Juglone联合顺铂抑制食管癌EC1细胞增殖的研究

目的研究Pinl抑制剂Juglone与化疗药物顺铂（CDDP）单独及联合使用对食管癌EC1细胞增殖的抑制作用。方法使用不同浓度Juglone、CDDP或者两药联用处理食管癌EC1细胞后,应用MTT法测定两药单独或联合使用对食管癌EC1细胞增殖的影响,使用流式细胞仪检测其对EC1细胞周期的影响。结果 Juglone对EC1细胞的生长有明显的抑制作用,48 h细胞抑制率从11.5%上升到50.7%,具有显著的剂量效应。Juglone可造成食管癌细胞在G2/M＋S期的阻滞;CDDP可增加EC1细胞对于Juglone的敏感性,CDDP与Juglone合用,明显提高了EC1细胞的生长抑制率。结论 Juglone与CDDP联合能显著抑制食管癌EC1细胞的增殖。     

体外研究腺苷酸活化蛋白激酶对食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响

目的通过体外研究观察腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的激活剂AICAR对人食管癌EC9706细胞的增殖及凋亡影响。方法 AICAR以不同浓度作用于人食管癌EC9706细胞,通过光学显微镜观察不同时间后EC9706细胞的生长状态,并用MTT方法检测其吸光度值及细胞存活率的变化,流式细胞术检测其细胞凋亡率情况。结果随着AICAR浓度的增加,细胞的死亡数目明显增加。MTT法检测结果表明,AICAR能够抑制EC9706细胞增殖,并呈现出良好的浓度依赖性。流式细胞术检测结果显示,不同浓度的AICAR干预24 h后早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率均高于对照组,但仅有总凋亡率有统计学意义(P0.01)。结论 AMPK可以抑制人食管癌EC9706细胞的生长增殖,并可诱导EC9706细胞凋亡。     

Pinl抑制剂Juglone对食管癌EC1细胞增殖的抑制作用

目的:测定Pin1抑制剂(Juglone)对食管癌细胞EC1生长增殖的影响,探讨Juglone的抗肿瘤作用.方法:体外培养人食管癌细胞系EC1,用MTT试验观察细胞生长增殖状况,流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡.结果:MTT试验表明,Juglone对EC1细胞生长有明显的抑制作用,且抑制作用随作用浓度和作用时间增加而增强.流式细胞仪检测表明,加入Juglone培养48 h后,EC1细胞出现G2期阻滞.Juglone药物(10、20、30 μmol/L)培养48 h后,EC1细胞的凋亡率明显增加,与对照组相比有统计学意义(9.06%,32.88%,53.18% vs 8.77%.均P<0.05).结论:Pin1抑制剂Juglone可以通过抑制Pin1表达从而抑制食管癌细胞的增殖,Pin1抑制剂有望成为新型的抗肿瘤治疗靶点.     

环氧合酶-2反义RNA在不同时间点对人食管癌细胞系生长的影响

背景:环氧合酶（COX）-2在人食管癌细胞系EC9706中高度表达,COX-2反义RNA能抑剂EC9706细胞的生长增殖。目的:探讨COX-2反义RNA在不同时间点对EC9706细胞生长的影响。方法:培养293细胞,扩增、纯化编码COX-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,转染EC9706细胞,在不同时间点进行活细胞计数和3H-胸腺嘧啶核苷（TdR）掺入量测定。结果:扩增、纯化获得编码COX-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,滴度为1.2×10~（12）PFU/ml。Ad-AShcox-2转染EC9706细胞后,在24h、48h、72h和96h时对细胞生长的抑制率分别为8.60％、24.33％、50.21％和75.26％。Ad-AShcox-2组EC9706细胞的3H-TdR掺入量从24h起开始减少,72～96h时达最低,与对照组相比有显著差异（P<0.001）。结论:COX-2反义RNA重组腺病毒感染人食管癌细胞后,从24h起开始对癌细胞产生抑制作用,72～96h时寸抑制作用最为明显。     

siRNA沉默TPX2基因对食管癌细胞EC9706的增殖和TPX2基因表达的影响

目的:研究TPX2基因特异性小干扰RNA(small RNA interference,siRNA)对食管鳞癌EC9706细胞基因表达的抑制作用及对食管癌细胞生长的影响.方法:以食管鳞癌EC9706细胞为研究对象,利用Lipofectamine2000介导TPX2 siRNA分组转染EC9706细胞24,48,72,96 h(实验组),并设立阴性对照组和空白对照组.RT-PCR检测siRNA转染前后TPX2 mRNA的表达水平的变化:Western blot检测转染前后EC9706细胞中TPX2蛋白表达水平的变化;MTT法检测瞬时转染TPX2 siRNA对EC9706细胞增殖的影响.结果:导入有效siRNA后,PT-PCR及Western blot结果显示.TPX2 siRNA可使EC9706细胞中TPX2 mRNA水平及蛋白表达水平下降,至72 h时表达量最低,与空白对照组相比分别为0.31±0.08和0.39±0.12,差异有统计学意义(P<0.05);MTT实验显示细胞的生长增殖受到明显抑制,与对照组相比抑制率可达35.4%(P<0.05).结论:siRNA可以有效抑制EC9706细胞中TPX2的表达,并降低EC9706细胞的增殖能力.     

DNA聚合酶β过表达对食管癌EC9706细胞的影响

目的:观察过表达的DNA聚合酶β对食管癌EC9706细胞系的影响.方法:运用PCR方法,从质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出野生型和突变型的DNA聚合酶β基因,作为目的片段,定向克隆至pEGFP-C3真核绿色荧光蛋白表达载体,获得野生型和突变型的重组真核表达载体pEGFP-C3-polβ.分别将野生型和突变型的pEGFP-C3-polβ转染EC9706细胞,荧光显微镜观察其定位,绘制生长曲线,测定细胞周期.结果:DNA序列分析证实了重组载体中的DNA聚合酶β序列正确,荧光显微镜结果显示野生型的DNA聚合酶β表达以细胞核为主,突变型的DNA聚合酶β则表达在整个细胞中,明显与野生型的DNA聚合酶β的核定位不同.而且,野生型的细胞生长较对照组缓慢(P＜0.05),野生型的还能抑制EC9706细胞的生长和使S期细胞减少(22.11±0.12 vs 44.86±0.03,P＜0.05),而突变型的则不能促进EC9706细胞的生长,S期细胞增殖不明显(P＞0.05).结论:过表达的野生型食管癌DNA聚合酶β可以降低EC9706细胞的增殖.     

硒蛋氨酸诱导食管癌细胞株凋亡的实验研究

目的：探讨硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC 9706凋亡的影响。方法：采用MTT比色法，细胞生长曲线描绘观察硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC 9706增殖的影响。采用流式细胞仪观察硒蛋氨酸对EC 9706细胞诱导其凋亡的作用及对细胞周期的影响。琼脂糖凝胶电泳法检测DNA ladder。结果：硒蛋氨酸呈时间、剂量依赖性方式抑制EC 9706细胞增殖，改变细胞周期分布，增加G0／G1期细胞比例，诱导细胞凋亡。结论：硒蛋氨酸可能通过影响细胞周期分布和诱导细胞凋亡，从而抑制EC 9706细胞增殖。硒蛋氨酸可能是预防和治疗食管癌的一种新制剂。     

孕烷X受体抗食管癌EC9706细胞凋亡的作用机制

目的 研究孕烷X受体(PXR)抗食管癌EC9706细胞凋亡的作用机制.方法 使用利福平活化食管鳞癌EC9706细胞中的PXR,阿霉素(ADM)诱导高表达PXR的EC9706细胞凋亡,采用流式细胞仪观察细胞的增殖周期,MTT法观察细胞凋亡率,Western印迹和免疫组化法检测Caspase-3,Bcl-2,Bax蛋白表达情况.结果 ADM处理可以明显抑制细胞生长;使细胞呈明显凋亡改变;利福平诱导PXR高表达的EC9706细胞凋亡减少,抑制Caspase-3的蛋白水平,上调蛋白Bcl-2的表达,表明PXR在抗食管鳞癌细胞凋亡中发挥重要的作用.结论 PXR可能是通过降低Caspase-3和升高Bcl-2蛋白的表达抑制食管癌细胞EC9706的凋亡.     

环氧合酶-2选择性抑制剂NS-398诱导食管癌细胞EC 9706凋亡及其机制的探讨

目的 观察环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂NS一398对食管癌细胞株EC 9706增殖及凋亡的影响,砌究其对凋亡抑制蛋白Survivin和Caspase-3表达的影响,探讨NS-398诱导Ec 9706细胞凋亡的作用机制.方法 NS-398作用EC 9706细胞后,MTT法测定NS-398对人食管癌EC 9706细胞增殖的抑制率;DNA片段分析法和流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测Survivin和Caspase-3蛋白表达变化.结果 NS-398(10～100μmol/L)对EC 9706细胞生长有抑制作用,随浓度升高、时间延长抑制作用增强,并诱导EC 9706细胞凋亡,呈剂量-时间效应关系;NS-398可降佴Survivin蛋白表达,增加Caspase-3蛋白表达.结论 NS-398可诱导人食管癌细胞株EC 9706凋亡,其机制可能与下调Survivin表达及激活Capase-3表达有关.     

顺铂诱导食管癌EC9706耐药细胞中Bcl-2的表达

目的探讨凋亡抑制蛋白Bcl-2在顺铂(DDP)诱导食管癌EC9706耐药细胞中的表达。方法建立EC9706/DDP细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,Western印迹检测DDP处理后EC9706细胞及EC9706/DDP细胞Bcl-2蛋白表达,RTPCR、荧光定量PCR检测Bcl-2 mRNA水平。结果 EC9706/DDP细胞对DDP诱导的凋亡不敏感,Western印迹检测到EC9706/DDP细胞中Bcl-2表达上调,与EC9706细胞相比具有统计学意义(P0.05)。RT-PCR、荧光定量PCR检测到EC9706/DDP细胞中Bcl-2 mRNA水平上调,与EC9706细胞相比具有统计学意义(P0.05)。结论 Bcl-2表达上调可能为食管癌EC9706细胞对DDP耐药的重要机制。     

内皮旁分泌因子调控心脏生长的研究进展

血管生成是维持心脏组织适应性生长、再生的关键因素。内皮细胞（endothelial cell,EC）是血管的主要组成部分,除了形成血管为心脏组织提供氧气和营养物质以外,还可以通过旁分泌多种细胞外因子调控组织稳态、生长和再生等过程。近年来研究发现EC可分泌神经调节蛋白1（neuregulin-1, NRG-1）等因子调控心肌细胞肥大、增殖和凋亡等过程,是影响生理病理性心脏生长以及心肌梗死等过程的重要因素。因此,深入了解EC旁分泌因子的类型及其作用机制可为预防和治疗心血管疾病提供新的靶点和策略。     

p16INK4α重表达对人食管癌细胞系EC109生长的抑制作用

目的探讨用腺病毒介导野生型的p16基因在食管癌细胞系表达,研究重表达野生型p16基因对食管癌细胞系EC109生长的抑制作用,为寻找食管癌致癌机制的研究及其基因治疗提供理论基础.方法用基因重组技术,将pcDNA3-p16中的野生型p16基因用Kpn I/BamH I进行双酶切,克隆入腺病毒表达载体pAdCMV中,将重组质粒pad-CMV-p16与腺病毒质粒JM17用Lipofectamime 2000共转染293细胞,产生重组腺病毒.用重组腺病毒感染人食管癌细胞系EC109,在感染后的不同时段,用免疫荧光、打点杂交方法检测p16基因在细胞中的表达用MTT法及流式细胞仪观察p16基因的表达对食管癌细胞株生长的影响.结果经酶切鉴定野生型p16基因克隆入腺病毒表达载体中,与JM17共转染293细胞后,可产生具有感染活性的重组腺病毒,用重组腺病毒感染食管癌细胞株EC109细胞后,可抑制食管癌细胞的生长,同对照组相比其最大抑制率可达52.7%.Multipcycle分析软件分析对细胞周期影响表明,处于G0～G1期的细胞为41%～63%感染后的细胞经Dot blot和Westernblot杂交证实,有外源的p16mRNA及蛋白的表达.结论重组腺病毒可将野生型p16基因导入人食管癌细胞系EC109中,野生型p16基因在p16基因功能缺失的细胞中重表达能抑制癌细胞恶性生长.p16基因功能缺失是食管癌致癌因素之一     

p16-INK4alpha重表达对人食管癌细胞系EC109生长的抑制作用

目的探讨用腺病毒介导野生型的p16基因在食管癌细胞系表达,研究重表达野生型p16基因对食管癌细胞系EC109生长的抑制作用,为寻找食管癌致癌机制的研究及其基因治疗提供理论基础.方法用基因重组技术,将pcDNA3-p16中的野生型p16基因用Kpn I/BamH I进行双酶切,克隆入腺病毒表达载体pAdCMV中,将重组质粒pad-CMV-p16与腺病毒质粒JM17用Lipofectamime 2000共转染293细胞,产生重组腺病毒.用重组腺病毒感染人食管癌细胞系EC109,在感染后的不同时段,用免疫荧光、打点杂交方法检测p16基因在细胞中的表达用MTT法及流式细胞仪观察p16基因的表达对食管癌细胞株生长的影响.结果经酶切鉴定野生型p16基因克隆入腺病毒表达载体中,与JM17共转染293细胞后,可产生具有感染活性的重组腺病毒,用重组腺病毒感染食管癌细胞株EC109细胞后,可抑制食管癌细胞的生长,同对照组相比其最大抑制率可达52.7%.Multipcycle分析软件分析对细胞周期影响表明,处于G0～G1期的细胞为41%～63%感染后的细胞经Dot blot和Westernblot杂交证实,有外源的p16mRNA及蛋白的表达.结论重组腺病毒可将野生型p16基因导入人食管癌细胞系EC109中,野生型p16基因在p16基因功能缺失的细胞中重表达能抑制癌细胞恶性生长.p16基因功能缺失是食管癌致癌因素之一     

腺病毒介导RA538及反义c-myc在不同细胞系中作用及其机制

目的比较重组RA538,反义c-myc及LacZ腺病毒(adenovirus,AV)对不同靶细胞的转染效率、生物学特性并探讨其作用的分子机制.方法以人胃癌细胞(SGC7901)、食管癌细胞(EC109)及人胚肺二倍体细胞(2BS)系为靶细胞,采用LacZ基因转染X-gal染色、形态学观察、MTT,RT-PCR等方法,研究重组RA538,反义c-myc及LacZ AV对上述细胞的转染效率,生物学作用及其分子机制.结果 AV-LacZ进行重组腺病毒转导效率检测显示其对SGC7901,2BS细胞具有很高的转导效率,对EC109细胞转导效率较低.AV-RA538及AV-ASc-myc对SGC7901细胞能产生明显的生长抑制效应并诱导凋亡,其生长抑制率分别为76.3%和44.1%.AV-RA538及AV-ASc-myc对SGC7901细胞内源性c-myc,bcl-2基因的表达具有抑制作用.AV-RA538及AV-ASc-myc对EC109细胞及2BS细胞无明显的生长抑制及凋亡诱导作用,AV-RA538对EC109及2BS细胞中内源性c-myc,bcl-2基因的表达无调节作用.结论 AV载体转导效率很高,能实现目的基因在转导细胞中的高水平表达,但对不同靶细胞的转染效率存在差别.AV-RA538,AV-ASc-myc对SGC7901的生长抑制及凋亡诱导作用可能是通过AV的高效转导及抑制c-myc,bcl-2的表达而实现的.AV-RA538,AV-ASc-myc对食管癌、2BS细胞系无类似作用可能与其对上述细胞的转导的作用及内源性基因表达的作用有关.     

环氧合酶-2反义RNA在不同时间点对食管癌细胞系EC9706生长的影响

目的:探讨环氧合酶-2(COX-2)反义RNA在不同时间点对人食管癌细胞系EC9706生长的影响。方法:培养293细胞,扩增、纯化COX-2反义RNk的重组腺病毒-Ad-AShcox-2,转染食管癌细胞EC9706,在不同时间点进行活细胞计数及3H-TdR掺入量测定。结果:扩增、纯化获得编码COX-2反义RNA的重组腺(?)毒Ad-AShcox-2,滴度达1.2×1012 PFU/ml;Ad-AShcox-2传染EC9706后在24 h、48 h、72 h、96 h对细胞生长的抑制率分别为8.60％、24.33％、50.21％、75.26％,对3H-TdR掺入量在24 h开始减少,以72～96 h最低,与对照组比较P<0.001。结论:表达COX-2反义RNA重组腺病毒感染人食管癌细胞后,对癌细胞的抑制从24 h开始,48～72 h最明显。     

p21WAF1基因对人食管鳞癌细胞增殖的抑制作用

目的:探讨p21WAF1( p21)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组.p21转染组:用脂质体Lipofectamine2000介导将pCDNA3.1(+)- p21质粒转染入EC109细胞; 空载体转染组:同样方法将pCDNA3.1(+)-neo质粒转染入EC109细胞; 未转染组:未转染的EC109细胞.应用RTPCR、Western blot分别检测p21基因mRNA、P21蛋白变化; 流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p21基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p21转染细胞中p21 mRNA和P21蛋白高表达; p21转染组EC109细胞生长速度低于空载体组和未转染组; 流式细胞仪观察到P21蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(63.120%±2.893% vs 41.380%±6.536%,42.173%±5.301%,均P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(18.923%±3.084%vs 22.573%±5.463%,26.867%±2.922%,均P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p21转染组发生细胞凋亡.结论:p21基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.     

脐血树突状细胞介导的食管癌疫苗实验研究

目的　用杂交瘤技术制备脐血树突状细胞 (DC)和食管癌细胞融合疫苗 ,分析其生物学特征及体外诱导特异性免疫应答的能力。方法　 2 0 0 2 - 0 12 0 0 3- 0 3汕头大学医院第一附属医院分离脐血CD3 4 干细胞并诱导扩增为成熟DC ,并与EC10 9细胞融合 ,免疫磁珠法筛选EC10 9 DC ;流式细胞术鉴定疫苗表型 ;绘制疫苗生长曲线 ;MTT法测定瘤苗诱导淋巴细胞增殖能力及体外特异性免疫应答能力。结果　疫苗可体外生长 ,高表达CD80 、CD83 和CD86,并能有效刺激淋巴细胞增殖反应 ,体外诱导细胞毒T细胞 (CTL)对EC10 9的杀伤活性显著高于对照组 (P <0 0 5 )。结论　EC10 9 DC具备了刺激免疫细胞活化的分子表型 ,能在体外刺激淋巴细胞增殖和诱导特异性CTL杀伤作用     

p15INK4B和p21WAF1基因联合转染对人食管鳞癌细胞系EC109的协同抑制作用

目的:探讨p15INK4B和p21WAF1基因联合转染对人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖和凋亡的影响.方法:脂质体介导PcDNA3.1(+)-p15和pcDNA3.1(+)-p21转染EC109细胞,稳定筛选后用RT-PCR检测转染细胞p15与p21基因mRNA表达,Western blot检测转染细胞P15和P21蛋白的表达.用MTT法和透射电镜检测p15和p21基因分别及联合转染对EC109细胞增殖与凋亡的影响,流式细胞仪检测EC109细胞周期分布与凋亡率.结果:p15和p21转染组EC109细胞生长速度低于空载体组与未转染组,联合转染组与二者单独转染组相比.亦明显抑制EC109细胞体外生长速度.p15和p21转染组EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组,S期则显著降低(G1期:60.52%±3.75%,63.12%±2.89% vs 42.17%±5.30%.41.38%±6.54%;S期:22.67%±1.25%,17.96%±2.03% vs 30.96%±3.33%,36.05%±1.78%,均P<0.01),并出现凋亡峰,透射电镜亦发现p15和p21转染组发生细胞凋亡,联合转染组发生更为明显的G1/S阻滞,G1期比例显著升高、S期比例明显降低(G1期:72.83%±2.31% vs60.52%±3.75%,63.12%±2.89%:S期:13.59%±2.59% vs 22.67%±1.25%,17.96%±2.03%.均P<0.05),凋亡率明显升高(21.21%±1.78%vs 4.32±1.74%,10.83%±2.40%,均P<0.01).结论:p15和p21基因联合转染在体外可以进一步增强对人食管鳞癌EC109细胞的抑制与诱导凋亡作用.     

功能性消化不良患者肠嗜铬细胞数量及功能改变

目的探讨作为5-羟色胺(5-HT)重要来源的肠嗜铬细胞(EC细胞)在功能性消化不良(FD)患者胃黏膜中的改变。方法对15例健康志愿者和33例FD患者进行研究,免疫组化法染色并计数EC细胞。电镜观察EC细胞超微结构。结果FD患者近端胃黏膜EC细胞数显著高于对照组(12．5±2．1比8．3±1．4,t=2．353,P＜0．05)。FD患者EC细胞染色强度较对照组明显增强(3．72±0．42比2．61±0．57,t=2．078,P＜0．05)。随胃黏膜炎症程度的加重,EC细胞数量增加,染色强度增强。电子显微镜下EC细胞内高尔基体、线粒体及内质网较多,胞质内有特异性分泌颗粒。结论EC细胞可能参与FD发病,EC细胞数量与胃黏膜炎症程度有关。     

感染后功能性消化不良患者胃黏膜肠嗜铬细胞的改变

背景：已证实肠嗜铬细胞（EC细胞）在感染后肠易激综合征（PI-IBS）的发生中起重要作用。功能性消化不良（FD）与IBS同属功能性胃肠病范畴,推测感染后FD（PI-FD）与PI-IBS可能存在相似的发病机制。目的：观察PI-FD患者胃黏膜EC细胞数量、功能的改变,初步探讨PI-FD的可能发生机制。方法：纳入35例PI-FD患者、30例非PI-FD患者和20名健康志愿者。35例PI-FD患者中,14例粪便培养致病菌阳性（PI-FD-A组）,21例粪便培养阴性,根据临床表现确诊（PI-FD-B组）。以5-羟色胺（5-HT）免疫组化染色计数胃黏膜EC细胞,高效液相色谱电化学法检测胃黏膜5-HT浓度,透射电子显微镜观察EC细胞超微结构及其与神经纤维的毗邻关系。结果：PI-FD组胃黏膜EC细胞数和5-HT浓度显著高于非PI-FD组和健康对照组（P〈0.05）,且EC细胞数量与黏膜炎症程度呈正相关（P〈0.05）。电子显微镜下,EC细胞内细胞器较多,部分胞质内可见特异性分泌颗粒,PI-FD组距神经纤维5μm范围内EC细胞数显著高于非PI-FD组和健康对照组（P〈0.05）。PI-FD-A组与PI-FD-B组的EC细胞数量和5-HT浓度均无明显差异。结论：PI-FD患者胃黏膜EC细胞显著增殖、活化,EC细胞激活途径可能在PI-FD的发病过程中起重要作用。