重组人白细胞介素-1β诱导人牙髓细胞蛋白质组的差异分析

目的分析重组人白细胞介素-1β（rhIL-1β）诱导前后牙髓细胞蛋白质的差异,鉴定2组间差异表达的蛋白质。方法采用双向凝胶电泳技术分离牙髓细胞全蛋白,获得对照组和诱导组牙髓细胞蛋白质图谱,Image Master2D Elit 5.0软件分析确认差异表达蛋白。通过基质辅助的激光解吸飞行时间质谱对差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定,得到肽质量指纹图谱。结果比较对照组和诱导组蛋白质图谱,发现了39个蛋白质点差异明显。其中15个蛋白质点在诱导组高表达,新增13个蛋白质点,7个蛋白质点低表达,4个蛋白质点仅在对照组中表达;质谱鉴定后,10个蛋白得到确认。结论牙髓细胞对rhIL-1β的应答反应是一个非常复杂的过程,多种蛋白质分子涉及其中。鉴定了牙髓细胞中与rhIL-1β作用密切相关的2个差异蛋白,为探索早期牙髓炎的应答机制提供了新的线索和思路。     

双向电泳分析重组人白细胞介素-1β对人牙髓细胞的影响

目的：观察rhIL-1β对培养的HDPCs产生蛋白质的影响,揭示rhIL-1β与牙髓炎的关系。方法：在HD-PCs的培养液中加入rhIL-1β,用2-DE分离HDPCs全蛋白,获得对照组和诱导组HDPCs蛋白质图谱,ImageMaster2DElit 5.0软件分析确认差异表达蛋白。结果：比较对照组和诱导组蛋白质图谱,发现了39个蛋白质点差异明显。其中15个蛋白质点在诱导组高表达,新增13个蛋白质点,7个蛋白质点低表达,4个蛋白质点仅在对照组中表达。结论：HDPCs对rhIL-1β的应答反应是一个非常复杂的过程,多种蛋白质分子涉及其中。     

双向电泳分析重组人白细胞介素-1β对人牙髓细胞的影响

在HD-PCs的培养液中加入rhIL-1β,用2-DE分离HD-PCs全蛋白,获得对照组和诱导组HDPCs蛋白质图谱,ImageMaster2D Elit5.0软件分析确认差异表达蛋白。结果:比较对照组和诱导组蛋白质图谱,发现了39个蛋白质点差异明显。其中15个蛋白质点在诱导组高表达,新增13个蛋白质点,7个蛋白质点低表达,4个蛋白质点仅在对照组中表达。结论:HDPCs对rhIL-1β的应答反应是一个非常复杂的过程,多种蛋白质分子涉及其中。     

巨噬细胞游走抑制因子在人牙髓中的表达及对牙髓细胞增殖的影响

目的 研究正常及炎症牙髓组织中巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration-inhibitory factors,MIF)的表达及其对人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPC)增殖的影响,以期探讨MIF在牙髓炎症中的可能作用.方法采用免疫组织化学和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测健康及炎症牙髓组织中MIF的表达情况,并以不同质量浓度[0(对照组)、0.1、1.0、10.0 mg/L]脂多糖刺激HDPC 24 h,ELISA法检测HDPC培养上清液中MIF含量的变化;不同质量浓度(10、30、60 μg/L)的重组人MIF分别作用于HDPC 24和48 h,细胞计数试剂盒法检测细胞增殖率.结果 健康牙髓组织中MIF主要分布于成牙本质细胞层,炎症牙髓组织中MIF分布于成牙本质细胞、炎症细胞、牙髓成纤维细胞和血管内皮细胞中;MIF mRNA在正常牙髓组织和炎症牙髓组织中的表达差异无统计学意义(P>0.05);不同质量浓度脂多糖刺激HDPC后对照组MIF质量浓度为(1048.53±161.81) ng/L,0.1和1.0 mg/L组MIF分泌量[分别为(1772.58±495.05)、(1692.58±337.45) ng/L]与对照组相比均显著升高(P<0.05),约为对照组的1.5倍;10、30、60 μg /L 重组人MIF均可促进HDPC的增殖(P<0.05).结论 MIF在人牙髓组织中有表达且一定浓度脂多糖可促进HDPC MIF的分泌,重组人MIF可促进HDPC增殖,MIF可能在牙髓炎症发展过程中发挥一定作用.     

人牙髓细胞与牙龈成纤维细胞cDNA消减文库的构建

目的 建立人牙髓细胞(human dental pulp cell,HDPC)和人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)cDNA消减文库.方法 体外培养HDPC和HGF,分别提取mRNA并反转录为cDNA,应用基于PCR的改良消减杂交技术建立HDPC和HGF cDNA消减文库.结果 成功构建了HDPC和HGF cDNA消减文库,文库容量为4×102.结论 基于PCR的改良消减杂交技术是建立消减文库、寻找差异表达基因的一种高效方法,该消减文库的建立为进一步在分子水平研究牙髓细胞的生长、分化机理奠定了基础.     

基质细胞衍生因子1α及其受体CXCR4在人牙髓细胞中的表达

目的 研究体外培养人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPC)上CXCR4的表达情况,检测大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激后HDPC培养上清液中基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)的表达水平,探讨人工重组SDF-1α(recombinant human SDF-1α,rhSDF-1α)对HDPC增殖及迁移的影响.方法 采用免疫细胞化学及间接免疫荧光技术检测HDPC上CXCR4的表达.用不同浓度LPS(0.1、1、10、100 mg/L)和TNF-α(1、10、100μg/L)刺激HDPC 48 h后,ELISA法检测HDPC培养上清液中SDF-1α含量的变化.同时甲基噻唑基四唑(MTT)法及体外趋化实验观察不同浓度rhSDF-1α对HDPC增殖及迁移的影响.结果 正常HDPC胞膜表达CXCR4且其培养上清液分泌SDF-1α,浓度约为(4513.55±962.92)ng/L.在用LPS和TNF-α刺激HDPC后,SDF-1α的表达水平均显著降低(P＜0.05).50、100和200μg/L的rhSDF-1α可促进HDPC的增殖(P＜0.05),50和100μg/L rhSDF-1α作用9 h可显著趋化HDPC的迁移(P＜0.01).结论 CXCR4在HDPC上表达且SDF-1α能促进HDPC的增殖及迁移;SDF-1-CXCR4轴可能在牙髓组织损伤修复中发挥重要作用.     

高迁移率族蛋白B1在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达

目的:检测人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)诱导矿化过程中高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box 1,HMGB1)的表达变化,探讨HMGB1在人牙髓细胞损伤修复中的可能作用。方法:组织块法分离培养hDPCs,收集矿化诱导0、3、7、11、14d后hDPCs的mRNA、蛋白质及细胞爬片,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(western blot)分别检测HMGB1、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein, DSPP)、牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1, DMP1)及碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的mRNA及蛋白表达水平;并检测ALP活性,免疫荧光检测HMGB1在hDPCs矿化过程中的表达。结果:hDPCs矿化诱导后,DMP1、DSPP、ALP及HMGB1的mRNA表达显著性上调,DMP1、DSPP和ALP的mRNA以及碱性磷酸酶活性在诱导7 d、11 d和14 d后与对照组间差异有统计学意义(P<0.05),HMGB1mRNA在矿化诱导11d和14d后与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。蛋白印迹法检测示细胞内各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调,而细胞内HMGB1的蛋白表达较对照组下调。免疫荧光结果显示hDPCs矿化过程中,HMGB1逐渐从胞核转移至胞浆。结论:在hDPCs诱导成牙本质细胞分化过程中,HMGB1在mRNA水平上与DMP1、DSPP和ALP的表达变化趋势相似,而细胞内HMGB1蛋白水平表达下调,且HMGB1在hDPCs细胞内出现转位,提示HMGB1与hDPCs的成牙本质分化有关,可能在牙髓细胞损伤修复中发挥作用。     

rhIL-1α/rhTGF-β1诱导下大鼠髁突软骨细胞PRG4的表达

目的:观察rhTGF-β1对rhIL-1α作用下大鼠髁突软骨细胞蛋白多糖4(PRG4)表达的影响.方法:酶消化法获取髁突软骨细胞,甲苯胺蓝染色鉴定.细胞上清液中加入10 ng/ml的rhIL-1α,48 h后加入10 ng/ml的rhTGF-β1.不同时间点应用RT-PCR检测PRG4 mRNA的表达情况,ELISA法检测PRG4蛋白的分泌变化.结果:加入rhIL-1α 24、48、72 h组的PRG4表达量与对照组均有统计学差异(P<0.05),且逐渐降低.48 h组再加入rh TGF-β1 24h后PRG4表达量与对照组无统计学差异(P>0.05),而48 h后与各组均有统计学差异(P<0.05),且最高.结论:rhTGF-β1可以上调髁突软骨细胞PRG4的表达,且可逆转IL-1α的下调作用.     

人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的蛋白质组学研究

目的 采用蛋白质组学方法分析人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中细胞蛋白表达谱的改变,揭示特征蛋白在分化过程中所起的作用.方法对人牙髓细胞进行矿化诱导,提取诱导前后细胞总蛋白,双向电泳分离蛋白质,DeCyder V6.0软件确定差异蛋白点,质谱鉴定差异蛋白质.结果双向电泳确认46个差异蛋白质斑点,质谱鉴定20个蛋白斑点,差异蛋白质涉及细胞周期调节、能量代谢、信号传导等细胞生物学过程.结论蛋白质组学技术可高通量筛选与人牙髓细胞向成牙本质细胞分化相关的功能蛋白.     

人乳牙牙髓干细胞和恒牙牙髓干细胞的蛋白质组学比较

目的 采用蛋白质组学方法研究人乳牙牙髓干细胞（SHED）和恒牙牙髓干细胞（DPSC）中的蛋白表达差异.方法 应用双向凝胶电泳技术分离SHED和DPSC的细胞总蛋白.通过比较两种细胞的蛋白组学图谱,确定差异表达的蛋白点,而后对差异点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析和蛋白数据库信息检索,对差异蛋白进行功能分类.结果 建立了SHED和DPSC的蛋白质组图谱,经软件分析出45个差异蛋白点,其中26个表达上调,19个表达下调,再经质谱鉴定出48种蛋白,其生物学功能涉及细胞周期、代谢等.结论 SHED与DPSC中蛋白的差异表达体现了两种细胞在结构和功能上的异同性,为进一步研究SHED和DPSC在增殖、分化中的差异,以及牙齿相关干细胞在组织工程和再生医学研究中的应用提供参考.     

牙齿发育相关基因ADAM28在人牙乳头细胞中的定位分布研究

目的探讨牙齿发育相关基因金属蛋白酶解离素28(a disintegrin and metalloproteinase28,ADAM28)在人牙乳头细胞(human dental papilla cells,HDPC)中的定位分布及作用。方法应用基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ADAM28,通过细胞培养、基因转染HDPC后,采用免疫荧光、RT-PCR及Western blot检测ADAM28在HDPC中的表达分布。结果成功构建并鉴定ADAM28真核质粒,瞬时转染HDPC72h后,HDPC的胞质和胞膜上均表达ADAM28蛋白,而两对照组均无表达。结论ADAM28在HDPC内能被正确地翻译、表达,可能作为一种胞质蛋白调控着牙源性间充质细胞的增殖和分化。     

牙齿发育早期间充质细胞的差异蛋白分析

目的:应用蛋白质组学方法分析间充质细胞在牙齿发育早期不同阶段的蛋白质差异表达情况,从蛋白水平进一步了解牙齿发育早期的分子机制.方法:制备C57胎鼠起始期(E11.5)、蕾状期(E13.5)冰冻切片,通过激光捕获显微切割技术(LCM)获取两个时期下颌第一磨牙牙胚间充质细胞,采用双向凝胶电泳方法分离蛋白质,比较分析凝胶图像,通过质谱及生物信息学分析鉴定差异蛋白.结果:激光捕获了较纯的目的细胞,得到双向凝胶电泳图谱,比较分析发现E13.5组8个蛋白点明显上调,E11.5组5个蛋白点发生明显上调.质谱分析初步鉴定了蛋白质种类.结论:LCM技术能较好地获取较为均一的目的细胞,并发现牙胚发育起始期与蕾状期间充质细胞蛋白质表达存在差异,为牙胚早期发生的分子机制研究提供一种新的方法.     

大肠杆菌脂多糖影响Toll样受体4在人牙髓细胞的表达

目的:探讨大肠杆菌脂多糖(lippolysacchaide,LPS)对体外培养的人牙髓细胞(human dental pulp cells,HDPCs)Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)表达的影响及TLR4在LPS对牙髓细胞激活中的作用。方法:以大肠杆菌LPS刺激体外培养的人牙髓细胞,运用实时荧光定量RT-PCR和免疫荧光技术分别检测牙髓细胞TLR4mRNA和蛋白的表达。利用抗体阻断和ELISA方法观察TLR4在LPS激活牙髓细胞释放IL-1β中的作用。结果:正常牙髓细胞不表达TLR4,1×10-4g/L大肠杆菌LPS作用HDPCs6、12、24h后均可见TLR4在胞膜/胞质的表达,胞核并不表达TLR4。FQRT-PCR结果表明LPS能明显上调牙髓细胞TLR4mRNA的表达(P<0.001),并具有LPS浓度依赖性。抗体阻断和ELISA结果证实LPS能激活牙髓细胞释放IL-1β(P<0.01),抗TLR4单抗能明显抑制LPS对HDPCs的激活(P<0.05)。结论:正常人牙髓细胞不表达TLR4,大肠杆菌LPS能诱导牙髓细胞表达TLR4mRNA和蛋白。TLR4介导了LPS对牙髓细胞的活化,在LPS对牙髓细胞激活效应中具有重要作用。     

模拟微重力影响人牙髓干细胞的矿化能力与RhoA-Rho激酶信号通路相关性研究

目的初步研究Rho A-Rho激酶信号通路在模拟微重力(Simulated Microgravity,SMG)影响人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,h DPSCs)矿化过程中的作用。方法将经酶消化法分离、纯化后的人牙髓干细胞体外扩增培养,以1×106细胞接种于PLGA支架上,分别于模拟微重力下及普通重力下矿化诱导液中培养,72 h后收集细胞,采用Western Blot检测Rho A蛋白表达;此外,在重力条件下采用Rho激酶抑制剂Y-27632,以矿化诱导液培养组作为对照组,检测矿化诱导3、5、7、10d两组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)活性变化,采用Western Blot检测矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白牙本质基质蛋白(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达,采用茜素红染色法检测矿化诱导21 d,矿化结节形成水平。结果模拟微重力下,人牙髓干细胞中Rho A蛋白的表达下调;在普通重力矿化诱导条件下,加入抑制剂Y-27632后,各时间点细胞AKP表达水平均较对照组有所降低;矿化诱导10 d,成牙本质相关蛋白DSP、DSPP、DMP-1表达明显下调,矿化诱导21 d,矿化结节形成同样有所减少。结论模拟微重力下,Rho A蛋白表达水平下调;抑制Rho激酶的表达,可降低h DPSCs矿化能力,提示Rho A-Rho激酶信号通路可能参与模拟微重力对h DPSCs矿化能力的影响。     

正常及炎症状态人牙髓中八聚体结合转录因子4B的表达

目的 研究人正常及炎症牙髓组织中八聚体结合转录因子4B(Oct-4B)的表达特点,检测大肠杆菌脂多糖刺激后人牙髓细胞( HDPCs)中Oct-4B的表达水平,以探讨Oct-4B在牙髓炎症中的可能作用.方法 采用免疫组织化学和反转录聚合酶链反应( RT-PCR)方法检测正常及炎症牙髓组织中Oct-4B的表达情况.RT-PCR检测1 mg/L脂多糖刺激HDPC 24、48、72 h后Oct-4B和热休克蛋白70(HSP70)表达水平的变化.结果 正常牙髓组织中未检测到Oct-4B的表达,炎症牙髓组织病灶处牙髓成纤维细胞和炎症细胞胞质中Oct-4B表达强阳性.炎症牙髓组织中Oct-4B mRNA水平显著高于正常牙髓组织(P<0.05).脂多糖刺激48.72 h后,HDPC中Oct-4B和HSP70 mRNA水平同步上调(P<0.05).结论 Oct-4B在炎症牙髓组织中高表达,且脂多糖刺激可上调牙髓细胞内Oct-4B表达,Oct-4B可能参与牙髓炎症修复过程.     

慢性牙周炎患者和健康者非刺激性全唾液中的差异蛋白比较

目的 比较慢性牙周炎患者和健康对照者非刺激性全唾液(WUS)中的差异表达蛋白.方法 采集5名慢性牙周炎患者和5名健康者的WUS,利用双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白,将二者之间的差异蛋白质点进行基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱鉴定.结果 通过软件对2组样品的双向胶上的点进行对比分析,发现17个差异点,经质谱鉴定明确...     

不同状态下牙髓组织蛋白质表达的二维电泳分析

目的 利用蛋白质组技术探讨牙髓对中龋和热刺激的反应.方法 用双向电泳得到牙髓在中龋和热刺激状态下的二维电泳图谱,对差异点进行质谱鉴定.结果 经Image Master2-D Platinum 5.0软件分析显示,正常牙髓和中龋牙髓的蛋白表达无显著差异;热损伤牙髓有2个蛋白点缺失,8个蛋白点下调.质谱分析鉴定了7种蛋白质.结论 本实验条件下,中龋牙髓的蛋白质表达与正常牙髓无显著差异,热刺激可造成部分蛋白表达的下调.     

人甲状旁腺激素1—34对培养的人牙髓细胞PTH—PTHrP受体mRNA表达的影响

目的: 观察人甲状旁腺激素1-34(human Parathyroid hormone 1-34,hPTH1-34)对唧-PTHrP(Parathyroid hormone-Parathyroid hormone related protein)受体mRNA在体外培养的人牙髓细胞中表达的影响,探讨PTH影响牙本质形成和矿化的机制.方法:将培养的第4代牙髓细胞分为两组:实验组培养基加入含33.3 nmol/L hPTH1-34,在其培养的第5,10,15,20天提取总RNA,以RNA为模板在逆转录酶作用下合成cDNA,加入特异引物进行PCR扩增,同时扩增β-肌动蛋白的eDNA作为半定量RT-PCR的内参照,对PCR产物进行半定量分析.结果:在人牙髓细胞培养的5、10 d,对照组和实验组的PTH-PTHrP受体mRNA水平均较低,10 d以后PTH-PTHrP受体mRNA水平开始升高,实验组高于对照组,差异有统计学意义.结论:PTH-PTHrP受体的表达与牙髓细胞的分化密切相关;hPTH1-34可以促进PTH-PTHrP受体的表达,PTH可能通过促进PTH-PTHrP受体的表达或与PTH-PrHrP受体结合影响牙本质的形成和矿化.     

人牙髓细胞与牙龈成纤维细胞差异表达基因的克隆及特征分析

目的批量克隆人牙髓细胞（HDPC）与人牙龈成纤维细胞（HGF）的差异表达基因并对其特征进行分析,研究HDPC的生物学特性。方法体外培养HDPC和HGF,应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF的cDNA消减文库,批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序,使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较。结果经过序列测定,获得12个差异表达基因的序列,经BLAST分析有2个为未知基因。在已知基因中,含有4个与细胞信号转导机制相关的基因;2个与细胞转运机制相关的基因（包括细胞膜及细胞核膜转运）;2个与细胞RNA剪接机制相关的基因。结论HDPC的生物学特性是由某些特定基因的差异表达所决定的,其生长、分化机制可能与相对旺盛的蛋白合成及分泌活性相关。     

Notch信号通路在牙髓和牙周细胞矿化及组织损伤修复中的调控作用研究

目的 探讨Notch信号通路在人牙髓细胞(dental pulp cells, DPCs)和牙周韧带细胞(periodontal ligament cells, PDLCs)向成牙本质/成骨样细胞分化及组织损伤修复中的调控作用.方法 酶消化法分离培养DPCs和PDLCs,实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Notch信号通路相关基因Notch1、Notch2、DLL1和DLL3 mRNA在DPCs和PDLCs矿化诱导过程中表达水平变化;建立大鼠牙髓和牙周联合损伤动物模型,观察4周后牙髓牙本质复合体及牙周附着装置修复情况,免疫组织荧光染色检测Notch1在牙髓和牙周联合损伤修复动物体内模型的表达和分布.结果 DPCs和PDLCs经矿化诱导,Notch1、Notch2、DLL1 mRNA表达均上调,与对照组间的差异有统计学意义(P<0.05);DLL3 mRNA表达上调,与对照组间差异无统计学意义(P>0.05).免疫荧光示Notch1蛋白在损伤处的新生牙髓及牙周韧带组织细胞浆强表达,而在正常牙髓及牙周韧带组织基本无表达.结论 在DPCs和PDLCs诱导成牙本质/成骨分化的过程中,Notch1、Notch2、DLL1呈现相似的表达变化趋势上调,Notch1信号在牙髓及牙周损伤修复的新生组织明显激活,提示Notch信号通路参与DPCs和PDLCs成牙本质/成骨分化,且在牙髓牙本质复合体和牙周附着装置的损伤修复中起重要的调控作用.