人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子cDNA的克隆与表达

目的：克隆与表达人及大鼠胶质细胞源性神经营养因子ｃＤＮＡ。方法和结果：用逆转录－聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了人及大鼠ＧＤＮＦ成熟序列的ｃＤＮＡ片段，并将人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ重组到表达质粒ｐＢＰＬ中，分别在大肠杆菌中获得了较高表达。结论：人及大鼠ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ的克隆与表达获得成功，为研究ＧＤＮＦ在神经损伤修复中的作用奠定了基础。     

胰岛素样生长因子结合蛋白－3基因在乳腺癌中的表达

我们应用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法、组织原位分子杂交、细胞生长曲线和ＤＮＡ合成等技术，检测９例人类乳腺癌细胞株和２０例乳腺癌标本中胰岛素样生长因子结合蛋白－３（ＩＧＦＢＰ－３）基因的蛋白质和ｍＲＮＡ水平的表达，研究其生物学作用。结果：①在乳腺癌细胞株中，雌激素受体阴性（ＥＲ－）者，分泌大量的ＩＧＦＢＰ－３，而雌激素受体阳性（ＥＲ＋）者不分泌ＩＧＦＢＰ－３；②在乳腺癌病人标本中，ＥＲ（－）者ＩＧＦＢＰ－３ｍＲＮＡ的定量表达明显高于ＥＲ（＋）者（Ｐ＜０．００５）；③ＩＧＦＢＰ－３能明显增强乳腺癌ＭＣＦ－７细胞株胰岛素样生长因子－Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）所致的细胞生长和ＤＮＡ合成作用。结论：我们认为ＩＧＦＢＰ－３基因蛋白质和ｍＲＮＡ的表达水平有可能成为乳腺癌患者的预后指标。     

类胰岛素生长因子I的克隆,表达,分离纯化与活性检测

把类胰岛类生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）ｃＤＮＡ重组于酵母游离体型表达载体ＹＥｐＨＣ８，转子酵母后获得了ＩＧＦ－Ｉ的表达，并经Ｂｉｏ－Ｒｅｘ７０和Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ１０分离纯化后进行了重组蛋白的活性检测。     

胰岛素样生长因子结合蛋白—3基因在乳腺癌中的表达

我们应用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ法，组织原发子杂交，细胞生长曲线和ＤＮＡ的合成等技术，检测９例人类乳腺癌细胞株和２０例乳腺癌标本中胰岛素样生长因子结合蛋白－３（ＩＧＦＢＰ－３）基因的重蛋白质和ｍＲＮＡ水平的表达，研究其生物学作用，结果：（１）在乳腺癌细胞株中，雌激素受体阴性（ＥＲ－）者，分泌大量的ＩＧＦＢＰ－２而雌激素受体阳性（ＥＲ＾＋）者不分泌ＩＧＦＢＰ－３；（２）在乳腺癌病人标本中，ＥＲ（－）者     

雌,雄激素对鼠前列腺组织中胰岛素样生长因子I及其受体mRNA表…

目的：探讨雌、雄激素对鼠前列腺组织中胰岛素样生长因子Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）及其受体ｍＲＮＡ表达的影响。方法：采用地高辛标记探针的原位杂交技术并结合图象分析系统研究了正常组、去势组、雌激素组及去势加雄激素组鼠前列腺组织中ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－Ｉ受体基因表达情况。结果：ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ－Ｉ受体ｍＲＮＡ在正常鼠前列腺组织中均有表达；去势鼠腹侧前列腺ＩＧＦ－ＩｍＲＮＡ表达量较正常明显降低，而ＩＧＦ－Ｉ受体ｍＲＮ     

转化生长因子β1在cos—7细胞中的短暂表达

本文将人转化生长因子β１（ｈＴＧＦβ１）全长ｃＤＮＡ克隆至真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ的ＮｈｅＩ位点，利用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法将ｈＴＧＦβ１载体导入ｃｏｓ－７细胞中。实验结果表明：所构建的表达载体在ｃｏｓ－７细胞内有转录水平的表达，这为我们进一步研究ｈＴＧＦβ１在其它细胞内的表达与调控之间的关系奠定了基础。     

t—PA指形区,上皮生长因子样区缺失突变体cDNA克隆的构建及…

研究ｔ－ＰＡＦ区和ＥＧＦ区在ｔ－ＰＡ郭清中的作用。利用本室构建的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ克隆，采用片段重组技术缺失突变指形区，上皮生长因子样区和部分三角区，组装了由逆转录病毒长末端重复顺序启动和终止的ｐＭＤＧＢ△ＦＥ表达质粒。     

反义IGF－IR逆转录病毒载体的构建及抑制血管平滑肌细胞增殖的初步观察

反义ＩＧＦ－ＩＲ逆转录病毒载体的构建及抑制血管平滑肌细胞增殖的初步观察张吉辉，董薇，邱京欣，赵民清北京医科大学心血管基础研究所李岱宗，汤健，周爱儒应用重组ＤＮＡ技术，将ＩＧＦ－ＩＲβ亚基ｃＤＮＡ定向插入逆转录病毒载体ｐＤｏｌ，构建出反义ＩＧＦ－ＩＲ逆...     

人bcl—2基因反义cDNA探针的制备和地高辛标记

目的：制备地高辛标记的ｂｃｌ－２基因的反义链ｃＤＮＡ探针。方法首先从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应得到ｂｃｌ－２特异的ｃＤＮＡ片段，然后以此模板利用ＤＩＧ－ｄＵＴＰ作另一轮非对称ＰＣＲ扩增。结果：合成了灵敏，特异的ＤＩＧ－标记的ｂｃｌ－２反义单链探针。结论：本文报道的方法是制备ＤＩＧ－标记的单链的ｃＤＮＡ探针的一个有效手段。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达质粒的构建

目的：构建人碱性成纤维细胞生长因子（ｈｂＦＧＦ）基因真核表达质粒,为深入研究ｈｂＦＧＦ在组织修复中的分子调节机制及临床应用提供物质基础。方法：含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ的ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒于大肠杆菌ＪＭ１０９内扩增;提取及纯化ｐＵＣ１８－ｈｂＦＧＦ质粒;经ＤＮＡ序列分析所含ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ;限制性酶切ｈｂＦＧＦ ｃＤＮＡ片段,连接酶连接到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ｎｅｏ内,克隆出真核表达质     

重组人骨形成蛋白2基因在大肠杆菌中的克隆

目的：在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因,方法：由人成骨细胞中提取细胞总RNA,利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA;将获得基因片段重组到pCI质粒中,转化到大肠杆菌Top10后挑选克隆,利用限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定重组质粒。结果：质粒DNA酶切分析及核酸序列分析证实,获得的基因片段为人BMP2全编码序列,结论：克隆获得人骨形成蛋白2基因,为表达骨形成蛋白2奠定了基础。     

人血管紧张素转换酶2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆人血管紧张素转换酶2基因(ACE2),并构建其真核表达载体。方法用Trizol试剂从人肺组织提取总RNA,然后经逆转录得到人ACE2的cDNA。半巢式PCR方法扩增人ACE2基因后,先进行T-A连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,接种含IPTG和x-Gal平板筛选重组子,并进一步亚克隆至真核表达质粒载体pcDNA3.1( )。经PCR扩增、酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果获得了人ACE2的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。结论人血管紧张素转换酶2是SARS冠状病毒的功能受体,与SARS冠状病毒Spike蛋白上的受体结合域相结合,在SARS冠状病毒感染和传播中起重要作用,本工作为研究SARS冠状病毒感染及跨种属传播机制奠定了基础。     

人单核细胞趋化蛋白受体5的基因克隆及该基因超家族成员氨基酸结构

目的：获取有重要生物功能的人单核细胞趋化蛋白受体５（ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５,ｈｕＣＣＲ５）。方法：从人ＰＢＭＣ中提取总ＲＮＡ和ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ,而后经反转录合成ｃＤＮＡ第一链,再以ＰＣＲ扩增出ｈｕＣＣＲ５ ｃＤＮＡ并插入融合表达载体ｐｃＤＮＡ３．０的ＢａｍＨⅠ和ＨｉｎｄⅢ位点,转化大肠杆菌ＴＧ－１,挑取克隆,酶切鉴定,序列分析。结果：克隆出长度为１０５６ｂｐ,编码３５２个氨基酸的ｈｕＣＣＲ５ ｃＤＮＡ。并分析证明与该基因超家族氨基酸有８０％同源性,与国外发表资料比较有３个碱基突变。结论：克隆出人单核细胞趋化蛋白５受体,为今后基础研究提供了较有用的材料。     

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

目的：分离新的与B细胞活化相关基因。方法：采用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选。结果：差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列(expressed sequence tag,EST)62条,其中主要在静止B细胞表达的有32条,在活化B细胞表达的有30条,经Northern 杂交验证,共获得阳性的片段25条,以在活化B细胞中高表达的EST30为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库后获得1个新的全长为2048bp的cDNA克隆,该克隆含有1个630bp的开放读码框,其推断的氨基酸序列N端与酵母的动力蛋白KAR3部分同源,结论：克隆了1条可能与B细胞活化相关的新基因。     

cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene

Background This investigation was undertaken to obtain differentially expressed genes related to human glioma using cDNA microarray and the characterization of one novel full-length gene. Methods Total RNA was extracted from human glioma tissues and normal brain tissues, and mRNA was used to make probes. After hybridization and washing, the results were scanned using a computer system. The gene named 681F05 clone was an expressed gene to human glioma through four-time hybridization and scanning. Subsequently northern blot analysis was performed by northern blot, 5‘RACE and bioinformatics. Results Fifteen differentially expressed genes to human glioma were obtained through four-time hybridization and scanning. Northern blot analysis confirmed that 681F05 clone was low-expressed in human brain tissues and over-expressed in human glioma tissues. The analysis of BLASTn and BLASTx showed that 681F05 clone is two cDNA clones encoding two novel proteins that are highly identified to the cyclophilin isoform 10 of C. Elgans, respectively. Sequence analysis revealed the two cDNA clones are two different splicing variants of a novel cycophilin-like gene (PPIL3a and PPIL3b). Conclusions cDNA microarray technology can be successfully used to identify differentially expressed genes. The novel full-length gene of human PPIL3 may be correlated with the formation of human glioma.     

人胚胎脑多巴胺D_2受体基因的克隆

为了克隆人多巴胺D2 受体 (D2 R)基因以用于帕金森病的治疗 ,从人胎脑中提取总RNA ,并逆转录成cDNA ;设计一对引物用PCR方法扩增目的cDNA片段 ,并将其重组于 pGEM T载体中 ,酶切鉴定插入片段后 ,进行全序列测定。结果表明从人胎脑纹状体扩增出至少 2种长度的cDNA片段 ,其中一个片段全长 1 4 4 5bp ,序列与GenBank(NM0 0 0 795 )登录的序列完全相同 ;另一片段为 1 30 5bp ,在第 6外显子开始处有 1 4 0bp的缺失 ,与已知的D2 R 3种转录体均不相同 ,可能为一种新的D2 R转录体。     

带信号肽人VEGF165 cDNA克隆

目的：克隆带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ,以便进一步在真核系统表达人ＶＥＧＦ１６５蛋白或基因治疗。方法：设计引物;从人胎脑ｃＤＮＡ文加ＰＣＲ扩增目的基因;ＤＮＡ片段回收与酶切鉴定;与Ｍ１３ｍｐ１８重组;单链序列测定。结果：克隆片段与人ＶＥＧＦ１６５ｃＤＮＡ序列一致。结论：克隆ＤＮＡ片段为带信号肽人ＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ。     

载脂蛋白CⅢcDNA克隆的筛选,鉴定及其探针的制备

Four of positive clones were obtained by three runs of screening the cDNA library of human liver with rabbit antihuman apolipoprotein (apo) CIII IgG. One of them was identified to be the positive clone of apoC III cDNA by restriction endonuclease map studies of the cDNA insert fragment and by Western blot analysis of the expression products. The apoCIII cDNA-gamma gt11 recombinant DNA prepared from the positive clone can be used in RNA-dot blot analysis as apoCIII cDNA probe. And the apoCIII cDNA clone can be also used to produced apoCIII peptide under the induction of isopropyl-beta-D-thiogalactoside. The apoCIII peptide, after purification, has a lot of use in further studies.     

人血管内皮生长因子-C基因的体外重组和表达

目的体外重组人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因,检验其在细胞中的表达。方法以RT-PCR法从人真皮成纤维细胞中克隆VEGF-C基因功能片断的cDNA,制备pcDNA3.1( )-VEGF-C质粒载体,通过Fugene 6介导转染人成纤维细胞及COS7细胞。RT-PCR及免疫组化法检测VEGF-C基因表达情况。结果从成纤维细胞中克隆得到1 053 bp的VEGF-C基因cDNA,碱基序列与已知的人VEGF-C基因cDNA完全一致。重组pcDNA3.1( )-VEGF-C质粒所携带的目的基因VEGF-C在细胞中有强表达。结论成功重组了一个pcDNA3.1( )-人VEGF-C质粒,为进一步研究淋巴水肿的基因治疗提供了物质基础。     

人血小板生成素的基因克隆及序列分析

目的为获得人血小板生成素全长cDNA克隆。方法用RT-PCR技术，以特异性寡核苷酸为上、下游引物自胎肝总RNA中扩增目的基因。结果PCR扩增产物克隆至pUCl8-T载体，获得重组质粒pUCT-TPOM。结论序列分析显示，获得的血小板生成素cDNA序列与国外文献一致。