基于PCR-DGGE法分析酱菜中乳酸菌群落结构

文章以不同含盐量的酱菜为对象,通过聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术研究酱菜中乳酸菌的多样性。使用Quantity One软件进行DGGE凝胶图谱条带分析,得到酱菜样品中乳酸菌群落结构特征。研究结果说明,两种酱菜体系乳酸菌丰富度和多样性指数差异显著(P0.05),均匀度无显著差异(P0.05)。通过回收DGGE电泳带,经过克隆后测定碱基序列,与GenBank序列对比鉴定,JB样品即高盐酱菜的PCR-DGGE泳带有3条,经鉴定,与γ-变形杆菌(γ-Proteobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、非培养乳酸杆菌(Uncultured Lactobacillus)相似度分别为95%、97%、96%。JA样品即低盐酱菜的PCR-DGGE泳带有4条,经鉴定,与乳酸杆菌(Lactobacillus)、非培养乳酸杆菌(Uncultured Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus sp.)、γ-变形杆菌(γ-Proteobacterium)相似度分别为97%、95%、97%、92%。研究结果表明食盐浓度影响微生物的群落结构。     

应用PCR-DGGE技术分析发酵鸭肉中细菌多样性

对不同前处理的发酵鸭肉应用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术进行细菌菌群分析。以细菌通用引物扩增16S rDNA基因可变区V3区,进行DGGE上样,从而获得可以表征细菌群落结构的图谱。研究结果表明,热炒后发酵和未热炒发酵的2个样品菌群差异比较大,但它们都有乳杆菌(Lactobacillus alimentarius),在发酵过程中乳酸菌是主要优势菌,而且未热炒发酵相对于热炒后发酵的样品各菌群数量比较明显。热炒后发酵的鸭肉中存在乳酸菌属(Lactobacillus sp),赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp),乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),葡萄球菌属(Staphylococcus stepanovicii),丛毛单胞菌属(Comamonas sp)。未热炒发酵的鸭肉中有赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp),普氏厌氧球菌(Anaerococcus prevotii),戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus),吲哚嗜胨菌(Peptoniphilus indolicus),乳杆菌(Lactobacillus alimentarius)。在发酵鸭肉中还检测到了3种不可培养菌Uncultured Lactobacillus sp、Uncultured bacterium、Uncultured Comamonas sp,这在鸭肉发酵过程中的作用还有待进一步研究和验证。PCR-DGGE能快速地反应发酵鸭肉中细菌群落结构。     

腌菜中细菌多样性研究及乳酸菌分离鉴定

以恩施地区采集的腌菜为研究对象,采用高通量测序技术（HTS）与变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术相结合的方法对其中所 含细菌和乳酸菌多样性进行研究,并采用平板稀释涂布法对乳酸菌进行分离鉴定。结果表明,腌菜样品中含量最高的优势细菌门 为硬壁菌门（Firmicutes）,其平均相对含量高达97.09%。优势细菌属为Lactobacillus、Weissella、Leuconostoc、Vibrio、Pseudomonas、 Psychrobacter和Flavobacterium,其中Lactobacillus的平均相对含量高达82.37%;通过变性梯度凝胶电泳技术从样品中检测出的乳酸 菌 有 Lactobacillus sakei、Lactobacillus insicii、Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis、Lactobacillus plantarum subsp. plantarum 和 Lactobacillus acetotolerans;分离鉴定及保藏的乳酸菌中有L. plantarum 7株,L. alimentarius 2株,L. curvatus和L. brevis各1株以及L. sakei 4株。 由此可见,虽然Lactobacillus为腌菜样品中的优势菌,但乳酸杆菌的构成在样品间存在一定的差异。     

基于DGGE方法分析低氯化钠浓度对发酵白菜原核微生物群落结构的影响

为了探究氯化钠浓度对发酵白菜体系中微生物群落结构的影响。以4%、6%和8%氯化钠浓度发酵白菜,通过DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)方法及Quantity One软件分析原核微生物群落结构;通过回收DGGE电泳中荧光强度强、不同时间差异的电泳带,经克隆后测定碱基序列、与Gen Bank库序列对比鉴定。结果表明6%氯化钠浓度发酵白菜微生物多样性指数H(Shannon)、丰富度指数R(Species Richness)在发酵全过程中低于4%、8%组,均匀度指数E(Species Evenness)较4%、8%组的稳定。说明氯化钠浓度6%的发酵泡菜在整个发酵期微生物群落结构相对稳定且微生物种类小于氯化钠浓度4%、8%组。从DGGE电泳带荧光强度和存在的时间可知:在氯化钠浓度6%的发酵白菜体系中,Leuconostoc citreum(柠檬明串珠菌)、Uncultured bacterium(非培养细菌)、Leuconostoc mesenteroides(肠系膜明串珠菌)是白菜发酵中期、后期的优势微生物,Leuconostoc citreum(柠檬明串珠菌)、Leuconostoc mesenteroides(肠系膜明串珠菌)是乳酸菌。氯化钠浓度4%和8%发酵白菜中乳酸菌未成为优势微生物。说明氯化钠浓度6%较4%和8%发酵白菜原核微生物群落的变化接近于自然发酵蔬菜微生物变化规律,研究结果表明6%氯化钠浓度有利于白菜的发酵。     

绍兴黄酒发酵过程中有机酸及产酸细菌的初步研究

采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析了绍兴黄酒发酵过程中有机酸组成及动态变化情况,运用变性梯度凝胶电泳技术(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)分析了细菌群落结构变化,以纯培养结合分子生物学的方法分离、鉴定了产酸细菌,并对其发酵特性进行了研究。结果表明,乳酸、乙酸和柠檬酸是黄酒发酵过程中产生的主要有机酸,其含量占总有机酸的55%以上。有机酸的含量随发酵的进行呈递增趋势,柠檬酸、草酸、酒石酸、乳酸、苹果酸、丙酮酸和乙酸含量增幅较大(90%~385%),琥珀酸、富马酸、α-酮戊二酸增幅较小(28%~34%)。DGGE分离及测序结果表明,黄酒发酵过程中主要的细菌有乳酸杆菌(Lactobacillus)、糖多孢菌(Saccharopolyspora)、葡萄球菌(Staphylococcus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、链霉菌(Streptomyces sp.)以及不可培养细菌(Uncultured bacterium)等。经16S r DNA序列分析鉴定及发酵特性研究,产酸细菌主要为乳酸杆菌,其中植物乳杆菌占70%,属于异型发酵乳酸菌。     

冷却牦牛肉贮藏过程中优势菌的 PCR-变性梯度凝胶电泳分析

应用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究托盘保鲜膜包装的冷却牦牛肉在4℃贮藏过程中的微生物多样性及其动态变化.直接从样品中提取细菌总的DNA,采用降落PCR扩增16S rDNA的V3可变区序列,再通过DGGE得到动态变化的指纹图谱,并对主要条带进行测序分析.结果表明:检测到的优势腐败菌为Pseudomonas sp.(假单胞菌)、Lactococcus sp.(乳球菌)、Acinetobacter sp.(不动杆菌)、Brochothrix thermosphacta(热死环丝菌)、Enterobacteriaceae bacterium(肠杆菌科细菌),此外还检测到Uncultured Citrobacter sp.(非培养的柠檬酸杆菌)和Staphylococcus sp.(葡萄球菌)     

乳酸菌Lact.1、Lact.2和Lact.3在发酵碎鲜辣椒中的应用研究

Lact.1、Lact.2和Lact.3是从自然发酵辣椒中选育出的具有广谱、高效抑菌活性和良好发酵性能的三株乳酸菌.用它们对辣椒进行发酵实验,通过正交试验得出:三株乳酸菌用于辣椒发酵时的最佳接种量分别为1%、1%、0.5%,食盐的最佳添加量为10%.测定自然发酵辣椒与接种发酵辣椒的发酵周期和亚硝酸盐的含量,结果表明:自然发酵碎鲜辣椒的发酵周期明显长于接种发酵碎鲜辣椒,亚硝酸盐含量明显高于接种发酵碎鲜辣椒.     

16S rRNA基因序列方法分析传统发酵菜中乳酸菌多样性

以发酵甘蓝卤水中微生物的总DNA为模板,用扩增革兰氏阳性菌16S rRNA基因的方法研究中国发酵甘蓝菜卤中乳酸菌的多样性。获得了42种含有1.5kb的16S rRNA基因插入核苷酸片段的克隆菌。利用克隆菌落核苷酸的部分序列和NCBI数据库中搜索到的相似序列进行对比后作出鉴定,结果得出4种独特的菌落,鉴定为Lactobacillus acidifarinae、植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)、融合乳杆菌(Weissella confusa)和足球菌属(Pediococcus sp.)。此外,还发现两种非核糖体序列。用这种分子方法发现了常规分离培养技术未鉴定的乳酸菌,如Lactobacillus acidifarinae。     

非培养方法研究榨菜中酵母菌的多样性

榨菜作为一种发酵食品,它的制作过程中酵母菌发挥了不可或缺的作用,为了研究榨菜中酵母菌的多样性,该实验以市售爽口榨菜和乌江榨菜为原材料,采用分子生物学方法 PCR-DGGE的非培养方法进行测定,通过变性梯度凝胶电泳DGGE技术对聚合酶链式反应PCR扩增出来的DNA进行分离,从而得到不同的基因序列;通过UPGAME算法对榨菜中酵母菌进行相似性聚类分析。经序列分析得到爽口榨菜(SZ)中有两种不同序列的酵母菌,分别与Candida tropicalis,Pichia fermentans这两种酵母菌的同源性为95%、88%,而在乌江榨菜(WZ)中也有两种不同序列的酵母菌,WZ中的第一条条带的变性浓度与SZ中的第一条条带相同,故分析可知为同一种酵母菌,WZ中的第二条条带的酵母菌与Saturnispora mendonce的同源性为95%。通过Microsoft Excel软件计算其多样性指数、丰富度、均匀度可知,爽口榨菜(SZ)中的酵母菌多样性指数与丰富度都比乌江榨菜(WZ)中的数值大,但均匀度却比WZ小。     

腌制食品中降解亚硝酸盐的乳酸菌分离与鉴定

从多种传统腌制蔬菜中分离到12株乳酸菌,对它们的16S核糖体基因进行扩增测序,根据序列的同源性鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、沙克乳杆菌（Lactobacillus sakei）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。对其生化特征以及亚硝酸盐耐受性和降解能力进行了研究和比较,最终筛选出1株各项指标优良,且能快速降解亚硝酸盐的植物乳杆菌J-10,该菌降解亚硝酸钠的最适温度为37℃,最适pH值为6．2,在添加0．25mg／mL的亚硝酸钠的培养液中培养24h后,亚硝酸盐降解率为99．2％。     

PCR-DGGE技术分析腌制麻竹笋中微生物多样性

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）技术对盐质量浓度5 g/100 mL和19 g/100 mL腌制麻竹笋的微生物区系进行研究。结果表明,经DNA提取、巢式PCR、DGGE电泳和克隆测序后,从低盐质量浓度（5 g/100 mL）腌制笋中分离出4 条明显的亮带,经鉴定分别为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、乳球菌属（Lactococcus sp.）、魏斯氏菌属（Weissella sp.）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）;从高盐质量浓度（19 g/100 mL）腌制笋中分离出5 条明显的亮带,经鉴定分别为绿色气球菌（Aerococcus viridans）、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）、未得到培养的细菌（unculturedbacterium）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.）;低盐腌制笋的优势菌多为益生菌,而高盐腌制笋的优势菌则多为抗性较强的菌。基于16S rDNA的PCR-DGGE技术为分析腌制麻竹笋中微生物多样性提供了一条可靠、快速的有效途径。     

多电极复合法快速测定榨菜食盐含量

建立一种基于多电极复合的榨菜食盐快速测试方法。首先设计制作由离子选择电极、温度传感器、参比电极、信号处理模块、单片机模块等组成的多电极复合系统硬件,然后建立钠离子、氯离子预测模型以及数据处理软件程序,最后使用该系统对3 种涪陵榨菜进行食盐测定,并与传统测试法进行对比。结果表明,多电极复合法与传统法测定结果的平均相对误差小于5%,相对标准偏差小于2.0%,t检验结果无明显差异;单次测试时间小于20 s,该方法可作为榨菜食盐测定的快速方法。     

PCR-DGGE分析东北自然发酵酸菜中乳酸菌多样性

为了探明传统的自然发酵白菜中乳酸菌的多样性及其优势乳酸菌群,试验主要采用变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE),对5份采自我国东北地区利用传统方法制作的自然发酵酸菜样品中的乳酸菌多样性进行分析。结果表明,5份传统发酵酸菜样品共鉴定出了9个乳酸菌种,呈现出丰富的多样性。其中,植物乳杆菌、短乳杆菌、清酒乳杆菌和弯曲乳杆菌是酸菜样品的优势菌群,此外,还发现了片球菌、乳酸乳球菌、Hammesii乳杆菌和Odoratitofui乳杆菌,而Hammesii乳杆菌和Odoratitofui乳杆菌在此前文献报道中利用传统方法没有分离到。     

离子电极法快速测定榨菜中硝酸盐含量

建立一种采用离子电极快速测定榨菜中硝酸盐含量的方法。首先组建由硝酸根离子选择电极、参比电极、离子计和计算机构成的测试仪器,然后分析温度、离子强度调节剂及干扰离子对测试的影响,并建立标准曲线和校准方程,最后采用离子电极法测定榨菜成品液和榨菜脱盐液中的硝酸盐含量,并与紫外分光光度法进行比较。结果表明：温度、离子强度调节剂及干扰离子对榨菜中硝酸盐含量的测试影响较小;离子电极法测定结果与紫外分光光度法测定结果的总体平均相对误差为4.247%,相对标准偏差小于2.0%,且t检验的显著性水平大于0.05,2 种方法测试结果无明显差异,并且离子电极法测试时间小于15 s。本方法可代替紫外分光光度法作为榨菜中硝酸盐含量的快速测定方法。     

SSCP方法的条件优化与榨菜低盐腌制微生物多样性分析

应用单链构象多态性(SSCP)方法研究榨菜低盐腌制条件下的微生物群落结构与变化。研究了凝胶质量浓度、电泳前处理、银染操作条件对SSCP分析方法的影响。结果表明,在凝胶质量浓度为22 g/dL、丙烯酰胺与双丙烯酰胺质量比为29∶1,并加入体积分数6%的甘油,4℃条件下1×TBE缓冲液中250 V电泳18 h,通过强碱性显影液和甲醛作还原剂的银染方法显色,可以获得理想的SSCP图谱。对榨菜低盐腌制不同时期样品的SSCP图谱分析结果,发现在榨菜腌制初期优势菌群为肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides),随后转变为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)占优势;腌制后期主要存在的优势菌群为植物乳杆菌和Lactobacillus versmoldensis,结合感官分析证实这些优势乳酸菌对保持制品高品质具有功能作用。     

青菜腌制过程中腐败表层细菌的多样性分析与群落演替

通过构建16S rRNA基因文库揭示青菜腌制过程中腐败表层细菌群落构成,利用Shannon-Weaver（H）、Chao、ACE、Simpson、覆盖度和相关性指数分析群落的多样性及演替关系。系统发育分析显示,从样品中获得的16S rRNA基因序列分别被归为Vibrio、Halomonas、Pseudoalteromonas、Shewanella、Marinomonas、Geobacillus、Pseudomonas、Psychrobacter、Cobetia、Oceanobacillus、Pantoea和Lactobacillus属。其中能够产生亚硝酸盐的致病性Vibrio属细菌为腐败表层卤水中的优势菌,分别占腌制7、22、60 d细菌总数的45.8%、74.2%、44.9%,Pseudoalteromonas、Shewanella、Pseudomonas等属腐败性细菌主要分布在第7天的样品中,受高盐环境的影响,Cobetia、Halomonas等嗜盐菌和Lactobacillus属细菌的数量随时间的延长逐渐增多。7、22、60 d样品菌群相关性系数由0.5131降至0.4064,随之又升高至0.8168。结果表明：腐败表层卤水中细菌在青菜腌制过程中介导腐败并产生有害成分,其群落结构随腌制过程演替。     

变性梯度凝胶电泳法初步解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构

为解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构和种类,对渥堆过程中不同时间段细菌16S rDNA 的V3可变区进行扩增,对细菌变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）图谱中条带进行克隆、测序和序列比对。结果表明：黑毛茶在渥堆过程中以渥堆24 h为分界点,前后各自细菌群落结构相似,但前后的差异较大;从16S rDNA 的V3可变区比对结果证明黑毛茶渥堆过程中有诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属及不可培养的ε-变形菌、腐败螺旋菌属、黏球菌属、根瘤菌属和未知分类地位的不可培养细菌6 种。采用DGGE指纹图谱能更全面、更真实地反映黑毛茶渥堆发酵过程中细菌群落的结构和多样性变化。     

梅干菜和腌制雪菜细菌菌群多样性分析

为探讨传统腌制发酵蔬菜制品的菌群多样性,采用Illumina Miseq高通量测序技术,对宁波地区梅干菜半成品、成品和腌制雪菜成品进行分析。结果表明,梅干菜半成品、成品和腌制雪菜成品中相对丰度大于1.0%的菌属分别有8、13、5属,其中乳杆菌属（Lactobacillus）在3种产品中相对丰度均较高,分别为31.70%、9.51%、78.08%;假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）仅在梅干菜半成品和腌制雪菜成品中检出,相对丰度为4.60%和1.81%;梅干菜半成品的主要优势菌属还有嗜盐单胞菌属（Halomonas）和梭状芽孢杆菌属（Clostridium IV）;梅干菜成品的主要优势菌属还有慢生芽孢杆菌属（Lentibacillus）、交替芽胞杆菌属（Alteribacillus）、嗜盐球菌属（Halococcus）、海单胞菌属（Oceanimonas）、枝芽孢菌属（Virgibacillus）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、钠白菌属（Natrialba）和代尔夫特菌属（Delftia）等,相对丰度分别为11.85%、11.41%、9.64%、9.46%、8.86%、6.25%、5.21%和5.13%;其余优势菌属相对丰度在1.23%~2.60%之间。乳杆菌属是发酵蔬菜的主要优势菌,腌制方式、腌制阶段的蔬菜产品菌群多样性差异较大,干法腌制比泡制蔬菜产品的菌群结构和多样性更为复杂。本研究结果为传统腌制蔬菜微生物资源的挖掘及其工业化利用提供了理论参考。     

榨菜低盐腌制过程的微生物群落结构与动态分析

采用平板菌落计数法及PCR-SSCP(单链构象多态性)方法,分析低盐榨菜腌制过程中微生物群落结构及数量的变化情况;对通过SSCP方法得到的图谱中11条优势条带序列进行比对,结果表明,在榨菜腌制发酵初期,肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)为主要的优势菌群;随着腌制环境条件的变化,出现植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis);在腌制保存后期起主导作用的微生物为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和Lactobacillus versmoldensis;榨菜腌制保藏过程中pH值始终呈下降趋势,乳酸菌数量经历了一个先急速上升后逐渐趋缓,并稳定在一定数量的过程.对优化条件下制得的不同阶段的高品质低盐腌制榨菜样品进行微生物结构及分布分析,证实了不同乳酸菌的作用.     

利用非培养技术研究古井贡酒大曲中的细菌群落结构

淡雅型白酒古井贡酒大曲中的微生物群落结构一直未在分子水平上得到解析。本文采用构建16s rDNA克隆文库的非培养方法对古井贡酒中温大曲和高温大曲进行细菌群落结构及其多样性研究。所有克隆菌株归为36个OUT,分别属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和一些未培养菌类,其中厚壁菌门占多数。总体来说,中温大曲明显要比高温大曲细菌多样性更丰富一些。高温大曲的菌种相对比较单一,绝大多数为高温放线菌Thermoactinomyces sanguinis,而且仅存在于高温大曲中,占到高温大曲表面菌群的79.5%,高温大曲曲心菌群的98.5%。中温大曲的两个样本差距比较大。样本S1的优势菌为枝芽孢菌属(Virgibacillus sp.),占85.3%,另外还有少量的未培养菌类(12.9%)。中温大曲S2的细菌多样性比较丰富,优势菌属为乳杆菌属Lactobacillus(25.2%)、葡萄球菌属Staphylococcus(14.3%)、芽孢杆菌属Bacillus(13.4%)和各种未培养菌类(16.8%)。古井大曲中存在大量潜在新种,需要进一步鉴定。