抗克伦特罗单链抗体基因工程菌株发醇条件的研究

重组大肠杆菌BL21携带抗克伦特罗单链抗体(seFv)基因,研究了不同培养基、诱导时期、诱导时间、初始pH以及装液量对重组抗体表达量的影响,并对重组质粒稳定性进行研究.结果表明,在初始pH为7.2、装液量为25mL/250mL的LB培养基中,30℃培养菌体生长至A60onm为0.8时,42℃诱导表达6h,scFv表达量可达33.7%.工程菌在无选择压力条件下连续传代120代,保持稳定,100%的菌株携带重组质粒且经诱导后均有重组抗体的表达.     

原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

类人胶原蛋白表达的优化与纯化的研究

将pET22b-COL6A2重组质粒,转入表达宿主菌大肠杆菌中,通过摇瓶实验优化重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件。结果表明:50mL LB(Amp)培养基(pH7.0),接种量为5%,培养至OD值为0.7时,添加1mmol/LIPTG,诱导表达8h时原蛋白的表达量最高,为21.2%,并以Sepharose 6 Fast Flow对其进行纯化,得到纯度为90%以上的重组胶原蛋白。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的 优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件.方法 以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件.结果 最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6％,培养温度37℃,诱导表达时间5h.蛋白表达量比优化前提高近30％,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg·protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/ (mg·protein)为对照,重组酶的酶活性提高66％.结论 工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高.     

抗肿瘤19肽在大肠杆菌中的融合表达与纯化

将重组载体pet32a-19肽转化到表达宿主菌大肠杆菌中,对其进行摇瓶发酵实验来优化重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件。通过Ni Sepharose 6 Fast Flow对重组蛋白进行纯化,用梯度透析的方法进行复性。结果表明:筛选出了pET32a-19肽-BL21(DE3)高效表达菌株,在发酵条件为培养基的pH7.0、接种量3%、IPTG浓度0.1mmol/L、IPTG添加时间OD600为0.7、诱导温度41℃和诱导时间5h时蛋白表达量最高,为54.57mg/L,得到纯度为95%以上的融合抗肿瘤19肽,并成功复性出融合蛋白。     

抗伏马菌素B_1单链抗体的原核表达及其抗体活性和稳定性分析

研究了对抗伏马菌素B1单链抗体在不同原核表达条件下表达情况及其抗体稳定性,以促进其在免疫学分析中的应用。通过构建表达载体pET22b-1D11和pMAL-1D11,分析了诱导温度、诱导剂浓度、宿主菌和高溶解性标签蛋白对单链抗体表达形式的影响;采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)分析了单链抗体的热稳定性和有机溶剂耐受性。结果表明:条件优化后,单链抗体及其融合蛋白主要以包涵体形式表达;热处理会降低单链抗体活性甚至使其完全失活,甲醇会降低基于单链抗体的ELISA体系的灵敏度。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。     

抗克百威单链抗体的可溶性表达载体的构建及鉴定

为构建克百威(carbofuran,CBF)单链抗体(sc Fv)可溶性表达载体,实现其在大肠杆菌中的表达。以p CANTAB5E-sc Fv质粒为模板扩增CBF的重链(VH)及轻链(VL)片段,通过引物设计引入由15个氨基酸组成的连接肽(Gly4Ser)3,经重叠延伸拼接重链及轻链片段,并通过PCR扩增得到sc Fv基因,再与载体p LIP6/GN连接,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆质粒经PCR鉴定并测序。重组菌经0.6μmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)及低温诱导表达重组单链抗体,并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用ELISA法检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒p LIP6/GN-sc Fv含有插入片段,sc Fv与碱性磷酸酶(AP)相连得到重组蛋白的分子量接近78 ku,可被游离的CBF竞争性抑制,IC50值为26.80 ng/m L。这说明成功构建了重组质粒p LIP6/GN-sc Fv并实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达,为研究其在免疫分析方法中的应用奠定了基础。     

鲑精蛋白基因工程菌高效表达条件的优化

为了提高鲑精蛋白基因工程菌融合蛋白的表达量,本文对工程菌的发酵培养基组分、培养基初始pH值、发酵种子接种量、诱导剂浓度、诱导温度、诱导时机、诱导时间等因子进行了筛选。试验结果表明,培养基组分、诱导温度、诱导时机和诱导时间是影响融合蛋白表达量的主要因素。经筛选,最佳发酵条件是以PYJ-2为发酵培养基,37℃下培养3～5h后,以5mmol/L的乳糖诱导工程菌6～8h表达融合蛋白,融合蛋白表达量从18.90%提高到40.10%。     

南极假丝酵母脂肪酶B的克隆、表达及发酵条件优化

从原始菌株Candida antarctica ZJB09193出发,将南极假丝酵母脂肪酶B基因克隆至酵母表达载体pPICZαA,重组质粒线性化后导入表达宿主菌X-33,在甲醇诱导下,实现了CALB活性表达.从通气量、搅拌转速、初始pH、接种量和诱导剂量等方面对重组毕赤酵母的上罐发酵条件进行研究,最终确定通气量10 L/min,搅拌速度为800 r/min,初始pH 5.5,接种量10％,诱导剂量3500 mL可以达到较好的产酶量.确定DO为发酵控制的一个重要指标,在正确的溶氧校正下确保DO大于20％.