Snail基因慢病毒载体的构建及其促进结肠癌细胞上皮间质化的研究

【目的】 构建Snail基因慢病毒载体,研究Snail基因的表达与结肠癌细胞上皮间质化的关系。【方法】 利用Gateway Technology法构建Snail基因表达质粒和空白对照质粒,行慢病毒包装,成功构建Snail基因慢病毒载体后,在结肠癌细胞系caco2中转染Snail基因质粒及空白载体对照,构建稳转细胞株caco2- Snail和caco2-vc,并在LoVo细胞中瞬时转染上述质粒,对Snail及E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达进行检测,并用划痕、Tanswell实验对细胞的迁移侵袭能力进行研究。【结果】 成功构建Snail基因慢病毒载体并经测序证实：在转染Snail的细胞株中有明显的Snail基因及蛋白表达,其上皮标记E-cadherin的表达比转染空载体的对照组细胞明显下调,且其迁移侵袭能力要强于对照组细胞。【结论】 Snail基因慢病毒载体在宿主细胞中表达稳定可靠,可以作为研究上皮间质化很好的工具,Snail基因有明显促进结肠癌细胞上皮间质化的作用。     

LyGDI真核表达载体构建及稳定转染A549细胞株的建立

目的构建Rho蛋白鸟苷解离抑制因子（LyGDI）真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法PCR扩增LyGDI基因片段,构建pEGFP-C1-LyGDI真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性。脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株,RT-PCR、免疫印迹检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达LyGDI蛋白。结论LyGDI真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究LyGDI过度表达对肿瘤侵袭性和转移的影响奠定了实验基础。     

鸟苷酸解离抑制因子-2 真核表达载体构建及稳定转染A549 细胞株 的建立

目的构建Rab蛋白鸟苷酸解离抑制因子-2(GDI2)真核表达载体并建立稳定转染A549细胞株。方法聚合酶链反应(PCR)扩增GDI2基因片段,构建pcDNA3.1-GDI2真核表达载体,经酶切、PCR、测序验证其正确性,脂质体法转染真核细胞A549,G418筛选建立稳定转染的细胞株。免疫印迹法检测稳定转染的细胞株。结果构建了真核表达载体并建立了稳定转染的A549细胞株,成功表达GDI2蛋白。结论 GDI2真核表达载体成功构建及稳定转染A549细胞株的建立,为研究GDI2过度表达对肿瘤侵袭和转移的影响奠定了实验基础。     

rL-IL29对肺腺癌A549细胞生物学特性的影响及相关机制

目的: 探讨表达IL-29的重组新城疫病毒LoSota株（recombinant Newcastle disease virus LoSota line expressing IL 29,rL IL29）对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的作用及其机制。方法: 体外培养肺腺癌A549细胞,以rL-IL29感染的A549细胞为rL-IL29组,LoSota株新城疫病毒（NDVL）感染的A549细胞为NDVL组及PBS处理的A549细胞为对照组。蛋白质印迹法检测各组A549细胞中NDV HN、IL-29蛋白的表达;CCK8法、划痕试验及Transwell侵袭实验检测rL IL29对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;蛋白质印迹法检测细胞E-钙黏蛋白、MMP2、波形蛋白及AKT/NF κB通路相关蛋白的表达水平。结果： A549细胞感染rL-IL29后,NDV HN及IL-29蛋白均稳定表达,且明显高于NDVL组及对照组;rL-IL29及NDVL感染A549细胞后能够抑制细胞的增殖、迁移及侵袭,且rL-IL29作用更强;与对照组及NDVL组比较,rL-IL29感染后A549细胞中E-钙黏蛋白表达量明显增加,波形蛋白、MMP2（66 kDa/72 kDa）、p AKT及P65蛋白表达明显减弱（均P＜0.05）。 结论： rL-IL29可能通过阻碍AKT/NF-κB信号通路上调E-钙黏蛋白表达和下调波形蛋白、MMP2蛋白表达,从而抑制肺腺癌A549细胞增殖、侵袭及迁移。     

细胞膜上稳定表达融合蛋白CRT/vGPCR A549细胞株的建立

目的 将人钙网蛋白(calreticulin,CRT)基因与病毒G蛋白偶联受体(virus G-protein couple receptor,vGPCR)基因进行基因重组,用此重组基因建立细胞膜上稳定高表达CRT/vGPCR融合蛋白的人肺癌A549细胞株.方法 从pSG5-vGPCR质粒中获得全长vGPCR基因片段并与CRT全长编码序列的3′端连接形成融合基因,然后将融合基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中.用此质粒转染人A549肺癌细胞,通过G418筛选建立稳定转染的A549细胞株,用RT-PCR检测重组融合基因的表达,用细胞免疫荧光分析鉴定融合蛋白的表达及其在细胞膜上的定位.结果 成功获得重组融合质粒pcDNA3.1(+)-CRT/vGPCR,经DNA序列测定证实融合基因两阅读框(ORF)对接无误.将上述质粒转染A549细胞后,建立了稳定转染CRT/vGPCR的A549细胞株,融合基因在A549细胞中表达并定位到细胞膜上.结论 通过与CRT基因融合重组,具有膜定位能力的vGPCR能将CRT蛋白高效包被到肿瘤细胞膜上.     

miR-129通过抑制T细胞因子4的表达影响肺癌A549细胞的上皮间质转化

目的: 探讨miR-129对肺腺癌细胞系A549中T细胞因子4（TCF4）的表达及上皮间质转化（EMT）进程的影响及其机制。方法: 将miR-129寡核苷酸片段miR-129 mimic转染A549细胞,实时定量PCR验证转染效率。实时定量PCR和蛋白质印迹实验检测转染后A549细胞TCF4、E-钙黏蛋白和波形蛋白的mRNA和蛋白表达水平。设计合成miR-129 mimic,将其与TCF4 3′-UTR报告基因质粒共转染HEK-293细胞,检测miR-129对TCF4报告基因质粒荧光素酶活性的影响,证实TCF4是miR-129的靶基因。结果： 实时定量PCR及蛋白质印迹结果均表明,上调miR-129表达后,A549细胞TCF4、波形蛋白表达明显下调（P<0.05或P<0.01）,E-钙黏蛋白表达明显上调（P<0.01）。miR-129明显抑制TCF4报告基因质粒荧光素酶活性（P<0.01）。结论： miR-129通过抑制TCF4的表达阻遏A549细胞的EMT进程。     

FHL1对肺腺癌细胞株A549生物学特性的影响

 目的 研究FHL1的表达对人肺腺癌细胞株A549生物学特征的影响。方法 以FHL1 mRNA及shRNA慢病毒载体转染肺腺癌细胞株A549,并采用Western blot及RT-PCR法筛选检测稳定过表达FHL1肺腺癌细胞株模型及低表达细胞株模型;运用CCK-8实验、Transwell实验、流式细胞仪、细胞集落形成实验等方法对其增殖、侵袭、凋亡及锚定非依赖性生长生物学特性进行检测评估。结果 FHL1稳定过表达及低表达组的Western blot及RT-PCR法检测显示病毒转染效果可靠稳定;CCK-8实验提示低表达组的细胞增殖情况明显高于过表达组及空白组(P=0.002 2);流式细胞仪检测提示过表达组的细胞总体凋亡率为50.48%,明显高于两个低表达组(16.41%、20.12%)及空白对照组(25.90%),差异有统计学意义(P<0.001);Transwell实验提示过表达组细胞表现出的侵袭性明显低于低表达组及空白组差异有统计学意义(P<0.001);成集落实验显示过表达组细胞株形成的集落数为28.7±6.0,明显少于两个低表达组(157.0±6.4、150.7±9.5),差异有统计学意义(P<0.001)。结论 稳定过表达FHL1肺腺癌细胞株A549模型及低表达模型构建成功。FHL1的表达对于肺腺癌细胞株A549的增殖、侵袭及转移均有抑制作用,并能够诱导其加速凋亡。     

重组表达载体plRES Rb94的构建及其对肺腺癌A549细胞株中SphK表达的影响

目的构建真核表达质粒pIRES Rb94,观察Rb94基因对鞘氨醇激酶（SphK）表达的影响。方法根据Rb94基因序列设计、合成引物,构建以内部核糖体进入位点（IRES）相连的Rb94基因的真核表达质粒pIRES Rb94,经脂质体转染A549细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用Real time RT PCR和Western boltting法检测Rb94基因并观察其对人肺腺癌A549细胞株SphK表达的影响。结果成功构建重组表达质粒pIRES Rb94,转染A549细胞后获得稳定转染细胞株pIRES Rb94 A549,该细胞株中Rb94基因高效表达;SphK1表达下调而SphK2表达上调。结论真核表达质粒pIRES Rb94构建成功并可有效转染A549细胞,Rb94基因抑制SphK1的表达,增强SphK2的表达。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

S100A4敲除对胰腺癌细胞E-钙黏素的表达及黏附和侵袭的影响

目的:探讨S100A4在胰腺癌侵袭和转移中的作用机制作用机制.方法:利用RNA干扰技术将S100A4-siRNA转染至人胰腺癌Bxpc-3细胞,用荧光实时定量PCR和Western免疫印迹方法检测转染前后S100A4和E-钙黏素的mRNA和蛋白表达;以平板黏附模型检测转染前后癌细胞黏附能力变化;以Transwe11小室模型检测转染前后癌细胞迁移和侵袭能力变化.结果:转染后S100A4表达下凋,E-钙黏素的表达则升高;细胞黏附能力增强(P<0.05);体外侵袭能力显著降低(P<0.05).结论:S100A4基因下调E-钙黏素的表达是肿瘤细胞具有高侵袭性的机制之一.S100A4基因可以作为胰腺癌基因治疗的一个靶点.     

BAD慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的探讨促凋亡基因BAD(Bcl-2-associated death protein)重组慢病毒表达载体构建及其对肺癌A549细胞株增殖的影响。方法应用PCR法从含有目的基因的质粒pAV-MCMV-BAD-GFP中扩增BAD基因片段,克隆至慢病毒载体(pLVX-IRES-ZsGreen 1),应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染A549细胞,经流式细胞仪筛选稳定表达细胞株,Western blot鉴定重组慢病毒感染的A549细胞BAD的表达。采用CCK-8试剂盒定点检测细胞的光密度(OD)值,分析BAD蛋白过表达对A549细胞增殖能力的影响。结果酶切鉴定和基因测序证实长度为507bp的BAD基因成功克隆至慢病毒表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1;重组慢病毒通过感染A549细胞株和流式细胞仪筛选出单克隆细胞株BAD-A549,Western blot检测结果显示,细胞培养BADA549细胞可稳定过表达BAD蛋白。体外增殖结果显示,细胞培养120~144h,BAD组的OD值均较对照组低(P<0.05)。结论成功构建了BAD重组慢病毒载体,获得稳定表达BAD的A549细胞株。BAD过表达能有效抑制A549细胞的增殖速度。     

LSD1、E-钙黏蛋白及N-钙黏蛋白的表达对结肠癌细胞侵袭转移的影响

目的：探讨赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（ LSD1）、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白的表达与结肠癌细胞侵袭转移的相关性。方法利用Transwell体外细胞侵袭实验检测结肠癌细胞株Lovo、SW620、HT-29、HCT-8、HCT-116和对照细胞（ HEK293）的侵袭性,再利用Real-time RT-PCR和Western blot实验方法检测LSD1、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白在上述细胞中的表达,分析其与结肠癌细胞侵袭性的相关性。结果 SW620细胞中LSD1和N-钙黏蛋白的mRNA和蛋白水平明显高于其他4种结肠癌细胞和正常对照细胞（ F＝149.594,P＜0.05;F＝367.29,P＜0.05）,而E-钙黏蛋白mRNA和蛋白水平明显低于其他4种结肠癌细胞和正常对照细胞（ F＝51.23, P＜0.05）。 Transwell细胞侵袭实验显示SW620细胞的侵袭性明显高于其他4种结肠癌细胞和正常对照细胞（F＝300.15, P＜0.05）。相关性分析显示LSD1、N-钙黏蛋白的表达与结肠癌的侵袭性呈正相关, E-钙黏蛋白的表达与结肠癌的侵袭性呈负相关。结论 LSD1、N钙黏蛋白的表达与结肠癌细胞的侵袭性呈正相关,E钙黏蛋白的表达与结肠癌细胞的侵袭性呈负相关,三者可能在结肠癌的侵袭转移过程中发挥了重要作用。     

改建型STAT1-CC基因慢病毒载体的构建及其在肺癌A549细胞中的表达

目的:构建携带STAT1基因和突变型STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,转染肺癌A549细胞并检测STAT1和STAT1-CC基因在肺癌A549细胞内的表达.方法:采用PCR技术从质粒模板中扩增得到目的基因STAT1和STAT1-CC,将其接入含有CMV启动子和绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体中,构建慢病毒载体表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,双酶切和测序鉴定.分别将重组子Lenti-STAT1、LentiSTAT1-CC和包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,感染非小细胞肺癌细胞株A549.荧光显微镜观察A549细胞EGFP表达,Western Blotting验证STAT1在A549细胞株中的表达.结果:酶切及测序结果显示成功构建重组慢病毒表达载体Lenti-STAT1和Lenti-STAT1-CC,将慢病毒颗粒感染A549细胞48 h后,观察到宿主细胞内EGFP表达,Western Blotting证实STAT1蛋白在A549细胞中过表达.结论:本实验成功构建了携带STAT1基因和STAT1-CC基因的慢病毒表达载体,并在A549细胞中过表达STAT1基因.     

F10基因真核细胞稳定表达系统的构建与鉴定

目的 检测葡萄胎发病新基因F10在人多种细胞系中转录水平的表达,从中选取F10低表达的细胞株,构建F10稳定转染的表达系统,研究F10的功能.方法 荧光定量PCR检测F10在人A549、16HBE、Bel7402、HIC、HepG2、293、PC、MGC细胞株中的表达差异.采用电穿孔介导基因转染技术将已构建的pRc-CMV2-F10、pRc-CMV2转染A549细胞系.经G418筛选获得阳性单克隆细胞.细胞扩大培养后,荧光定量PCR技术鉴定F10基因在阳性克隆细胞中的表达.结果 新基因F10在人的8种细胞系中呈不同程度的表达,其中在Bel7402、PC、MGC中呈高表达,在HepG2、HIC中表达次之,293中表达量较低,16HBE、A549中表达量最低;稳定转染细胞株A549具有F10基因的整合和相应mRNA的高表达.结论 成功构建了稳定表达外源新基因F10的肺癌细胞系,为进一步研究F10基因的生物学功能提供了实验材料.     

胰腺癌患者表皮生长因子受体-2和E-钙黏蛋白表达的临床意义

目的探讨胰腺癌组织中表皮生长因子受体-2(Her-2)和E-钙黏蛋白的表达水平。方法收集山西医科大学第一医院病理科2010年3月至2016年6月期间诊断为胰腺癌患者的标本45例,采用免疫组织化学方法检测胰腺癌组织中Her-2和E-钙黏蛋白的表达水平。结果 Her-2在胰腺癌组织中表达上升;E-钙黏蛋白在胰腺癌组表达降低,且E-钙黏蛋白高表达随胰腺癌组织分化程度进展、淋巴结出现转移以及临床分期增加而降低。结论 Her-2和E-钙黏蛋白参与胰腺癌的发生、发展、侵袭、转移过程。     

蛋白质精氨酸甲基转移酶5促进人卵巢癌HO8910细胞迁移

目的: 探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)对人卵巢癌HO8910细胞上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)和迁移能力的影响。方法: 利用瞬时转染方法建立PRMT5过表达的HO8910细胞株,设空白对照组(野生型HO8910细胞株)、阴性对照组(转染pCMV-myc质粒)、实验组(转染pCMV-Myc-PRMT5质粒);同时采用shRNA干扰方法建立诱导型稳定敲低PRMT5基因的HO8910细胞株,设pLKO对照组(感染空载体慢病毒)、pKLO+ Dox(100 ng/mL)组、shPRMT5组(感染PRMT5 shRNA 慢病毒)和shPRMT5+ Dox(100 ng/mL)组;通过免疫印迹和qRT-PCR实验检测PRMT5 mRNA表达和干扰效率。实验分为shPRMT5组、shPRMT5+Dox组、pCMV-Myc组、pCMV-Myc-PRMT5组;Transwell实验检测细胞迁移能力;免疫印迹法检测EMT相关蛋白表达。结果： 免疫印迹和qRT-PCR验证成功建立过表达PRMT5和稳定诱导型敲低PRMT5的卵巢癌HO8910细胞株。PRMT5敲低后,卵巢癌HO8910细胞迁移能力显著下降(P均<0.01),间质标志相关分子包括基质金属蛋白酶2,波形蛋白,N-钙黏蛋白表达下调,上皮标志分子E-钙黏蛋白表达上调。此外,在卵巢癌细胞中外源表达PRMT5可显著促进HO8910细胞迁移(P均<0.05)。结论： PRMT5能够促进卵巢癌HO8910细胞EMT进程,促进细胞迁移。     

RNA干扰A549细胞核干细胞因子基因表达

目的探讨A549细胞株NS基因的表达干扰后,A549细胞株的mRNA表达水平及细胞增殖变化。方法构建NSshRNA真核表达载体,转染A549细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,RT-PCR检测NS基因沉默,MTT检测细胞增殖情况。结果构建的NSshRNA真核表达载体经菌落PCR和测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR检测显示构建的shRNA表达载体转染A549细胞后可显著降低NSmRNA的表达;M1vr结果显示干扰后细胞增殖速率明显减低。结论成功构建了一组针对NS基因的shRNA真核表达载体,转染A549细胞后NS基因表达被特异性沉默,且细胞增殖受到明显抑制,通过RNAi技术实现NS基因沉默可能是一种较有前景的肿瘤治疗方法。     

敲低ACTL8基因对子宫内膜癌细胞增殖与迁移的影响

目的探讨采用携带shRNA特异序列的载体转染子宫内膜癌细胞敲低肌动蛋白样蛋白8(ACTL8)基因对细胞增殖、侵袭迁移能力的影响及其机制。方法选取人子宫内膜癌Ishikawa细胞株进行实验研究,以携带shRNA特异序列的载体及空载质粒分别转染Ishikawa细胞株,形成敲低ACTL8基因的shACTL8组和以空载质粒转染的对照组。荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测两组细胞中ACTL8 mRNA表达,Western blot法检测两组细胞ACTL8蛋白表达,Transwell迁移和侵袭实验分析Ishikawa细胞侵袭和迁移能力,CCK8细胞增殖实验及平板克隆实验检测细胞的增殖情况,Western blot法检测两组细胞的E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、P21蛋白的表达情况。结果shACTL8组的ACTL8 mRNA、ACTL8蛋白相对表达强度均低于对照组(P＜0.05);shACTL8组的Ishikawa细胞侵袭、迁移水平均低于对照组(P＜0.05);在细胞培养后1天、2天、3天,shACTL8组的Ishikawa细胞数目测定OD值显著低于对照组(P＜0.05);平板克隆实验培养3天,可见shACTL8组培养皿中细胞生长数目明显少于对照组(P＜0.05);shACTL8组E-cadherin蛋白、P21蛋白表达强度高于对照组(P＜0.05);shACTL8组N-cadherin蛋白、MMP-9蛋白表达强度低于对照组(P＜0.05)。结论敲低ACTL8基因抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖、迁移、侵袭。     

DNA氧化损伤修复基因hOGG1高表达细胞株的建立

目的联合pcDNA3.1(+)/Myc-HisA-hOGG1和pGL3promoter荧光质粒稳定转染人肺腺癌A549细胞获得hOGG1基因高表达细胞株,并初步探讨转染细胞生物学特性的变化。方法成功构建pcDNA3.1(+)/Myc-His A载体后,大量抽提阳性重组子并在Fu GENE6的介导下联合pGL3promoter荧光质粒转染A549细胞(转染组),同时设空白对照组(A549)和阴性对照组[PGL3+pcDNA3.1(+)/Myc-HisA转染的A549细胞]。生物荧光检测转染细胞hOGG1mRNA表达的改变,蛋白质免疫印迹法检测转染细胞hOGG1蛋白表达水平。将3组细胞于不同高氧条件下培养,相差显微镜观察形态学变化,彗星试验比较各组细胞对抗损伤和修复能力的情况,同时测定DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的变化。结果转染细胞荧光素酶稳定表达,蛋白印迹检测转染组hOGG1蛋白明显高于两对照组细胞,提示hOGG1基因高表达细胞株建立成功。相同高氧条件下,转染组形态学变化明显减轻,彗星细胞率和olive tail moment明显低于空白组和阴性对照组,修复完成率高,修复时间缩短(P<0...     

CEACAM6介导上皮间质转化增强胰腺癌细胞侵袭能力和耐药性的研究

目的:研究CEACAM6对胰腺癌细胞株SW1990侵袭能力和耐药性的影响,并探讨上皮间质转化(EMT)在其中的作用?方法:筛选及鉴定过表达CEACAM6的稳定转染SW1990-CEACAM6细胞株,通过定量PCR和Western blot方法检测SW1990细胞株中EMT相关表型标志物的改变?通过Transwell实验检测过表达CEACAM6对SW1990细胞株侵袭的影响,MTT法检测耐药指数(RI)?结果:定量PCR及Western blot验证过表达CEACAM6细胞株SW1990-CEACAM6成功建立,其倾向于向间质细胞转化:波形蛋白(Vimentin)表达明显上调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下降?功能实验证实过表达CEACAM6具有促进SW1990胰腺癌细胞株侵袭作用,同时细胞株耐药性增强?结论:CEACAM6能够促进SW1990胰腺癌细胞株上皮间质转化,从而促进胰腺癌细胞的恶性转化?