菲牛蛭素体内外抗凝实验研究

目的:研究广西菲牛蛭中提取的两种菲牛蛭素--菲牛蛭素A(Bufrudin A,BA)和菲牛蛭素B(Bufrudin B,BB)在人体外及动物体内的抗凝作用.方法:观察菲牛蛭素在人体外及动物体内对部分活化凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)的影响.结果:在体内外实验中,BA、BB均能明显延长活化部分APTT、PT及TT,但两者的三个指标有明显差异性,其中BA对TT的作用最显著,BB则对PT的作用更强.结论:广西菲牛蛭中的抗凝物质BA、BB在体内外均有较强的抗凝活性.     

广东菲牛蛭生活水体的化学环境

蛭类俗称蚂蟥,是传统中药。《本草纲目》对水蛭的药理、疗效、使用方法作了较全面记载。现代药理实验表明水蛭注射液能使肿瘤细胞坏死、消失,对网状内皮细胞有增强作用。与非吸血蛭类比较,吸血的菲牛蛭唾液腺含有较丰富的抗血液凝固水蛭素,在医药学上有重要价值。有关吸血蛭类繁殖饲养研究,国内谭恩光(2002)曾报道广东菲牛蛭H irud inariam an illensis Lesson的生长和生殖,及吸血山蛭的生态分布、生长、摄食和生殖[1~3]。国外K eegan(1968)对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观察[4]。1992年Steiner从产自马尼拉的菲牛蛭中分离纯化新的水蛭素,…     

不同试剂处理对菲牛蛭冻干粉抗凝活性的影响研究

目的:研究比较不同试剂处理对菲牛蛭冻干粉抗凝血活性的影响。方法:采用凝血酶直接滴定法对不同试剂处理后的菲牛蛭冻干粉的抗凝血活性进行测定。结果:与对照组相比较,乙酸乙酯、正己烷、环己烷、丙酮、石油醚、蒸馏水6种试剂对菲牛蛭冻干粉抗凝血活性基本无影响;甲醇和乙醇对其活性损失最大,超过33%;氯仿、二氯甲烷损失较小,接近17%。结论:菲牛蛭冻干粉抗凝血活性强弱与其处理的试剂有较大关系。在菲牛蛭深加工时,建议选择石油醚、乙酸乙酯、蒸馏水3种试剂,既可保证其安全性,也能有效保留菲牛蛭冻干粉的抗凝血活性,最大程度利用资源。     

尖吻蝮蛇毒无出血活性纤维蛋白溶解酶的纯化及其理化性质研究

目的：从蝮亚科尖吻蝮蛇毒(Agkistrodon acutus venom)中分离纯化出无出血活性纤维蛋白溶解酶(Non—hemonrrhagic fibrinolytic enzyme,NHFLE)并对其理化性质进行研究。方法：应用凝胶过滤和离子交换柱层析法分离纯化尖吻蝮蛇毒NHFLE，用纤维蛋白平板法测定其纤溶活力，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其相对分子质量，用皮内出血实验测定其出血活性。结果：从短亚科尖吻蝮蛇毒中分离出一种单一组分的纤维蛋白溶解酶，它的相对分子质量为25000，没有出血活性，在普通纤维蛋白平板和加热平板上都能溶解纤维蛋白，相对活性为粗毒的3．2倍。结论：从尖吻蝮蛇毒中分离出相对分子质量为25000的纯化蛋白是具有直接溶解纤维蛋白活性，而无出血活性的单一的纤维蛋白溶解酶。     

广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

【目的】研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。【方法】抽提广东菲牛蛭基因组DNA ,根据已发表的水蛭素基因设计一对引物 ,从基因组DNA扩增出一特异性的大约 70 0bp片段 ,再回收、克隆和测序。【结果】广东菲牛蛭水蛭素基因全长为 6 42bp ,基因有 4个外显子 ,被三个内含子隔开。与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1、Hm2 的同源性分别为 90 %与和 88 6 %。【结论】地理因素会影响菲牛蛭水蛭素基因结构的变异。     

舟山眼镜蛇毒蕈碱样多肽的分离及其对M胆碱受体的激动效应

目的 从舟山眼镜蛇Naja atra蛇毒中分离毒蕈碱样多肽,探讨其与M胆碱受体的关系.方法 应用分子筛凝胶Sephadex G-50、Sephadex G-100、离子交换凝胶CM-Sepharose F.F.分离纯化目的组分;SDS-PAGE鉴定目的蛋白的纯度并测定其相对分子质量;放射受体分析法测定该物质与大鼠脑组织M胆碱受体的亲和力;选用离体豚鼠回肠纵行肌观察其对M胆碱受体的效应.结果 从舟山眼镜蛇蛇毒中获得一种与大鼠脑组织M胆碱受体具有高亲和力的多肽(Ki为10.12 nmol/L),其相对分子质量约14 kD.该多肽可引起离体豚鼠回肠纵行肌收缩,此效应可被阿托品阻断.结论 舟山眼镜蛇蛇毒中获得与M胆碱受体具有高亲和力的多肽,该多肽对M胆碱受体具有激动效应.     

一种新型马鹿茸多肽纯化、鉴定及体外降血糖活性

从马鹿茸干品中分离具有降血糖活性的多肽。以新疆塔里木马鹿茸干品为原料,粉碎后经醋酸-醋酸钠(pH 3.5)缓冲液浸提,再经醇沉、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相色谱纯化多肽,并对该多肽进行MALDI TOF/MS相对分子质量检测和LC-MS/MS鉴定。MTT法检测促胰岛β细胞增殖和STZ损伤后修复能力以及建立肝细胞胰岛素耐受模型检测该多肽促肝细胞葡萄糖消耗量活性。结果表明,分离纯化得到的多肽CAP经MALDI-TOF/MS检测,其相对分子质量为6 804,LC-MS/MS及相关数据库比对发现,CAP为一种新的肽。CAP能显著促胰岛β细胞的增殖和STZ损伤后的修复,并能显著增加肝细胞的葡萄糖摄入量。     

广东菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列测定

目的：研究地理因素对水蛭素基因结构变异的影响。方法：抽提广东菲牛蛭基因组DNA，根据已发表的水蛭素基因设计一对引物，从基因组DNA扩增出一特异性的大约700bp片段，再回收，克隆和测序。结果：广东菲牛蛭水蛭素基因全长为642bp，基因有4个外显子，被三个内含子隔开，与马尼拉菲牛蛭水蛭素基因Hm1,Hm2的同源性分别为90％与88．6％，结论：地理因素会影响菲至蛭水蛭素基因结构的变异。     

抗凝组分Acoagulatin的纯化鉴定及其抗凝特性

目的 从蝮蛇毒中分离纯化一种组分acoagulatin并进行鉴定,观察其抗凝作用。方法 经DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-sepharose Fast Flow离子交换柱层析,从蝮蛇毒中分离、纯化得到acoagulatin,分别采用Biosep-sec-s 2000型HPLC分子筛柱层析、还原性SDS-PAGE(5％浓缩胶,12％分离胶)电泳进行纯度和相对分子质量测定,将不同浓度acoagulatin与抗凝兔血混合,测定凝血时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)。结果 Acoagulatin的相对分子质量为31400,由两个亚基组成,相对分子质量分别为14400和17000,能显著地延长PT和APTT,对TT没有影响。结论 采用DEAE-Sepharose Fast Flow和CM-sepharose Fast Flow两种离子交换柱层析分离蛇毒,能分离出纯度高的组分acoagulatin,该组分具有抗凝活性。     

恶性滋养叶细胞肿瘤患者血清中早孕因子样物质的初步提纯

用改良的Mehta方法,以从混合孕妇(5～12周)血清中提取出的早孕因子作对照,对混合恶葡、绒癌患者血清中早孕因子样物质(t—EPF)进行分离纯化,测定各阶段提取物中EPF活性、hCG—β及蛋白质含量,并经PAGE及SDS—PAGE鉴定提取效果、测定肿瘤源性早孕因子的分子量。获得不含hCG具EPF活性的t—EPF(TG_3. TG_4)提取物,TG_3中两条多肽成份分子量为27.78ku及57.046ku,TG_4电泳显示单一多肽区带。由TG_3中两条多肽的分子量及其近倍数关系推测恶性滋养叶细胞肿瘤患者血清中的t—EPF可能不同于孕血清中的EPF,且t—EPF可能以单体及聚合体形式存在,其具活性的基本形式为27.78ku的多肽。     

广西菲牛蛭提取物抗动物血栓形成的作用

目的:研究菲牛蛭提取物对抗动物血栓形成的作用.方法:采用家兔动脉血栓和大白鼠静脉血栓模型,静脉注射菲牛蛭提取物每千克60个抗凝血酶单位 (60ATU /kg),用生理盐水作阴性对照.测定其对动脉及静脉血栓形成的作用. 结果:给药后,菲牛蛭提取物对动脉血栓、静脉血栓湿重和干重均有明显减轻作用,与生理盐水对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论:菲牛蛭提取物有较强的抗动物血栓形成作用,具有潜在的临床应用价值.     

人和小鼠抑癌因子分子量等物化性质比较

应用ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了人和小鼠抑癌因子的分子量等物化性质。结果显示，４种人癌的抑癌因子都呈均一区带，其相对迁移率均为０３６，分子量范围在１２０００左右。２种小鼠癌的抑癌因子也为均一区带，相对迁移率为０５６，分子量约４０００。提示人和小鼠的抑癌因子分子可能均由一条肽链组成。     

梅毒螺旋体Tp0751重组蛋白的表达及鉴定

目的表达梅毒螺旋体粘附蛋白Tp 0751,纯化表达产物并对其抗原性进行鉴定。方法通过生物信息学分析,去除Tp 0751信号肽序列,构建原核表达体并在大肠埃希菌（E.coli）R2566中进行诱导表达;Ni-NTA法纯化重组蛋白;蛋白质印迹法（WB）鉴定重组蛋白。结果成功构建了PET-28a（＋）/Tp 0751原核表达载体;经表达、纯化后获得了相对分子量约为26 kD的融合蛋白;经WB分析能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论重组表达的Tp 0751重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步研究Tp 0751重组蛋白在梅毒致病过程中的作用奠定了基础。     

快速蛋白液相色谱系统纯化和分析小鼠肝癌细胞热休克蛋白70例的研究

目的：应用快速蛋白液相色谱（FRLC）系统建立分离和纯化615系小鼠肝癌细胞Hcaf细胞膜上热休克蛋白（HSP70）的分离方法。方法：用经43℃热处理8h的Hcaf细胞制备裂解液,用ConA-Sepharose4B和MonoQ柱进行连续分离,所得蛋白经电泳及Western-blot进行蛋白分子量及性质鉴定。结果：纯化蛋白经鉴定分子量70000的HSP70。结论：用此层析法经FRLP可分离纯度较高的HSP70。     

日本血吸虫天然抗原分子的柱层析分离纯化与鉴定

目的分离纯化日本血吸虫成虫(AWA)和未成熟虫卵(SIEA)可溶性抗原中的单一蛋白,为血吸虫病免疫诊断、预防提供新的抗原分子。方法柱层析分离纯化成虫和未成熟虫卵可溶性抗原,SDS—PAGE及银染色进行分析鉴定。结果得到了三种不同大小血吸虫分子抗原AwA18000u,SIEA42000u,SIEA130000u。结论实验证明柱层析法是一种快速分离纯化血吸虫单一组分抗原简单而有效的方法。     

VD_3结合蛋白的分离纯化

目的 :纯化VD3 结合蛋白 (DBP)。方法 :利用DBP的相对分子质量及电荷性质 ,分别用阳离子交换剂、阴离子交换剂和凝胶过滤等分离目的蛋白 ,SDS PAGE鉴定纯度 ,并进行活性分析。结果 :分离到相对分子质量为 5 80 0 0的蛋白质 ,SDS PAGE呈单一区带。结论 :成功分离纯化出DBP。     

人胰岛素瘤相关蛋白-2基因的克隆及原核表达研究

目的：克隆1型糖尿病自身抗原人胰岛素瘤相关蛋白-2(IA-2)的编码基因，并从大肠杆菌中表达具有免疫原性的人IA-2重组蛋白。方法：抽提胎脑总RNA，通过RT—PCR获得编码IA-2胞内结构域的cDNA，与Pinpoint Xa-IT质粒相连接，构建表达型重组质粒，经转化、筛选并鉴定后，从大肠杆菌诱导表达生物素酰化融合蛋白，进而用亲和层析纯化之，以dot—blot鉴定其免疫原性。结果：重组质粒转化的大肠杆菌经IPTG诱导表达及亲和层析后得到了纯度较高、分子量约为59kd的融合蛋白，表达产物用dot—blot证明具有免疫原性。结论：原核表达的生物素酰化人IA-2胞内段融合蛋白具有正确的免疫学构象。     

人宫颈癌传代细胞Ig样蛋白的纯化分析

目的:探讨非造血系统来源的恶性肿瘤细胞内Ig样蛋白与Ig分子在抗原性及分子结构上的关系.方法:应用亲和层析的方法将HeLa MR(人宫颈癌传代细胞)细胞内Ig样蛋白进行了纯化;并以SDS-PAGE及Western Blot方法将Ig样蛋白与IgG进行比较分析.结果:SDS-PAGE结果显示Ig样蛋白既有与IgG相近的轻、重链泳带,同时又分别在相对分子质量6 600、7 000左右出现两条泳带,此两条泳带与人IgG具有高度一致的抗原性.Western Blot结果显示,Ig样蛋白与IgG相同,不但可与抗人IgG多克隆抗体、单克隆抗体反应而且可与Protein A蛋白发生反应.结论:Ig样蛋白与IgG比较在抗原性上具有明显的一致性,而在分子结构上也表现明显相似性,但二者不完全相同.