胶体金免疫层析法联检食品中5 种典型沙门氏菌模型的建立和优化

采用胶体金标记抗沙门氏菌单克隆抗体,将沙门氏菌单克隆抗体和驴抗鼠抗体（二抗）喷涂于硝酸纤维膜上分别作为检测线和质控线,研制能联检5 种典型沙门氏菌（甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌）的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,该试纸条能达到同时检测5 种沙门氏菌的目的,其中甲型副伤寒沙门氏菌的检测灵敏度最高,为105 CFU/mL;鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和鸭沙门氏菌的检测灵敏度为106 CFU/mL。沙门氏菌加入量为10～100 CFU时,增菌16～20 h,该试纸条能够检测出牛奶、鸡蛋样本中的5 种沙门氏菌。本实验研制的试纸条能快速高效地联检食品中5 种典型的沙门氏菌,特异性高、灵敏度好,在对多种沙门氏菌进行联检方面有很重要的应用价值。     

1 株裂解性短尾沙门氏菌噬菌体T139的生物学特性及其对牛奶和牛肉的抑菌作用

采用双层平板的方法以鼠伤寒沙门氏菌（ATCC 13311）为宿主菌,从污水中分离得到1 株裂解性噬菌体,命名为T139,研究其生物学特性及其在牛奶和牛肉样品中的抑菌作用。结果表明：噬菌体T139的噬菌斑透亮清晰;能裂解宿主菌及其他沙门氏菌,为宽宿主谱;电镜观察噬菌体T139属于短尾噬菌体科,头部直径为（43±1）nm,尾部长（11±0.6）nm;最佳感染复数（multiplicity of infection,MOI）为0.001;最佳吸附速率为66%;一步生长曲线结果显示潜伏期为5?min,爆发期为60?min,平均裂解量为54.54?PFU/cell;在30～50?℃和pH?4～12条件下稳定且对体外培养的鼠伤寒沙门氏菌有良好的裂解效果。噬菌体T139对牛奶中鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果为：在4?℃无显著效果,在25?℃条件下MOI=10和MOI=100时抑菌效果极其显著,宿主菌数量分别下降4.32（lg（CFU/mL））和4.27（lg（CFU/mL））;噬菌体T139对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果为：在4?℃条件下,MOI=10时无显著效果,在MOI=100时宿主菌数量下降0.66（lg（CFU/mL））,在25?℃条件下MOI=10和MOI=100时宿主菌数量分别下降了0.77（lg（CFU/mL））和1.16（lg（CFU/mL））,表明噬菌体T139对牛奶和牛肉中鼠伤寒沙门氏菌有良好抑制作用。     

重大活动食品安全保障中沙门氏菌现场检测方法的建立

目的 针对重大活动食品安全保障工作对于现场检测的时间短和设备要求简单的要求以及供应食品的类型，建立经加热处理和未经加热处理食品的沙门氏菌的检测方法。方法 将重组酶聚合酶等温扩增（RPA）与侧向流免疫试纸（LFS）技术结合，建立RPA-LFS对切片水果样品进行检测，再加上叠氮溴化丙啶（PMA）处理，建立PMA-RPA-LFS对熟肉制品进行检测。并通过检测人工污染样品以及实际样品来进行验证。结果 RPA-LFS的纯菌检出限为2.0×101 CFU/mL ，新鲜水果基质检出限为2.0×101 CFU/g。对人工污染样品和实际样品的检测结果与GB 4789.4-2016方法的结果一致。PMA-RPA-LFS的PMA处理方法为0.1%脱氧胆酸钠(SD)37 ℃处理20 min，加入10 μg/mL浓度PMA室温避光孵育10 min，曝光15 min。PMA-RPA-LFS方法的纯菌检出限为2.0×102 CFU/mL，同时可抑制浓度为105 CFU/mL的死菌的扩增。对人工污染样品和实际样品的检测结果与GB 4789.4-2016方法的结果一致。结论 本研究建立的PMA-RPA-LFS能区分沙门氏菌死菌和活菌，适用于经加热处理的食品的检测。RPA-LFS与PMA-RPA-LFS结合使用，能更好地满足不同类型食品类别的检测需求，为重大活动食品安全保障工作中致病菌检测的研究积累数据。     

磁分离结合qPCR快速检测酱卤肉中的沙门氏菌

验证噬菌体磁分离结合实时荧光定量聚合酶链式反应,快速检测方法对食品中沙门氏菌的检测效果。以一株鼠伤寒沙门氏菌的特异性噬菌体T102为分子识别元件,首先将其与羧基化磁珠偶联,制备获得噬菌体磁性颗粒（Phage T102 Magnetic Beads）复合物,利用噬菌体磁性颗粒复合物从食品中特异性分离富集沙门氏菌,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测富集后的沙门氏菌。该沙门氏菌快检方法检出限为100 CFU/mL（0.1 CFU/PCR）,线性范围为1×102~1×109 CFU/mL,变异系数2.1%,特异性强,检测时间为6 h。实验选取300批食品安全抽检样品与GB 4789.4-2016标准《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行比对,均未检出阳性样品,结果一致。该方法可为噬菌体偶联纳米磁珠在食源性致病菌检测领域的应用提供参考依据。     

基于核酸适配体杂交链式反应比色法检测鼠伤寒沙门氏菌

该研究探讨了基于核酸适配体特异性识别机制和杂交链式反应（hybridization chain reaction,HCR）扩增策略,以金纳米粒子（gold nanoparticles,AuNPs）颜色变化为比色信号,设计了一种无标记、无酶、灵敏的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium,S. typhimurium）比色检测法。根据鼠伤寒沙门氏菌核酸适配体设计引发链和两个发夹探针,核酸适配体捕获鼠伤寒沙门氏菌,触发引发链打开发夹探针,发生杂交链式反应,在实现目标菌信号放大同时,利用反应前发夹探针粘性末端以及反应后形成的杂交长链对金纳米粒子结合差异性,产生比色信号,实现鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。通过对杂交链式反应时间、发夹探针与金纳米粒子结合时间以及发夹探针浓度等实验参数进行优化,提高实验灵敏度。在最优实验条件下,鼠伤寒沙门氏菌浓度对数值与紫外吸光比值（A630/525）在103~107 CFU/mL范围内呈现良好的线性关系,检测限为6.3×101 CFU/mL,在牛奶样品中加标回收率为90.05%~109.97%。本比色法操作方便,无需要化学修饰以及复杂仪器且实验结果可视,为鼠伤寒沙门氏菌监测提供一种新的方法。     

基于pH响应聚合物的比色法检测牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌

鼠伤寒沙门氏菌是常见的食源性致病菌,致病性强、分布广泛,造成的食品污染危害已成为世界性的公共安全卫生问题,因此,亟需建立更加高效、快捷、灵敏的检测方法。本文构建了一种基于pH响应聚合物的比色适配体传感器,用于检测食品中的鼠伤寒沙门氏菌。通过溶剂诱导法,使用酚酞、适配体、牛血清蛋白制备pH响应聚合物,该传感器采用双适配体夹心法检测鼠伤寒沙门氏菌,当检测体系中存在鼠伤寒沙门氏菌时,目标菌被捕获探针和pH响应聚合物识别,形成夹心复合物。在NaOH的作用下,酚酞迅速释放到溶液中,溶液颜色由无色变为红色,通过测量溶液的吸光度定量检测鼠伤寒沙门氏菌。结果表明,该传感器在102~107 CFU/mL浓度范围内,菌液浓度与吸光度呈现良好的线性响应,线性方程为y=0.1006ln(x)-0.4887(R2=0.982),检测限可达52 CFU/mL,该方法操作简便、结果可视化,相较于平板计数法,检测时间大大缩短,为构建食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速检测提供了一种新思路。     

氨基化磁珠非靶向富集食源性致病菌的条件筛选及优化

该研究基于氨基化磁珠静电富集细菌技术,建立了一种可同时富集鼠伤寒沙门氏菌,金黄色葡萄球菌,单增李斯特氏菌的方法。在每2 mL单菌液中（103 CFU/mL）分别加入5~200 μg的3种粒径的氨基化磁珠（1 μm、300 nm、100 nm）,当孵育5~90 min时检测各细菌的富集效率。将单菌液体系的富集正交试验结果应用至混和菌体系的单因素试验和正交试验,将最终结果应用至大体积实验体系以及实际样本（市售牛奶、水果沙拉）。结果表明,当氨基化磁珠添加量为50 μg、孵育时间为30 min时对3种病原菌可以达到60%以上的捕获率,所有反应均在pH值7.4的PBS中进行。磁珠粒径选择300 nm（p<0.05）。在实际样本牛奶、水果沙拉中,当三种混合菌的最低终浓度为2×102 CFU/g（mL）时,捕获率高于55%,结果可达到荧光定量PCR的检测低限。氨基化磁珠与免疫磁珠比较,其具有稳定保存、低成本,高效率等优势,其非靶向富集的能力为下游食源性致病菌的快速检测提供有效前处理富集手段。     

基于核酸适配体的纳米金比色法快速检测肠炎沙门氏菌

该文以肠炎沙门氏菌为研究对象，开发基于核酸适配体的纳米金可视化检测方法。通过优化体系内适配体浓度，研究纳米金-适配体体系的肠炎沙门氏菌检测限、特异性及适用温度；同时以人工污染样品为例，评价纳米金-适配体的加标回收率。结果显示：该方法可以特异性检测肠炎沙门氏菌，对其他食源性致病菌无特异反应。通过条件优化，在适配体浓度200 nmol/L 下，肠炎沙门氏菌的最低检测限为9.3×101 CFU/mL，其线性范围为103～107 CFU/mL，线性方程为y=0.187 8x-0.146（R2=0.991 3）。检测人工污染样品的加标回收率为93.68%～117.89%。利用核酸适配体纳米金比色法进行肠炎沙门氏菌的检测操作简便、结果可视；通过调整核酸适配体可进行其他致病菌的检测，具有良好的推广意义。     

实时荧光PCR检测食品中丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌

建立实时荧光PCR检测丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C/Salmonella paratyphi C)和猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuis/Salmonella Choleraesuis)的方法。根据GenBank公布的丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌序列,分别设计引物和Taqman探针,使用168株不同血清型的沙门氏菌和21株变形杆菌等非沙门氏菌进行实时荧光PCR检测的特异性试验,可以实现特异性检测丙型副伤寒沙门氏菌,并且可以同时检测丙型副伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌。经模拟污染样品检测,灵敏度可达到2～5 cfu/mL的添加浓度。该方法可以快速检测食品中丙型副伤寒沙门菌和猪霍乱沙门氏菌。     

短小芽孢杆菌与化学杀细菌剂协同防治烟草青枯病研究

为探究短小芽孢杆菌与化学杀菌剂联合防控烟草青枯病的可行性,分别采用改良抑菌圈法和平板菌落计数法测定7种杀菌剂和短小芽孢杆菌AR03对青枯雷尔氏菌的毒力及杀菌剂与AR03的生物相容性,同时采用Horsfall法确定杀菌剂和AR03的复配比例。室内毒力试验结果表明,7种杀菌剂和AR03对青枯雷尔氏菌的生长均有较好的抑制作用。7种杀菌剂的毒力大小依次为三氯异氰尿酸、氯尿·硫酸铜、噻菌铜、溴菌·壬菌铜、甲霜·福美双、噻唑锌和中生菌素,EC₅₀值介于101.02~212.70 mg/L之间。浓度为1.0×10⁵~1.0×10⁹ cfu/mL的AR03对青枯雷尔氏菌的抑菌率介于26.13%~73.54%之间,呈现浓度依赖性。生物相容性分析发现7种供试药剂与AR03的生物相容性差异较大,短小芽孢杆菌AR03与噻菌铜、噻唑锌、甲霜·福美双生物相容性较好,尤其是噻菌铜表现最好,测试浓度100 mg/L时,菌落数大于1×10⁷cfu/mL。综合杀菌剂对青枯病菌的毒力及其与AR03生物相容性,噻菌铜表现最优。噻菌铜（EC₅₀=175.21 mg/L）与AR03（EC₅₀=6.84×10⁶ cfu/mL）复配剂在体积比为5∶5时,对青枯雷尔氏菌的抑制效果显著,增效作用明显,增效比率值I_R值为1.482。室内盆栽试验结果表明,菌药复配剂的防效（68.77%）明显优于单剂噻菌铜和生防菌AR03的防效,且混配剂中噻菌铜使用量只有单剂的1/2,大幅降低了化学药剂的使用量。     

基于荧光微球的免疫层析法结合免疫磁珠分离技术快速定量检测鼠伤寒沙门氏菌

为了建立一种能快速、灵敏、特异检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,ST)的方法,本研究以荧光微球(FM)为标记物建立了荧光微球免疫层析检测法(FM-ICA),将羧基化的磁性微球与抗体偶联制备了抗-ST免疫磁珠(IMB),并将FM-ICA与IMB联合用于富集和检测三种食品样本中的ST。在优化条件下,FM-ICA检测的线性范围为3.16×10~6~2×10~9 CFU/m L,回收率为80%~120%,变异系数均小于5%。当菌液浓度大于1×10~8 CFU/m L时,结果显示与同属沙门氏菌的交叉反应;而当菌液浓度小于或等于1×108CFU/m L时,常见的12株非目标菌检测结果为阴性,特异性较好。FM-ICA+IMB联合检测三种模拟食品时的回收率为38%~55%,其中,西红柿对回收率影响较小,鸡蛋和猪肉影响较大。然而,联合检测的灵敏度可达到1×10~5 CFU/m L,比单一FM-ICA方法提高了30倍,同时,整个检测过程可在2 h内完成。本检测方法的建立对于快速筛查鼠伤寒沙门氏菌具有重要意义。     

基于纳米探针检测食源性肠炎沙门氏菌技术初探

目的建立纳米探针快速、准确检测食源性肠炎沙门氏菌的方法。方法利用二氧化硅磁纳米材料与肠炎沙门氏菌抗体制备纳米探针,将制备后的探针与经过荧光染色的肠炎沙门氏菌结合,并通过荧光显微镜和流式细胞仪对探针捕获的细菌进行检测,并比较2种方法的优劣。结果本方法设计合成了肠炎沙门氏菌纳米探针,通过荧光显微镜可以观察到复合纳米探针结合的5′106 CFU/mL和5′107 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌,在放大400倍的显微镜视野中成倍递增,该探针结合流式细胞术可以检测到5′105 CFU/mL浓度的肠炎沙门氏菌。结论纳米探针技术结合荧光显微镜、流式细胞术可以更加快速、准确、灵敏地用于食源性肠炎沙门氏菌的定性检测,并有望通过进一步实验实现食源性致病菌的定量检测。     

基于时间分辨纳米荧光微球的免疫层析技术快速检测副溶血性弧菌

由副溶血性弧菌引起的食品中毒事件频繁爆出,开发一种简单、快速且能大规模现场检测的方法对确保食品安全、避免经济损失具有重要意义。该研究成功开发了针对副溶血性弧菌现场快速检测的时间分辨荧光免疫层析技术（TRF-LFIA）。该方法将时间分辨纳米荧光微球（EuNPs）标记副溶血性弧菌单克隆抗体形成可以作为特异性免疫荧光探针的微球抗体偶联物,通过测定探针与目标致病菌结合后的荧光信号值来实现对目标致病菌的定量检测。该研究开发的TRF-LFIA方法对副溶血性弧菌检测的灵敏度为8.2×102 CFU/mL,视觉检测限为1.2×104 CFU/mL,线性范围为1.8×103~1.8×107 CFU/mL,回收率为84.25%~105.13%,变异系数（CV）为2.56%~9.14%,并且对其他7种主要食源性致病菌株检测未发生交叉反应。该研究所建立的TRF-LFIA检测方法具有灵敏度高,操作简单、快速,重复性、特异性好等优点,为针对副溶血性弧菌的现场快速检测提供了一种有力的检测工具。     

对GB 19301-2010《生乳》中蛋白质和菌落总数的指标验证和建议

目的完成"GB 19301-2010《生乳》跟踪评价项目"。方法 对陕西省7家乳企使用的原料生乳进行了7次采样,样本量为111份,其中夏季51份,冬季60份,采用GB 5009.5和GB 4789.2分别对样本中的蛋白质和菌落总数进行了测定。结果 所有样本的蛋白质含量都是合格的,冬季、夏季生乳蛋白质含量分别均不低于3.6 g/100 g、2.8 g/100 g,其中16%的夏季生羊乳蛋白质检测值为2.8 g/100 g,是"生乳蛋白质指标"的界限值。所有样本中,只有夏季4份样本的菌落总数超过了2.0×106CFU/m L的指标界限值,冬季、夏季生乳菌落总数平均值分别低于1.0×105CFU/m L、1.0×106CFU/m L。结论 GB 19301规定的生乳蛋白质、菌落总数指标值是科学合理的,建议将夏季生羊乳的蛋白质指标修订为≥2.6 g/100 g。     

牛奶中志贺氏菌PCR检测方法的建立

根据Genbank志贺氏菌侵袭性质粒抗原H (ipaH)基因序列, 自行设计引物, 扩增特异的326 bp核酸片段, 经过优化PCR扩增条件, 建立了志贺氏菌特异、敏感、快速的PCR检测方法, 并对牛奶中的志贺氏菌进行了检测.特异性试验结果表明, 志贺氏菌参考菌株均能扩增出特异的核酸片段, 大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明, 采用试剂盒提取基因组, 该方法的敏感性可达到1.75×102 cfu/mL.人工污染牛奶的模拟检测结果表明, PCR方法的检测限为1.75×103 cfu/mL.     

环介导等温扩增检测猪血中金黄色葡萄球菌

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,检测猪血中金黄色葡萄球菌.以金黄色葡萄球菌(CMCC10201)的femA基因作为靶序列,设计LAMP和PCR引物,通过凝胶电泳,判断检测结果.对8株常见致病菌进行LAMP特异性实验,表明对金黄色葡萄球菌的检测具有很高的特异性;LAMP检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为8.7CFU/mL,直接检测猪血中金黄色葡萄球菌的检出限为8.7×102CFU/mL,PCR法的检出限为8.7×103CFU/mL.本实验所建立的快速检测猪血中金黄色葡萄球菌的LAMP法具有较高的特异性和敏感性,能够满足快速检测的需要.     

川西高原发酵牦牛乳中降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选与耐受性研究

以川西高原发酵牦牛乳中分离出的195株乳酸菌为研究对象,采用比色法测定其亚硝酸盐降解能力,从中筛选出亚硝酸盐降解能力极强的菌株。将这些优势菌株分别在人工胃液、人工肠液、胆盐和高盐4个模拟人工胃肠道消化环境中进行培养,测其耐受力。结果表明:这195株乳酸菌亚硝酸盐降解率范围为35.79%~96.51%,其中降解率在80%~90%的菌株占54.87%,仅有1.54%的菌株亚硝酸盐降解率在50%以下,有3株亚硝酸盐降解能力极强的菌株(降解率大于95%)。这3株菌在人工胃液中的活菌数随培养时间的延长而减少,培养3 h后,菌株5、26、150在pH5.5时的活菌数分别为3.7、3.6、4.1×108 CFU/mL;在人工肠液中培养4 h后,菌株5、26、150的活菌数分别为4.3、6.8、5.3×108 CFU/mL;在不同胆盐梯度的培养基中培养24 h后,3株菌的活菌数随胆盐浓度增大而减少,且均保持在108 CFU/mL以上;在高盐环境中培养24 h后的活菌数随盐质量浓度的增加而降低,活菌数均在108 CFU/mL以上。结论:川西高原发酵牦牛乳中分离出的195株乳酸菌降解亚硝酸盐的能力存在较大差异,其中降解亚硝酸盐能力极强的菌株对体外模拟消化环境具有较好的耐受力,为其在医药,食品和生物领域的应用提供了理论依据。