金免疫层析法联检食品中5 种典型沙门氏菌模型的建立和优化

采用胶体金标记抗沙门氏菌单克隆抗体,将沙门氏菌单克隆抗体和驴抗鼠抗体（二抗）喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制能联检5 种典型沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌）的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,该试纸条能达到同时检测5 种沙门氏菌的目的,其中甲型副伤寒沙门氏菌的检测灵敏度最高,为105 CFU/mL;鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌的检测灵敏度为106 CFU/mL。沙门氏菌加入量为10～100 CFU时,增菌16～20 h,该试纸条能够检测出牛奶、鸡蛋样本中的5 种沙门氏菌。本实验研制的试纸条能快速高效地联检食品中5 种典型的沙门氏菌,特异性高、灵敏度好,在对多种沙门氏菌进行联检方面有很重要的应用价值。     

碳纳米生物传感检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种基于碳纳米材料的适配体传感器快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法利用核酸适配体与其靶标之间的特异性结合能力以及碳纳米管的荧光猝灭特性,构建一种新型快速的金黄色葡萄球菌检测方法。结果该方法特异性良好,与非目标菌株无交叉反应。同时,该方法对金黄色葡萄球菌的检出限为10~5 CFU/mL,线性范围为10~5～10~9 CFU/mL,而且在此浓度范围之间呈现良好的线性关系,线性方程为Y=53.22X-39.99,线性相关系数r~2=0.992。结论该方法具有检测速度快、操作简便、检测成本低等特点,为金黄色葡萄球菌的快速检测提供了一种有效手段。     

基于荧光微球的免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速定量检测鼠伤寒沙门氏菌

为了建立一种能快速、灵敏、特异检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,ST)的方法,本研究以荧光微球(FM)为标记物建立了荧光微球免疫层析检测法(FM-ICA),将羧基化的磁性微球与抗体偶联制备了抗-ST免疫磁珠(IMB),并将FM-ICA与IMB联合用于富集和检测三种食品样本中的ST。在优化条件下,FM-ICA检测的线性范围为3.16×10~6~2×10~9 CFU/m L,回收率为80%~120%,变异系数均小于5%。当菌液浓度大于1×10~8 CFU/m L时,结果显示与同属沙门氏菌的交叉反应;而当菌液浓度小于或等于1×108CFU/m L时,常见的12株非目标菌检测结果为阴性,特异性较好。FM-ICA+IMB联合检测三种模拟食品时的回收率为38%~55%,其中,西红柿对回收率影响较小,鸡蛋和猪肉影响较大。然而,联合检测的灵敏度可达到1×10~5 CFU/m L,比单一FM-ICA方法提高了30倍,同时,整个检测过程可在2 h内完成。本检测方法的建立对于快速筛查鼠伤寒沙门氏菌具有重要意义。     

基于CRISPR-Cas13的单增李斯特菌RNA快速检测方法的建立

为实现食品中单增李斯特菌污染的快速检测,本研究构建了一种基于CRISPR-Cas系统和Broccoli适配体的RNA均相检测技术。利用Cas 13与cr RNA锚定序列结合形成识别元件cr RNA-Cas13复合物,靶标RNA存在时可激活Cas 13的非特异性RNase活性,并利用点亮型RNA适配体Broccoli作为信号探针,监测cr RNA此-Cas13的活化状态。荧光值的变化与单增李斯特菌浓度存在线性关系,利用来检测单增李斯特菌。本研究所构建的检测可在30min内完成对于单增李斯特菌的的识别与检测,检出限为148CFU/m L,对细菌具有良好的检测特异性,可区分大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌。在牛奶模型中单增李斯特菌的加标回收率为95.15%～97.99%。该方法具有较好的灵敏度、特异性,可直接靶向检测致病菌RNA,无需逆转录、PCR扩增和核酸标记,简化了实验流程,对于实现食品中单增李斯特菌的现场检测及生物安全控制具有重要意义。     

鲜切香瓜片上鼠伤寒沙门氏菌的控制方法

本文对化学( H2O2)、生物(蛭弧菌BDFM05)方法对香瓜片鼠伤寒沙门氏菌消除和控制效果进行了比较,并进行了感官评定,结果表明,与对照组相比,两种方法均能很好控制香瓜片鼠伤寒沙门氏菌的生长;且蛭弧菌控制方法优于化学方法;两种浓度蛭弧菌方法比较,则高浓度组优于低浓度组.通过蛭弧菌BDFM05和H2O2对比分析,前者能...     

适配体结合量子点技术同时检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7方法

目的：基于适配体结合量子点技术,建立一种同时针对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7两种食源性致病菌快速高效、灵敏的检测方法。方法：利用表面增强拉曼光谱技术筛选出与目标菌结合特异性较好的2?种适配体;利用免疫磁珠与适配体偶联技术特异性捕获2?种目标菌;选取不同发光原理的2?种量子点,并结合量子点荧光标记技术构建“磁珠＋目标菌＋量子点”的“三明治结构”,通过对结构条件优化确定2?种目标菌的检出限,并应用到市售无菌牛乳实际样品中进行加标回收率实验。结果：本研究证明所选取的2?条适配体与目标菌的结合具有高特异性,可实现对2?种目标菌的同时检测。对“三明治结构”优化结果表明：2?种目标菌的最佳捕获条件为免疫捕获时间45?min、磁分离时间2?min;适配体最适浓度为400?nmol/L;金黄色葡萄球菌检出限为101?CFU/mL,线性方程为Y=28.51X＋126.67（R2=0.973）;大肠埃希氏菌O157:H7检出限均为102?CFU/mL,线性方程为Y=92.86X－64.67（R2=0.987）,其中,Y为荧光强度,X为细菌菌落数的对数值,拟合度良好。且在牛乳样品中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7回收率分别为94.6%～102.8%和93.4%～100.4%。结论：本研究所建立的方法能够实现同时对2?种食源性致病菌快速、高效检测,该方法易操作且灵敏度高,在食品加工生产安全检测方面具有良好的应用前景。     

基于适配体拉曼光谱技术快速检测肠炎沙门氏菌方法

目的:应用SELEX技术筛选高亲和力、高特异性适配体,利用该适配体结合拉曼光谱技术建立肠炎沙门氏菌快速检测方法。方法:采用全细菌指数富集的配体系统进化技术(whole-bacteria systematic evolution of ligands by exponential enrichment,whole-bacteria-SELEX)筛选肠炎沙门氏菌特异性核酸适配体,并采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)与SERS技术对筛选出的适配体亲和力及特异性进行评价,建立肠炎沙门氏菌检测方法。结果:本研究通过对肠炎沙门氏菌进行十五轮SELEX筛选,并通过ELISA对其亲和力进行评价,筛选出Aptamer₄、Aptamer₁₀、Aptamer₁₂三条候选适配体,并通过SERS技术确认Aptamer₄为亲和力最佳适配体;将Aptamer₄与肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌等5种混合菌结合,结果表明,通过SERS技术可特异的检测出肠炎沙门氏菌,且该方法重复性较好,其最低检测限的细菌浓度为102 CFU/mL。且在猪肉样品的检测中,肠炎沙门氏菌的回收率为93.37%~100.18%。结论:应用SELEX方法成功筛选出与肠炎沙门氏菌高特异性、高亲和力适配体,并建立基于表面增强拉曼光谱技术快速检测肠炎沙门氏菌的方法,该方法特异性强、灵敏度高、成本低、快速简便,可应用于食品加工过程中肠炎沙门氏菌的快速检测。