大肠杆菌生产重组极耐热木聚糖酶的诱导条件及其酶学性质

构建重组菌(JM109/pTrc 99A xylIV)作为极耐热木聚糖酶的生产菌株,研究了IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长的不同阶段加IPTG和温度对重组菌生产极耐热木聚糖酶的影响以及它的酶学性质.结果表明,IPTG诱导8h后极耐热木聚糖酶的表达量基本维持不变,0.5～5mmol/L浓度的IPTG诱导重组菌表达极耐热木聚糖酶的效果基本相同;当重组菌生长到OD600为1.2左右时加IPTG诱导最好,诱导温度对极耐热木聚糖酶表达水平的影响不大.重组耐热木聚糖酶的最适反应pH值为5.4～5.8,重组极耐热木聚糖酶的最适反应温度大于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.2～7.5都比较稳定,重组极耐热木聚糖酶的温度稳定性好,在90℃下保温2h后残存酶活还有90%.     

马槟榔甜蛋白基因(MabinlinⅡ)的密码子优化及其在大肠杆菌中的表达

本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性,对马槟榔甜蛋白基因MabinlinⅡ(A链+B链)的密码子进行优化,并将优化后的马槟榔甜蛋白基因命名为MabinlinⅡ(AB)Plus。将MabinlinⅡ(AB)Plus基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)片段连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-MabinlinⅡ(AB)Plus,进而转化到大肠杆菌宿主表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果表明,密码子优化后的基因MabinlinⅡ(AB)Plus在大肠杆菌中最佳表达条件为:最适IPTG浓度1.4 mmol/L,最佳诱导剂温度为37℃,最适菌株起始生长量OD₆₀₀为0.7,最佳诱导时间8 h。在最佳诱导表达条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白约33.0%,与优化前约有提高7%。目的蛋白的上清液经过亲和纯化,在19 kDa处有单一的目的条带。经过感官评定,目的蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。这为研发以马槟榔甜蛋白为基础的新型甜味剂提供了科学的理论依据。     

抗肿瘤19肽在大肠杆菌中的融合表达与纯化

将重组载体pet32a-19肽转化到表达宿主菌大肠杆菌中,对其进行摇瓶发酵实验来优化重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件。通过Ni Sepharose 6 Fast Flow对重组蛋白进行纯化,用梯度透析的方法进行复性。结果表明:筛选出了pET32a-19肽-BL21(DE3)高效表达菌株,在发酵条件为培养基的pH7.0、接种量3%、IPTG浓度0.1mmol/L、IPTG添加时间OD600为0.7、诱导温度41℃和诱导时间5h时蛋白表达量最高,为54.57mg/L,得到纯度为95%以上的融合抗肿瘤19肽,并成功复性出融合蛋白。     

乳糖诱导D-塔格糖3-差向异构酶基因在大肠杆菌中的表达

以D-塔格糖3-差向异构酶高效表达菌株BL21(DE3)/pET22b-cbdte为研究对象,考察乳糖作为诱导剂诱导D-塔格糖3-差向异构酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性.在摇瓶发酵条件下,从诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等四个方面,研究诱导条件对目的蛋白表达的影响.结果表明,工程菌培养至对数生长中期OD值为1.0左右后,加入终浓度为5g/L的乳糖,于20℃的条件下诱导7h,可获得最大酶活.与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)最适诱导条件相比,优化后的乳糖诱导酶活提高82.7％,可溶性目的蛋白的表达量提高99.5％,菌体生物量提高30.5％.研究结果为乳糖作为诱导剂应用于D-塔格糖3-差向异构酶的工业化生产提供有益的参考和借鉴.     

重组极耐热内切葡聚糖酶Cel12B的诱导条件及酶的纯化

构建重组菌(JM109/pET-20b-Cel12B)生产极耐热内切葡聚糖酶,研究了不同表达宿主、IPTG诱导时间、IPTG浓度、重组菌生长不同阶段添加IPTG对重组菌生产极耐热内切葡聚糖酶的影响。结果表明:最佳诱导时间是OD值为1.0,IPTG浓度从0.5到3.0对酶活表达影响不大,诱导8h后极耐热内切葡聚糖酶表达量基本不变,优化后重组菌(E.coliBL21-CodonPlus(DE3)-RIL/pET-20b-Cel12B)表达酶活比原来菌株(E.coliJM109(DE3)/pET-20b-Cel12B)提高了53.9%,经过热处理和亲和层析得到电泳纯的蛋白条带。     

植物甜蛋白monellin基因工程菌表达条件的研究

将带有monellin基因的重组分泌型表达载体pETMO转入大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌株BMC33。经IPTG诱导,其所含有的甜蛋白基因可高效表达。研究不同的表达条件对甜蛋白表达水平的影响,得到优化发酵条件:装液量为50 mL/250 mL三角瓶,当培养液OD值达0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓为0.9mmol/L,32℃诱导5 h。此时,甜蛋白monellin表达量可高达细菌可溶性蛋白的44.8%。     

花生过敏原Ara h2.02原核表达方法条件的研究

将重组质粒pET-32a(+)-Arah2.02转化表达宿主菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS—PAGE电泳分析,结果显示表达的蛋白大小约为38kDa。进一步用通用His标签抗体进行Western Blotting检测,结果表明成功克隆表达了花生过敏原Arah2.02。为获得较多的重组蛋白Arah2.02,分别对IPTG浓度、摇床转速、诱导温度和时间等条件进行选择,确定最佳条件为:IPTG浓度0.3mmol/L,摇床转速220r/min,诱导温度37℃,诱导时间2h。     

表达金丝桃素合成酶的基因工程菌发酵工艺研究

采用摇瓶发酵试验，分别对影响工程菌生长和表达的条件：培养基初始pH值、诱导温度、诱导时间、诱导物浓度等进行了考察，优化了重组大肠杆菌的发酵条件，确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，即工程菌在pH值为7．4、温度为25℃、IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）浓度为0．8mmol／L时蛋白表达量最高。     

乳二糖磷酸化酶的表达优化

为了提高目的蛋白的产量和活性,将克隆自Bifidobacterium longum JCM1217的乳二糖磷酸化酶(LNBP)的基因构建到大肠杆菌BL21中,优化其表达条件。结果显示,诱导时间、诱导温度及IPTG浓度对LNBP的表达水平影响显著。经正交试验,优化出的重组菌表达LNBP的最佳诱导条件为诱导温度30℃, IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间18 h。在此条件下获得的LNBP比活力达到15.18 U/mg。     

人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

产脂肪酶重组菌SRI-01随机突变及诱导表达条件的研究

采用大引物全质粒法（MEGAWHOP）随机突变,快速有效地对研究室前期构建的一株脂肪酶重组菌株SRI-01进行分子改造,通过对易错聚合酶链反应（ep-PCR）获得的2 300个突变株进行96孔板高通量筛选,得到一株优良突变株SRM08。通过单因素试验,优化诱导前的菌体生物量、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的浓度、CaCl2的浓度、诱导温度。通过比较3种不同破碎缓冲液浓度和缓冲液pH对脂肪酶活力的影响,选择最优的破碎缓冲液。确定突变株SRM08最佳诱导表达条件为菌液生物量OD600 nm值为0.7,IPTG的浓度为0.1 mmol/L,CaCl2浓度为4 mmol/L,诱导温度为25 ℃,采用5 mmol/L磷酸钠缓冲液为破碎缓冲液,pH值为7.0。在此优化条件下,脂肪酶活达到88 508 U/L,为原重组菌株SRI-01的2.84倍。     

康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在大肠杆菌中的表达

将康氏木霉(Trichoderma koningii)总RNA反转录成cDNA第一链,并以之为模板进行RT-PCR,合成约1.5kb的纤维二糖水解酶Ⅰ(cbh I)基因.cbhI基因经测序确认后克降到表达载体pET-30a(+)上,PCR和双酶切鉴定筛选阳性重组子;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,并用0.4mmol/L的IPTG诱导表达重组蛋白.实验结果:cbhI基因在BL21(DE3)plysS中胞内融合表达,重组蛋白pNPC酶活为15.6U/L,最适反应温度为45℃,最适pH值为5.0,Mn2+对酶活力有明显的促进作用,SDS-PAGE表明重组蛋白分子量约为70kDa.     

蔗糖异构酶基因在Escherichia coli BL21(DE3)中的表达及重组菌的细胞固定化

分别利用IPTG和乳糖两种诱导物诱导蔗糖异构酶(SIase)基因在E.coliBL21(DE3)中实现表达,对诱导温度、诱导时机、诱导物浓度、诱导持续时间进行比较分析并优化,确定了二者的最佳诱导条件,在E.coli培养3h后(OD600约为0.9)添加终浓度为0.8mmol/L的IPTG(0.5mmol/L乳糖)在20℃(24℃)条件下诱导14h(12h)能获得最高的蛋白表达量及SIase酶活。在最优条件下以IPTG为诱导物时目的蛋白占总蛋白的41.6%,单位体积培养液中SIase酶活为12.37U/mL,以乳糖为诱导物时分别为27.2%,14.72U/mL,从收获酶活角度考虑可见乳糖作为诱导物的优势;而后利用海藻酸钠包埋法固定化重组菌,转化初始浓度为500g/L的蔗糖溶液,转化10～11h后异麦芽酮糖平均得率在83%以上,蔗糖平均转化率大于99%,固定化细胞能够连续稳定转化25批次,转化效率相对于原始菌提高了近55%。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。     

基因共表达对人源LysoPLD异源可溶性表达、纯化及酶学性质的影响

目的:为实现人源溶血磷脂酶D（LysoPLD）的原核异源可溶性表达。方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列（GenBank: L46720.1）。采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签（MBP）和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Trigger factor（tig）两种方式提高LysoPLD蛋白在大肠杆菌中的异源可溶性表达,建立对应蛋白的纯化工艺包括离子柱纯化,硫酸铵盐析,疏水柱纯化,淀粉树脂柱（Amylose Resin）纯化,分离纯化获得的重组酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白纯度,以对羟基棕榈酸酯为底物对比两种蛋白的酶学性质。结果:成功构建载体pET28a-MBP-LysoPLD和pET28a-pTF16-LysoPLD,并获得工程菌BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD和BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD。BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD经0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）低温诱导过夜可获得上清表达的MBP-LysoPLD蛋白;BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD在含有0.5 μg/mL L-Arabinose的LB培养基中培养,经0.1 mmol/L IPTG低温诱导表达,可获得可溶性表达的LysoPLD蛋白,经纯化,酶纯度可大于80%。以对羟基棕榈酸酯为底物,对比两种方法得到的蛋白的酶学性质,发现二者催化反应的最适温度、最适pH、最适Ca2+浓度、比酶活基本一致。结论:两种基因共表达方式都可实现人源LysoPLD的在大肠杆菌中的可溶性表达,且酶学性质基本相同。     

多序列比对在克隆表达一株未知芽孢杆菌角蛋白酶基因中的应用

为克隆表达一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,本文对芽孢杆菌属来源的13个角蛋白酶基因进行了分类比对,并设计简并引物,成功筛选出一株未知芽孢杆菌的角蛋白酶基因,在大肠杆菌中克隆表达,最后通过SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)分析和酶活测定验证表达成功,同时还确立重组大肠杆菌BL21(pET-28a-Ker)的最佳诱导温度为20℃,经过0.5 mmol/L IPTG (isopropylthio-galactoside)诱导16 h后,粗酶液中的角蛋白酶酶活达到389.7 U/mL。本文证明了通过多序列比对而设计的角蛋白酶简并引物的有效性,且该方法能够简化角蛋白酶的研究和开发。     

细菌透明质酸酶基因工程菌的构建及高效表达

目的将兽疫链球菌透明质酸酶hyl基因在大肠杆菌原核表达系统中高效分泌表达。方法通过PCR方法扩增得兽疫链球菌hyl基因,Xho I和Nco I双酶切后,连入表达载体pET26b(+),并转化入大肠杆菌,经低温异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖诱导表达,DNS法检测胞外透明质酸酶活性。结果成功构建含兽疫链球菌透明质酸酶基因hyl的大肠杆菌基因工程菌株,经IPTG诱导并添加甘氨酸后胞外透明质酸酶活性高达5.3×104 U/mL。结论实现了透明质酸酶在原核系统中的表达,为工业化生产奠定了基础,具有很好的市场前景。     

微液滴适应性进化强化大肠杆菌耐受高浓度L-山梨糖

前期研究构建了1株组成型表达山梨糖脱氢酶(sorbose dehydrogenase,SDH)的大肠杆菌工程菌,该菌株能利用L-山梨糖生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KLG),但对底物L-山梨糖的耐受性较差。为解决这一问题,对该菌株进行适应性进化,并强化了进化菌株发酵生产2-KLG的能力。首先,应用基于微流控技术的全自动高通量微生物液滴培养系统,将出发菌株在不同浓度梯度的L-山梨糖培养基中生长、传代,获得能够耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株。在摇瓶上进一步验证,最终获得了1株能耐受高浓度L-山梨糖的进化菌株2-F6。然后在2-F6中共表达了能促进2-酮基-L-古龙酸积累的山梨酮脱氢酶(sorbosone dehydrogenase,SNDH),并在摇瓶水平上对接种量、发酵温度、SNDH诱导时间、IPTG诱导浓度以及L-山梨糖添加量进化了优化,在最优条件下,2-KLG的产量达6. 05 g/L。最终,将摇瓶发酵条件放大至5 L发酵罐后,2-KLG的产量为5. 70 g/L。研究结果为一菌一步发酵法生产维生素C前体2-KLG提供了参考。     

乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达

以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。     

圆弧青霉BD26碱性脂肪酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以圆弧青霉BD26总RNA为模板,扩增出774 bp cDNA片段,将该基因片段克隆到表达载体pET-28a(+)上并转化Escherichia coil BL21(DE3),得到重组菌株BL21/ Lip PD。经IPTG诱导,菌体在固体琼脂显色平板上形成明显透明圈。SDS-PAGE电泳显示该脂肪酶分子质量约为27 ku。表达条件优化结果表明,当工程菌培养至OD_(600)为0.5时,加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L,在32℃诱导培养1 h,比酶活达29.30 U/mg。