血管内皮细胞体外培养及生物学特性的探讨

目的　分离培养脐静脉内皮细胞 ,鉴定其生物学特性。方法　采用 0 2 %胰蛋白酶行脐静脉两次酶灌注消化法获取内皮细胞。分别在倒置相差显微镜、透射电镜下观察 ,SP免疫组化法行Ⅷ因子抗原鉴定。观察血管内皮细胞体外培养的生长情况 ,并绘制细胞生长曲线。结果　 (1)经改良的胰蛋白酶两次消化法获取较高的活细胞百分数 ,且细胞纯度较高。 (2 )透射电镜下发现多数细胞间存在紧密连接结构 ,胞膜的一侧贴有基膜样成分。 (3)血管内皮细胞体外培养融合成单层后 ,形成类似体外血管内皮的内衬结构。结论　透射电镜下细胞特征可作为鉴定血管内皮细胞的辅助手段。     

SD大鼠面突未分化外胚间充质细胞的体外培养

目的 建立SD大鼠面突未分化我胚间充质细胞的体外培养模型。方法 采用消化贴壁法培养SD大鼠外胚间充质细胞；用倒置显微镜观察细胞生长特性；用免疫组化法鉴定细胞来源。结果 细胞呈纤维样细胞生长，生长稳定。免疫组化染色，抗HNK－1和抗VIM为阳性，抗CK为阴性。结论 培养的细胞为外胚间充质细胞，为研究颌面及牙齿的发育提供了实验基础。     

犬骨髓基质细胞体外培养和诱导分化的实验研究

目的：观察犬骨髓基质细胞在体外培养的条件及生物学特性,对其进行鉴定。方法：取犬骨髓分离培养骨髓基质细胞（BMSC）传代后,倒置相差显微镜观察其形态,免疫组化方法加以鉴定,生化检测Vonkossa染色鉴定其成骨能力。结果：原代培养20d后可分离得到骨髓基质细胞BMSC,生长形态相对稳定,具有成骨能力。结论：BM-SC具有贴壁生长特征,易分离扩增,增殖速度快,诱导分化具有成骨能力,可用于骨缺损的修复治疗。     

体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性

目的：研究体外培养的大鼠骨髓基质细胞的生物学特性及基成骨细胞表型特征。方法：分离大鼠四肢长骨髓基质细胞,常规和矿化培养液培养,测定细胞生长曲线,碱性成纤细胞生长因子（bFGF）、重组人骨形成蛋白－2（rhBMP-2)及矿化培养液对骨髓基质细胞性磷酸酶（ALP）活性的影响,观察矿化结节的形成。结果：大鼠骨髓基质细胞群体倍增时间（DT）为66．1h;在矿化液培养条件下细胞DT为50．3h。bFGF和rhBMP－2均不同程度增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性。矿化液有较明显的增加骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的作用,用茜素红染色法显示较多的深红色矿化结节。常规培养条件下大鼠骨髓基质细胞生长虽呈现密集单层,没有矿化结节形成。结论：大鼠骨髓基质细胞在体外可以稳定传代培养,在矿化培养液诱导培养条件下可以向成骨细胞分化,bFGF和rhBMP－2有助于骨髓基质细胞表现成骨细胞表型特征,提示骨髓基质细胞在骨移植研究领域有重要的应用价值。     

人髁突来源骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的探讨人髁突来源骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养和鉴定方法以及多向分化能力．为骨组织工程提供种子细胞。方法取髁突良性肥大患者被切除的髁突。冲洗收集骨髓细胞．采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化MSCs．取生长良好的P3或P4代MSCs进行检测：（1）MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析；（2）流式细胞仪检测MSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期；（3）脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞多向诱导分化及相关检测。结果（1）利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法从人髁突分离MSCs．经传代后细胞形态呈梭形．成纤维细胞样．均匀一致；（2）MTT法测定细胞增殖和生长曲线分析结果显示MSCs在传代后经历游离期、贴壁期、潜伏期、对数生长期和平台期；（3）流式细胞仪检测结果显示所获得的MSCs纯度较高．细胞单一。CD44、CD29和CD55表面标记阳性率分别为100％、99．8％和86．6％，而CD34、CD45和CD106的阳性率仅为0．5％、2．9％和6．3％；（4）MSCs细胞周期检测结果为G0期和G1期91．9％、G2期2．4％和S期5．7％，说明大部分细胞仍处于静止期：（5）成脂诱导后细胞胞浆内可见脂滴，苏丹黑B、油红O染色均呈阳性；成骨诱导后，Vonkossa和茜素红染色均呈阳性：神经细胞诱导后，细胞由梭形变为有多个突起的神经元样细胞，甲苯胺蓝尼氏和GFAP免疫组化染色均为阳性。结论从人髁突骨髓中能分离出高度一致的MSCs，这些细胞具有多向分化能力．可作为骨组织工程的种子细胞。     

大鼠牙髓干细胞的培养和鉴定

目的：分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定。方法：采用单细胞克隆的方法进行大鼠牙髓干细胞的分离培养,并将达到一定数量级的牙髓干细胞与HA—TCP支架材料进行复合,移植入裸鼠背部皮下,8周后取材进行组织学鉴定。取鉴定成功的细胞株复苏进行细胞生物学特性研究,同时进行成牙本质细胞诱导并进行DsP、DMP1免疫组织化学染色一结果：单细胞来源的细胞克隆(RDPSC282)移植物组织切片可见牙本质牙髓复合体样结构。复苏细胞形态为梭形,细胞密集时形态多样,为卵圆形或多角形,细胞群体倍增时间为58．3h,克隆形成率为1．33％,免疫组化染色DSP、DMPl均为15月性,经矿化液诱导后部分细胞胞浆DsP及DMP1出现阳性染色。结论：首次成功分离培养出一株大鼠牙髓干细胞。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养鉴定及骨向诱导分化研究

目的：建立骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导以探讨大鼠MSCs的体外培养方法及向成骨细胞分化的条件。方法：采用全骨髓贴壁筛选培养法分离成年SD大鼠MSCs,经条件培养液诱导培养后,进行细胞形态学观察、绘制细胞生长曲线、免疫细胞化学检测及碱性磷酸酶活性、钙结节的形成测定。结果：SD大鼠MSCs在体外分离培养扩增形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论：SD大鼠MSCs体外分离培养体系能够成功建立,培养出的细胞能向成骨细胞分化,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

小鼠牙囊细胞的体外分离培养鉴定及异质性研究

目的：建立小鼠牙囊细胞体外分离培养的方法，并对其起源进行鉴定，同时检测其生物学特性．．方法：用1％的胰蛋白酶消化分离7天龄Balb／c小乳鼠的下颌第一磨牙牙胚的牙囊组织进行体外培养，波形蛋白和角蛋白鉴定细胞起源，HE染色观察细胞的形态，Gomori改良钙钴法进行细胞的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase．ALPase)染色，免疫组化法检测细胞Ⅰ型胶原和骨钙素(osteocalcin，OCN)的表达。结果：分离培养的细胞具有多形性，现有3种基本的细胞类型：立方形或多角形；长梭形：非常细长的细胞形状，前2种细胞胞核内有2～4个清晰的核仁，胞质内有大量颗粒，且有大量的线状伪足。波形蛋白染色阳性。角蛋白染色阴性，ALPase染色显示72．7％的牙囊细胞内的ALPase呈强阳性；免疫组化染色显示48．8％的牙囊细胞Ⅰ型胶原及8．75％的牙囊细胞的OCN表达阳性。结论：所培养的牙囊细胞源自间充质，含有多种细胞表型．具有异质性。     

大鼠颌突外胚间充质细胞向骨骼肌细胞诱导分化和三维培养观察

目的：探讨体外诱导外胚间充质细胞向骨骼肌细胞分化的潜能，利用分化细胞构建组织工程骨骼肌模型。方法：取妊娠10．5d胎鼠颌突外胚间充质细胞，纯化后分别在含1、5、10mL／L体积浓度二甲基亚砜的DMEM／F12培养基中培养。相差显微镜下观察细胞的形态变化，成肌相关因子免疫组化鉴定细胞性质，将诱导后的细胞种植于胶原膜，并于培养3、6d后用光镜、扫描电镜观察细胞的生长情况。结果：培养3d后，外胚间充质细胞形态出现成肌样细胞变化，细胞变得大而扁平，培养5d后细胞出现管样结构。免疫组化鉴定显示：添加二甲基亚砜后，大部分细胞出现成肌相关因子的表达，其中5mL／L实验组效果最好，约75％的细胞转化为骨骼肌细胞。对照细胞形态未见明显改变，免疫组化鉴定未能诱导分化出骨骼肌细胞。种植于BAM膜后，细胞生长良好，并可形成复层结构。结论：二甲基亚砜可诱导外胚间充质细胞向骨骼肌细胞分化，最佳浓度为5mL／L；在BAM膜上分化细胞生长状态良好，说明该生物可降解膜是构建组织工程骨骼肌的适合材料。     

大鼠骨髓MSCs体外分离培养及多向分化的实验研究

目的：建立骨髓MSCs体外分离培养体系，并进行多向分化诱导，以证实其多向分化潜能，为MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法：用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs，并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对MSCs向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞进行诱导分化，并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果：用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs，细胞增殖活性强。经骨向诱导后，ALP和矿化结节染色阳性；免疫细胞化学染色提示神经向诱导神经元特异性标志蛋白NSE和NF200，成肌细胞标志蛋白Deamin和Connexin-43阳性表达。结论：采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系；并能够向成骨细胞、神经元样细胞和成肌细胞分化。     

骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性的研究

目的:建立一种新型的体外培养成骨细胞的生物学模型。并对其生物学特性进行研究。方法:选择大耳白兔骨髓基质细胞为材料进行体外成骨细胞培养实验,在不同培养体系中进行体外培养,通过倒置显微镜观察、透射电镜、扫描电镜、组织化学染色技术、钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性进行研究。结果:获得的细胞呈多种形态,有长短不一、大小不均的胞浆突起,且互相连接,细胞互相重叠呈复层生长,并形成细胞结节;胞浆丰富,富含线粒体、粗面内质网、高尔基体等,具有合成分泌功能旺盛的结构,与典型成骨细胞的形态结构相似。同时,胞浆富含碱性磷酸酶活性,在条件培养基中细胞发生钙化现象,这与典型成骨细胞的生物学特性相似。且获得的细胞在体外能连续传代,形态和功能不变。结论:我们认为用骨髓基质细胞为材料进行体外培养是成骨细胞体外培养的一种新型的生物学模型,为人工骨替代材料的研制、成骨细胞移植修复骨缺损等开辟了新的途径     

犬骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化及细胞片层的制备

目的分离培养犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并向成骨细胞诱导分化,制备骨髓基质干细胞的细胞片层。方法密度梯度离心法分离犬骨髓基质干细胞,接种于DMEM成骨诱导培养基,向成骨细胞诱导分化,利用温度反应性培养皿的温度感应性,制备细胞片层。观察犬BMSCs、成骨细胞诱导分化及细胞片层形态学特点与生物学特性。结果分离培养出犬BMSCs,成功地向成骨细胞实现诱导分化,并观察到钙结节。利用温度反应性培养皿的温度感应性,收获了完整的细胞片层。结论细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合,将有望构建出含板层骨结构的大块组织工程骨。     

成人正常骨髓基质细胞体外培养及生物学特性

目的：建立成人体外培养成骨细胞的生物学模型，研究其生物学特性，为用于骨组织工程的功能细胞提供实验基础。方法：将成人正常骨髓基质细胞在不同培养体系中培养，通过倒置显微镜观察、HE染色、四环素荧光标记等方法对细胞进行生物学特性研究。结果：培养细胞形态多样，有两个或两个以上的胞浆突起且相互连接，细胞呈叠加复层生长，形成细胞结节；胞浆碱性磷酸酶染色强阳性，在一定条件下可产生钙化结节，结节的四环素荧光标记呈阳性。结论：确认培养的骨髓基质细胞具有与成骨细胞相似的形态特征和生物学特征，并能在体外钙化形成钙化结节。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

hBMP-7基因转染的骨髓基质细胞与BME-10X胶原膜复合物的体外构建

目的:观察人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因转染的骨髓基质细胞(BMSCs)与胶原膜BME-10X复合后,BMSCs在BME-10X上的生长状态。方法:利用脂质体介导法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSCs,传代与胶原膜BME-10X复合,荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜观察。结果:转染细胞复合胶原膜后生长良好,24h细胞已贴附、伸展。透射电镜可见细胞与材料表面连接紧密,包膜部分增厚,形成类似半桥粒样结构。结论:hBMP-7基因转染BMSCs在胶原膜BME-10X上生长良好,hBMP-7基因转染的BMSCs与胶原膜复合物有望应用于牙周组织工程。     

人静脉畸形内皮细胞的分离培养和鉴定

目的 建立一个稳定的人血管畸形内皮细胞体外培养体系。方法 取人静脉畸形组织块接种于铺有明胶底层的培养瓶中进行原代及传代培养。通过早期去除组织块、机械刮除及酶消化法纯化内皮细胞。对培养的细胞进行形态学观察及免疫组化染色等一系列细胞定性研究。结果 获取的内皮细胞可连续传代4－5代,成活40－50d;生长于玻璃、塑料上的细胞呈铺路石状;生长于明胶底层上的细胞可形成毛细血管样结构;电镜下可见细胞具有Weiber-Palade小体特征性超微结构;CD34及vWF免疫组化染色阳性,α－SMA染色阴性。结论 应用此培养方法可获得纯化的血管畸形内皮细胞,且细胞可连续传代培养。培养的血管畸形内皮细胞可用于体外研究血管畸形的生物学行为。     

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目的研究大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)分离培养的方法,并采用药物对其进行成骨诱导,探讨大鼠BMSCs在体外向成骨细胞分化的能力。方法本实验于2010年在中国医科大学口腔医学院中心实验室进行,采用全骨髓培养法进行大鼠BMSCs的分离与培养,光镜下观察细胞形态,之后细胞传代到所需数量后,随机分为2组,诱导组采用药物法(0.1μmol/L的地塞米松、10mmol/L的β-磷酸甘油钠、0.2mmol/L维生素C)进行成骨诱导,非诱导组未采用任何方法进行成骨诱导。在诱导的第1、3、5天,分别对两组细胞取样,进行细胞活性检测和碱性磷酸酶检测;在诱导的第5天进行扫描电镜观察。比较两组细胞成骨能力。结果光镜下,分离培养的细胞呈圆形、多角形、梭形等成纤维细胞样外观,细胞核浆比例较大,透光度较高,连续培养后呈现束状和漩涡状生长,符合基质干细胞的形态学特征。在成骨诱导的第1天,两组细胞的活性检测差异有统计学意义(P<0.05),碱性磷酸酶表达差异无统计学意义(P>0.05);在诱导的第3、5天,两组细胞的活性检测、碱性磷酸酶表达差异均有统计学意义(P<0.05)。在诱导培养的第5天,扫描电镜下观察可见两组细胞形态不同。结论采用全骨髓培养法可对大鼠BMSCs进行有效的分离培养,分离出的细胞符合基质干细胞特点;通过地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C可对其进行有效的成骨诱导。