纳他霉素高产突变菌株高通量筛选方法的建立

为了提高纳他霉素（natamycin）高产菌株诱变后的筛选效率,建立一种24孔深孔板/酶标仪发酵初筛和摇瓶发酵复筛的高通量筛选检测方法,得到在24孔深孔板发酵结果与摇瓶发酵有很好的一致性,证实了酶标仪检测可以替代高效液相色谱法检测用于突变菌株的快速高通量筛选。以褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus TUST01）作为出发菌株,通过多轮的紫外诱变、常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）以及硫酸二乙酯复合诱变、孔板初筛与摇瓶复筛,从887株突变株中筛选出遗传性稳定的高产菌株S. gilvosporeus Y-4-75,其摇瓶纳他霉素产量（5.95 g/L）与生物量（29.19 g/L）较出发菌株分别提高了31.93%和15.19%。     

谷氨酸高产菌GDK-9的定向选育及其发酵过程研究

以天津短杆菌GDK6为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育L-谷氨酸生产菌。经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,最终筛选出1株L-谷氨酸高产菌GDK-9。该菌株在未优化条件下摇瓶发酵42h产L-谷氨酸79.2g/L。另外,试验结果证实GDK-9菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定。在优化条件下,通过7L罐发酵32h,谷氨酸产量达131.5g/L,糖酸转化率达到62.2%。     

ARTP诱变选育中温α-淀粉酶高产菌株及其发酵条件优化

利用常压室温等离子体(ARTP)技术,对产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株进行诱变处理,通过平板、深孔板初筛及摇瓶复筛共筛选出3株酶活明显提高的菌株,其中产酶活力最高的突变株BS-12,摇瓶酶活达到了801 U/m L,较出发菌株提高了32.2%。通过单因素试验,得到的最佳发酵条件为接种量6%,温度36℃,发酵时间68 h。在此条件下,摇瓶酶活力达到1 395 U/m L,经30 L发酵罐放大,酶活达到了1 553 U/m L。     

常压室温等离子体快速诱变选育丙酮酸高产菌株

本研究以产丙酮酸的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)Tp19为出发菌株,采用常压室温等离子诱变系统(ARTP)进行诱变,根据CaCO3筛选平板透明圈与菌落直径比以及100孔板产酸量快速筛选丙酮酸高产突变株。最后通过摇瓶发酵复筛,选育出一株遗传稳定的突变株A214,丙酮酸产量达到37.43g/L,比出发菌株提高了13.69%。     

海洋微生物酯酶高产菌株的诱变选育研究

以筛选自海洋的产酯酶Bacillus subtilis var.niger为出发菌株,在原生质体制备与再生的最佳条件下制得原生质体,并通过紫外线对其进行诱变处理,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得高产稳定菌株EB-2,产酶活力由原来的22.8U/mL提高到了77.6U/mL;同时,实验确定了该菌株原生质体制备与再生的最佳条件为:以pH7.2的0.3mol/L KCl和0.3mol/L蔗糖为稳定剂,菌龄在16h时,用 10mg/mL的溶菌酶酶液40℃下酶解30min后,原生质体制备率达到91.7%,再生率达到21.3%.     

灭活原生质体融合技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量

以豆豉纤溶酶产生菌株蜡状芽孢杆菌UV-101和MW-101作为亲本菌株,首先对亲本原生质体进行紫外灭活,然后用PEG(6000)作为融合剂对灭活双亲进行原生质体融合.通过对再生平板上长出的融合子进行平板初筛和摇瓶复筛,最终获得一株高产菌株PF-101,其酶活比亲本菌株分别提高了74.47%和86.36%,并且该菌株具有良好的遗传稳定性.     

利用多功能等离子体诱变系统快速诱变选育γ-氨基丁酸高产菌株

为建立一种快速便捷的产γ-氨基丁酸(GABA)高产菌株的诱变选育方法,以产GABA的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)TCCC 13007为出发菌株,采用多功能等离子体诱变系统(MPMS)对其进行诱变育种。最佳诱变条件为氮气流量10 L/min、照射间距3 mm、120 W功率条件下处理90 s,致死率90%。将诱变后的菌悬液涂布到CaCO_3筛选平板上,以CaCO_3透明圈与菌落直径比值为依据,建立了平板-96深孔板-摇瓶的快速筛选体系。最终通过摇瓶复筛,选育得到了一株GABA产量明显提高的突变株L8,GABA产量达到(66.59±0.58)g/L,较出发菌株提高了11.41%。10次连续传代与摇瓶发酵实验表明,突变株L8的发酵性能和遗传稳定性良好。     

复合诱变原生质体选育高产中性蛋白酶菌株

为进一步提高菌株产中性蛋白酶能力,在原生质体最佳形成条件下制备得到Bacillus subtilis UN9原生质体,并对其进行紫外线与亚硝基胍复合诱变,通过摇瓶复筛,得到高产、稳定的突变株Bacillus subtilis Promax NTG14,产酶能力相比出发菌株提高了近24%,中性蛋白酶活力达4286.09 U/mL.试验结果表明,复合诱变原生质体是一种快速、有效的优良产酶菌株选育途径.     

转谷氨酰胺酶高产突变株的紫外线诱变选育及发酵条件研究

以茂源链霉菌为出发菌株,对其进行紫外线诱变,通过初筛复筛,选育出性能稳定的高产突变菌株G-17,其酶活力达到0.86U/mL,相对于出发菌株提高了2.4倍。对影响突变菌株G-17摇瓶液态发酵条件进行了研究,确定发酵的最佳条件为:培养基初始pH为7.0,100μg/L CaCl2,接种量10%(V/V),发酵温度30℃,转速200r/min,摇床震荡培养48h;最佳发酵条件下,发酵液中转谷氨酰胺酶活力达到1.27U/mL。     

发酵条件对茂原链霉菌谷氨酰胺转胺酶产量的影响

以茂原链霉菌(Streptomyces mobaraense:DSM40587)为生产菌株,以提高谷氨酰胺转胺酶(TGase)的产量为主要研究目标,通过摇瓶发酵条件的研究,提高了酶的产量,缩短了发酵时间。茂原链霉菌摇瓶生产TGase最终发酵条件为:种龄48 h,接种量8%~12%;培养基组成为:聚蛋白胨30 g/L,可溶性淀粉30 g/L,磷酸氢二钾2 g/L,七水硫酸镁1 g/L,pH=7.0;发酵时间为120 h。     

茂原链霉菌谷氨酰胺转氨酶合成与菌体形态分化的关系

目的：研究茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）合成谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase,TGase）与菌体分化之间的关系,以及TGase的生理功能。方法：以S. mobaraensis为出发菌株,通过向培养基中添加乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）抑制TGase激活关键蛋白酶的活性从而调控成熟TGase的合成,同时利用激光共聚焦显微镜和扫描电镜观察发酵过程中菌体的活力和形态变化。结果：对照组随着TGase产量的升高,菌体生存活力呈先上升后下降的趋势,并且菌体表现出复杂的形态变化;实验组自加入EDTA后TGase产量不再升高,菌体生存活力也逐渐减弱,菌体形态分化滞后。结论：TGase的合成会影响茂原链霉菌生存活力及其形态分化。     

红曲色素高产菌株的高通量选育

该文结合24深孔板微型化培养和酶标仪检测,建立了红曲色素高产菌株的高通量筛选方法,此法简单、快速、准确且自动化水平较高.确定最佳培养条件为装液量1.2mL/孔(每孔体积为10mL),接种量9％;找出红曲色素最大吸收峰值,确定酶标仪检测波长为530nm;通过紫外-氯化锂复合诱变处理,经过高通量筛选获得9株正突变株,其中菌株D39微孔板发酵色价达42.7U/mL,比出发菌株提高了46.2％;将D39分离纯化并用摇瓶验证,得到纯菌株D39-4的摇瓶发酵色价为206.5U/mL,比出发菌株提高了51.1％,具有很好的工业应用前景.     

复合诱变法选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株

为筛选谷氨酰胺转胺酶高产菌株,利用紫外-硫酸二乙酯复合诱变、一次筛选的方法诱变生产菌株茂源链霉菌（Streptoymyces mobaraensis）,结合高通量筛选技术筛选高产菌株。结果表明：复合诱变的方式较单独诱变的方式效率高。经过诱变的高产菌株由于酶的成熟加快或者蛋白表达量增加而提高了酶活力,最高可达7.02 U/mL,比野生菌株提高了54%。进一步研究高产菌株发现,高产菌株谷氨酰胺转胺酶的成熟加快,可提前24 h结束发酵;发酵液中酶原含量高,会降低发酵液中酶活性。     

甲基营养型芽孢杆菌产3-羟基丁酮的微孔板发酵培养基优化

为获得一种高效、快速的筛选高产3-羟基丁酮菌株的方法,首先对诱变后的34株突变株分别进行摇瓶发酵和48孔板发酵,验证两种方法之间的相关系数R为0.806 2,表明两种方法具有较好的一致性,48孔板可以用于产3-羟基丁酮菌株的大批量筛选。然后采用响应面分析法对48孔板发酵培养基组分进行优化。结果表明,在优化的条件下,3-羟基丁酮产量达到41.17 g/L,比优化前提高了30.08%,且3-羟基丁酮转化率由原来的27.31%提高到33.12%。     

应用基因组改组选育耐糖L-乳酸高产菌株

本研究应用基因组改组提高鼠李糖乳杆菌的耐糖能力,进而提高L-乳酸的产量。通过紫外线和亚硝基胍诱变方法获得8株改良出发菌株。考察了氨基酸前处理和变溶菌素对原生质体形成的影响。利用双亲灭活的原生质体进行递进式融合,经过两轮基因组改组和碳酸钙高糖平板及瓶筛选,选育出了耐糖改组菌株F2-2。在初糖浓度为150g/L发酵罐中,F2-2的乳酸产量为140g/L,是野生型乳杆菌的1.8倍。结果表明基因组改组技术能够快速提高乳酸菌耐糖和产酸能力两个表型。     

96孔板高通量选育产乙醇酵母

以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),安琪酵母(Angel yeast),酿酒酵母(Sacchro-myces cerevisiae)等4株菌为出发菌株,经过紫外诱变,96孔板高通量筛选出60株,复筛选出4株.最大乙醇产量提高到76.6g/L,糖醇转化率达到了0.488g/g.对上述4株菌进行耐乙醇性能驯化,发酵耐乙醇能力达到15%.     

保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体制备及融合

为获得具有抗噬菌体功能且发酵性能优良的乳酸菌融合子,采用单亲灭活及正交分析方法,研究了保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体制备及融合条件。结果表明：保加利亚乳杆菌原生质体制备的最适条件是以磷酸盐缓冲液和甘露醇制作的高渗溶液为原生质体稳定剂,1.0 mg/mL的溶菌酶36 ℃处理30 min,原生质体的形成率为（89.02±2.31）%,再生率为（4.62±0.22）%。嗜热链球菌抗噬菌体菌株原生质体制备的最适条件是以Tris-HCl和蔗糖制作的高渗溶液为原生质体稳定剂,0.1 mg/mL的溶菌酶42 ℃处理30 min,原生质体的形成率为（99.15±0.23）%,再生率为（5.79±0.17）%。单亲灭活保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株原生质体融合的最适条件为聚乙二醇6000（质量浓度为400 g/L,添加0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2）40 ℃促融2 min,融合率可达（1.85±0.12）×10－6。所得融合子各项性能优良,适合于酸奶生产。     

基于图像灰度处理的谷氨酰胺转氨酶产生菌半定量-高通量筛选

以图像灰度处理软件Image J为测量手段,以微生物谷氨酰胺转氨酶（MTG）产生菌拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）109.5为出 发菌株,经紫外诱变后,对突变株进行半定量测定和高通量筛选。 突变株在含有营养琼脂培养基的96孔板中30 ℃条件下培养3 d后进 行显色反应,利用Image J获得各孔灰度均值,根据灰度均值差异预测突变株的产酶水平。 结果表明,从334株突变株中筛选到一株 MTG活力为0.803 U/mL的正突变株80,较出发菌株MTG活力提高148.6%。 基于Image J图像处理软件与96孔板的固体培养法可以实 现MTG产生菌株的半定量测定和高通量筛选。     

粗壮脉纹孢菌原生质体的制备、再生及转化的条件

为建立原生质体介导的粗壮脉纹孢菌遗传转化系统,本研究主要考察了复合酶解液、菌龄及酶解时间对粗壮脉纹胞菌原生质体生成及再生的影响。结果表明,粗壮脉纹胞菌孢子悬液接种在马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar,PDA）液体培养基中,30 ℃条件下摇床培养10 h的菌丝,采用0.5 g/100 mL蜗牛酶＋0.5 g/100 mL溶壁酶＋1 g/100 mL纤维素酶的复合酶解液、30 ℃条件下酶解10 h,粗壮脉纹胞菌原生质体生成及再生最为适合。在此条件下,原生质体生成数可达4.53×106 个,38#再生培养基中的再生数可达1.41×106 个,再生率达31.71%,聚乙二醇介导PAKHB载体转化NC原生质体,每微克质粒可获得8 个以上的转化子。     

基因改组选育高产杆菌肽地衣芽孢杆菌及改组菌株差异分析

为了提高地衣芽孢杆菌肽产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育。以地衣芽孢杆菌TJ12为原始菌株,通过紫外诱变、亚硝基胍诱变、常压室温等离子体诱变构建了TJ12菌的突变体库。在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4 株诱变菌株（U11、U23、H1、L71）作为亲本,采用聚乙二醇介导的方法进行3 轮多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,最终选出1 株杆菌肽产量提高并能稳定遗传的优良菌株F3,对其摇瓶发酵36 h,杆菌肽A产量达760 mg/L,为野生菌株TJ12的1.7 倍。与野生菌株TJ12相比,改组菌株提前进入生长稳定期,两者发酵过程pH值几乎无差异;最终改组菌生长量虽低于野生菌,但菌株单位细胞还原糖产量及杆菌肽产量都高于野生菌株;其合成基因和调控基因表达量相对野生菌株都上调,其中合成基因上调幅度较大。推测改组菌株自身有了更强大的杆菌肽耐受机制,且合成基因相关部位可能发生了改变。