两种PCR方法检测食品中花生过敏原Arah1成分

采用套式PCR和荧光实时定量PCR两种方法检测食品中花生主要过敏原Ara h1基因成分,从而推断食品中是否含有花生过敏原成分。根据GenBank提供的花生主要过敏原基因Ara h1 DNA序列(登录号为AF432231)的中一段序列分别设计2对内外特异性引物,扩增目的基因片段来建立套式PCR方法;再用上述内引物扩增目的片段,建立SYBRGreenⅠ荧光实时定量PCR方法,绘出拷贝数-CT标准曲线;并通过这2种PCR方法检测8种食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因成分。套式PCR方法具有较高的特异性和灵敏度,SYBR GreenⅠ荧光实时定量PCR方法的标准曲线在3×102至3×108 copies范围内线性关系良好,R2值为0.993 5,检测低限设定为3×103 copies。2种方法检测8种食品样品,结果均与食物过敏原标注内容相符。本研究建立的2种方法具有快速、灵敏等优点,可用于食品中花生主要过敏原基因Ara h1成分的检测。     

牛奶过敏原PCR检测方法的建立

牛奶是主要的食品过敏原之一,其中β-乳球蛋白是引起牛奶过敏的主要成分。基于牛奶β-乳球蛋白基因序列设计一对PCR引物,经过反应条件的优化,建立了适合检测牛奶β-乳球蛋白过敏原的PCR方法。实验结果表明,当PCR反应体系中模板DNA量为25ng,引物浓度为4mmol/L时,检测效果最佳。所建立的方法不仅可用于不同保质期、不同来源牛奶β-乳球蛋白过敏原的测定,亦可用于牛、羊奶不同比例混合物中β-乳球蛋白过敏原的检测。     

定量检测食品中榛果过敏原成分

定量检测食品中过敏原榛果过敏蛋白,构建目的基因的标准品及标准曲线。以榛果的DNA为模板,针对油体蛋白基因设计引物进行PCR扩增,构建质粒,经鉴定测序,用荧光定量PCR制作标准曲线。成功克隆油体蛋白目的基因片段,并以此为标准制作出荧光定量PCR标准曲线,线性关系良好,灵敏度高,检测限低于10个拷贝,特异性强,准确可靠。成功建立荧光PCR方法定量检测食品中过敏原榛果成分,构建油体蛋白基因的标准品及标准曲线。     

实时定量PCR技术检测食品中花生过敏原Ara h1基因成分

采用Taqman探针PCR技术,建立食品中花生主要过敏原基因Ara h1的检测方法.根据GenBank提供的Ara h1基因(序列号AF432231)中一段DNA序列设计特异性引物与Taqman探针,扩增该目的基因,建立拷贝数-CT标准曲线,可通过标准曲线方程计算食品中含有花生主要过敏原Ara h1基因拷贝数(copies),并用于检测8种食品中是否含有残留的该过敏原基因.此标准曲线在1.5×103copies～1.5×107copies范围内线性关系良好,R2值为0.9759;8种样品检测结果与食物过敏原标注内容相一致.     

TaqMan探针荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

建立了检测乳中产肠毒素D的金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR方法,以SED基因为肠毒素D的检测靶序列,设计荧光定量PCR引物和Taq Man探针,将构建的重组质粒作为阳性对照,建立了对产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速检测的Taq Man探针荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,Taq Man探针实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素D的方法具有极强的特异性,标准曲线的相关系数为0.999,最低可检测到40copies/m L的阳性质粒,检测乳中产肠毒素D金黄色葡萄球菌的灵敏度为1.0×102CFU/m L。该检测方法具有较好的特异性和灵敏性,在产肠毒素D金黄色葡萄球菌快速筛查方面具有良好的应用前景。     

芝麻过敏原PCR检测方法

芝麻是重要的食品过敏原之一,微小剂量即可引起严重的过敏反应。针对芝麻过敏蛋白-2S白蛋白的基因序列设计PCR扩增引物,建立并优化芝麻过敏原检测的普通聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法。结果表明,两种方法的最低检测限分别为0.1,0.01ng DNA,该方法特异性良好,成本较低,具有一定的应用价值。     

实时荧光PCR定量检测食品中单增李斯特菌

目的建立快速、敏感、特异的食品中单增李斯特菌检测方法。方法针对单增李斯特菌溶素A基因（hlyA）设计一对引物和一条探针，并用该引物和探针运用实时荧光PCR技术对单增李斯特菌的DNA、细胞、质粒和样品进行实时荧光PCR定量检测。结果利用实时荧光PCR技术，建立了DNA校正曲线、细胞校正曲线和质粒校正曲线。DNA校正曲线在1～32CFU/ml、细胞校正曲线在32—320CFU／ml、质粒校正曲线在1—37Copies／ml，线形关系良好，且三种校正曲线检测样品得出的结果基本吻合。结论本试验建立起来的实时荧光PCR定量检测单增李斯特菌的方法灵敏度高、特异性好、准确，可应用于食品中单增李斯特菌的检测。     

乳中志贺氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为了快速、有效的检测乳中的志贺氏菌,建立一种特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR方法。根据GenBank公布的志贺氏菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物,对提取的志贺氏菌DNA模板进行PCR扩增,对目的基因进行克隆和测序,然后利用荧光定量PCR方法,对志贺氏菌进行检测,确定其扩增条件。建立的方法特异性强,检测的灵敏度可达到10-6 ng/μL。利用建立的方法可检测乳中2.84 cfu/mL的志贺氏菌。该方法为快速、准确检测乳中的志贺氏菌提供了参考。     

食品中牛奶过敏原成分LAMP检测方法的建立

目的 建立食品过敏原牛奶成分LAMP检测方法,并与实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法比对。方法 针对牛线粒体细胞色素b(cyt-b)基因设计LAMP引物并建立反应体系,在特异性和灵敏度方面与real-time PCR检测方法比对。结果 本研究建立的LAMP方法检测9份不同品牌的牛奶和羊奶及其加工制品,没有出现交叉反应,具有良好的特异性。通过添加试验方法的检测灵敏度为0.5 %,与real-time PCR方法检测灵敏度相当。检测了69份实际样品,检测结果与real-time PCR检测结果一致。结论 本研究建立的食品过敏原牛奶成分LAMP检测方法简单经济,检测结果可靠,可有效缩短检测时间,适用于过敏原牛奶成分的检测,具有良好的应用前景。     

食品中牛奶过敏原成分LAMP检测方法的建立

目的建立食品过敏原牛奶成分LAMP(loop-mediated isothermal amplification)检测方法,并与实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法比对。方法针对牛线粒体细胞色素b(cyt-b)基因设计LAMP引物并建立反应体系,在特异性和灵敏度方面与real-time PCR检测方法比对。结果本研究建立的LAMP方法检测9份不同品牌的牛奶和羊奶及其加工制品,没有出现交叉反应,具有良好的特异性。该方法的检测灵敏度为0.5%,与real-time PCR方法检测灵敏度相当。检测了69份实际样品,检测结果与real-time PCR检测结果一致。结论本研究建立的食品过敏原牛奶成分LAMP检测方法简单经济,检测结果可靠,可有效缩短检测时间,适用于过敏原牛奶成分的检测,具有良好的应用前景。     

基于TaqMan探针荧光定量PCR技术快速检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A

目的:建立检测金黄色葡萄球菌肠毒素A的Taq Man探针实时荧光定量PCR方法。方法:对金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因序列分析、对比,设计特异性引物和Taq Man探针,建立对金黄色葡萄球菌肠毒素A的快速检测方法,并验证该方法的特异性、稳定性和灵敏性。结果:Taq Man探针荧光PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A具有极强特异性,标准曲线相关系数为0.998,最低可检测出71个拷贝数的细菌DNA,检测乳中金黄色葡萄球菌肠毒素A菌灵敏度为1.3×102CFU/m L,不同浓度质粒重复性扩增试验Ct值的变异系数均3%,显示了良好重复性。结论:Taq Man探针荧光定量PCR方法可以在6h内快速、准确地检出金黄色葡萄球菌肠毒素A,为金黄色葡萄球菌快速检测和食物中毒快速诊断提供技术支撑,推动了荧光PCR技术在食品安全检测方面的实践应用。     

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR方法,快速检测样品中的副溶血性弧菌。方法根据Gen Bank已公布的副溶血性弧菌基因组序列,筛选特异性靶基因,设计特异性引物探针,优化反应体系,并在体系中加入内参(IAC),通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应。按照5~50 cfu/25 g的细菌量人工污染样品,以评价所建立反应的体系。结果以副溶血性弧菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μl;以10倍梯度稀释的菌液经水煮法提取的DNA为模板,最低检测限为4×102cfu/ml;以含有gyr B的质粒为模板,最低检测极限可以达到100 copies/μl;建立gyr B和gyr B-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好线性关系(r2=0.999);人工污染初始菌量为7 cfu/25 g时,样品中副溶血性弧菌增菌6 h即可检出。结论本研究所建立的gyr B-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中副溶血性弧菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止"假阴性"的发生,结果可靠,有利于实现海产品中副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。     

实时荧光定量PCR技术快速检测志贺氏菌

目的 建立实时荧光定量PCR法快速检测志贺氏菌。方法 提取志贺氏菌基因组为模板扩增virA基因片段, 将目的片段连接至pMD19-T载体得到重组质粒, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 验证所得到的重组质粒, 以紫外分光光度计测量重组质粒吸光度值A260, 并换算为质粒拷贝数后作梯度稀释得到不同浓度的质粒标准品; 进行荧光定量PCR分析并通过特异性、灵敏性实验以验证该方法的可行性。结果 重组质粒标准品浓度在103~108 copies/μL范围内线性关系良好(r2>0.99), 实时荧光定量PCR检测志贺氏菌时出现良好的扩增曲线, 鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均未出现扩增曲线。志贺氏菌的检出限为100 CFU/mL。 结论 本方法便捷、高效、可靠, 可用于志贺氏菌的快速定性定量检测。     

荧光定量PCR方法检测榛果过敏原成分

目的建立榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法,并将此方法与酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法进行比对实验。方法根据榛果成分oleosin特异性基因设计并筛选合适的引物和探针,优化反应体系和反应条件,建立榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法,对荧光定量PCR方法与ELISA方法检测结果进行分析。结果建立的榛果过敏原成分荧光定量PCR方法特异性良好,可用于榛果过敏原成分的定量检测,但检测灵敏度低于ELISA检测方法。结论所建立的榛果过敏原成分的荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度达到10 mg/kg,具有较好的实用性,ELISA检测方法灵敏度高于荧光定量PCR法,但当榛果过敏蛋白被破坏后有可能出现假阴性结果。     

牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR快速检测方法,根据沙门氏菌invA基因序列和荧光定量PCR要求设计了合适的特异性引物,然后提取菌体DNA,对目的基因进行克隆,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR扩增,绘制标准曲线,以沙门氏菌DNA为模板进行荧光定量PCR扩增,确定其扩增条件。结果表明,建立的方法特异性强,与志贺氏菌等致病菌无交叉反应,且方法的灵敏度高(为0.1 ng/L)。以掺入沙门氏菌的牛乳为样品,可检测到牛乳中44.2 mL~(-1)的沙门氏菌。该方法适用于快速、准确检测牛乳中的沙门氏菌,为实验室快速检测致病菌提供参考。     

食源性肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立与评价

利用基因组序列比对分析等生物信息学方法发掘肠球菌新的属特异性靶点,根据42个候选靶点序列设计50对引物,结合普通PCR初筛和荧光定量PCR复筛,挑选特异性和灵敏度等检测性能最佳的引物,建立相应的荧光定量PCR检测方法,并对该方法应用于食品中肠球菌检测时的效果作出评价。分析结果显示,特异性最强的引物为EF1902,利用该引物建立的荧光定量体系检测肠球菌时均产生特异性扩增信号,而检测非肠球菌菌株时均无特异性扩增信号形成。经优化PCR体系后,该方法的基因组DNA检测灵敏度为13.78拷贝/PCR,纯培养物灵敏度为38.4 cfu/PCR。以肠球菌人工污染牛奶,当初始接菌量为2.63 cfu/mL时,只需增菌6 h即可用该方法检出肠球菌。对52份食品样品进行检测准确率为94.23%,证实了该方法可应用于食源性肠球菌的快速检测。综上所述,作者建立的肠球菌荧光定量PCR方法,特异性强且灵敏度高,可应用于食品中肠球菌的快速检测。     

实时荧光PCR法测定婴幼儿辅助食品中过敏原鱼类成分

目的建立实时荧光PCR检法测定婴幼儿辅助食品中过敏原鱼类成分。方法通过改进的前处理方法,采用实时荧光PCR法,对45个样品进行检测,分别进行特异性、检出限以及适用性试验。结果用于特异性试验的18个样品中,只有鱼类出现特异性扩增;通过7个不同质量配比的鱼肉样品得出检出限低于0.01%;对市售20批样品进行检测,检测结果与样品标识相符。结论该方法快速、灵敏、准确,适用于婴幼儿辅助食品中过敏原鱼成分的检测。     

肉制品中表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的研究

根据表皮葡萄球菌16S基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立表皮葡萄球菌实时荧光PCR检测方法。通过对梯度含量的表皮葡萄球菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。实验结果表明,只有表皮葡萄球菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×10~3CFU/mL。该方法具有很好的研究价值和应用前景。     

实时荧光P C R 法检测食品中芝麻过敏原成分

本实验探讨采用实时荧光定量PCR 方法检测食品中的芝麻成分,结果表明：采用芝麻的引物和探针进行扩增时;22 种样品经实时PCR 扩增,只有白芝麻和黑芝麻产生荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度实验结果表明能检测到10-5 稀释度的4.4 ×10-12g DNA的量,定量关系式为：y=－ 3.472018x+18.851009,R2=0.993088。这两对引物和探针具有极高的灵敏度和扩增效率,符合痕量检测要求。