IL-7和IL-21修饰的NK-92MI细胞对其自身及正常人外周血T细胞的 影响

目的： 研究经IL-7和IL-21修饰后的NK-92MI细胞的增殖和细胞毒性及其对正常人外周血中T细胞的影响。 方法： 通过基因工程将IL-7和IL-21基因片段构建到电转载体上,通过电转的方式构建了NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞。 以细胞计数法和CFSE/7-AAD流式术分别对NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞体外增殖活性和细胞毒性进行 比较。将正常人PBMC与NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞体外共培养后,用流式细胞术检测PBMC中T细 胞的表型变化;同时检测正常人活化后的T细胞与NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞共存时相互的细胞毒性以 及对肿瘤细胞的毒性比较。 结果： 成功构建了高表达IL-21的NK-92MI/IL-21细胞和同时高表达IL-7和IL-21的NK-92MI/IL-7& 21细胞;NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞对Jurkat和K562细胞的细胞毒性没有变化,但是NK-92MI/IL-21和 NK-92MI/IL-7&21细胞相对于亲本细胞NK-92MI的体外增殖活性有所提高;NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞对PBMC 中T细胞的活化有一定的促进作用;活化后的T细胞与NK-92MI、NK-92MI/IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞相互之间几乎无细胞 毒性;同时,当T细胞和3种NK细胞共存时,T细胞不影响NK细胞对K562细胞的细胞毒性。 结论： 基因工程修饰的NK-92MI/ IL-21和NK-92MI/IL-7&21细胞体外增殖活性有所提高,它们对外周血T细胞的活化有一定的刺激和促进作用;T细胞和NK- 92MI细胞之间无细胞毒性,同时活化T细胞的存在不影响NK-92MI细胞的细胞毒性。     

体外扩增肾癌患者自体NK细胞及其对人肾细胞癌786-O细胞的杀伤

目的:探究IL-15、4-1BBL基因修饰的人白血病K562细胞(modi-K562细胞)联合IL-2体外高效扩增肾细胞癌患者自体自然杀伤(natural killer,NK)细胞的方法,研究扩增前后NK细胞对肾癌细胞株786-O的杀伤作用。方法:10例肾癌患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)与modi-K562细胞在含不同浓度IL-2培养液中共育14 d,采用流式细胞术、Calcein-AM释放实验检测NK细胞的扩增情况、免疫表型及对肾癌786-O细胞的杀伤作用。结果:modi-K562细胞联合IL-2可有效扩增NK细胞,300 U/ml IL-2培养14 d时,NK细胞扩增(202.4±12.8)倍。在效靶比为20∶1时,扩增后NK细胞对786-O细胞的杀伤率为(72.0±4.3)%,显著高于扩增前NK细胞的杀伤率(34.2±3.6)%(P<0.01)。结论:IL-15、4-1BBL基因修饰的K562细胞联合IL-2在体外能有效扩增肾细胞癌患者NK细胞,扩增后NK细胞对肾癌786-O细胞的杀伤作用显著增强。     

放射线照射后NK-92 细胞对人宫颈癌细胞体外杀伤活性的研究

 目的 研究放射线照射后NK-92细胞对人宫颈癌细胞的体外杀伤活性。方法 应用医用电子直线加速器对NK-92细胞进行照射处理(0、400cGy)后，以体外培养人宫颈癌细胞系Hela为靶细胞，以NK-92的敏感细胞株K562作为对照，应用4h^51Cr释放法检测不同效靶比情况下NK-92细胞的杀伤活性。结果 NK-92细胞0cGy照射组，效靶比较低时(1：1、5：1)对Hela细胞杀伤率为15％～33％，随效靶比升高，杀伤率随之上升，10：1时杀伤率显著上升为47％，20：1时杀伤率仅上升了3％；对于K562细胞，杀伤率为33％～69％。400cGy组照射后2d，NK-92细胞对Hela细胞不同效靶比的杀伤率与0cGy组相比稍有降低，其总体杀伤率为14％～47％，对K562细胞杀伤范围在30％～60％之间。结论 放射线照射后的NK-92细胞对人宫颈癌Hela细胞系具有一定的杀伤活性。     

白细胞介素-27促进CIK细胞的增殖及其对淋巴瘤细胞的杀伤能力

目的： 初步探讨重组人白介素-27（interleukin-27, IL-27）体外对人外周血来源的细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer,CIK）细胞增殖及其对肿瘤细胞的杀伤能力的影响。 方法:无菌条件下分离健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,第0天加入IFN-γ、CD3单抗,之后根据加入不同细胞因子剂量随机分为六组进行CIK细胞培养：A组（IL-2：1 000 U/ml,正常对照组）, B组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：20 ng/ml）, C组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：10 ng/ml）, D组（IL-2：500 U/ml,IL-27：10 ng/ml）,E组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：5 ng/ml）, F组（IL-2：1 000 U/ml,IL-27：40 ng/ml）。倒置相差显微镜下观察各组CIK细胞生长情况,流式细胞术检测各组CIK细胞CD3 +CD56 +T、CD8 +T细胞的表达,自动细胞计数仪计数各组CIK细胞增殖情况,MTS方法测定各组CIK细胞对淋巴瘤K562细胞的杀伤活性。 结果： 培养第11天,D组与A、B、C组比较,CIK细胞中CD3 +CD56 +T细胞的表达\[（6657±244）% vs（6003±175）%,（5551±003）%,（5607±083）%;均P<005\]、CD8 +T细胞的表达\[（8167±197）%  vs（7030±267）%,（7492±247）%,（7443±190）%;均P<005\]都明显增强;D组CIK细胞培养的扩增倍数明显高于A、B、C组\[（4 81187±2307)  vs  (3 25773±9197), (379092±6449), (4 00985±4308)倍;均P<005\];效靶比40 ∶1时; D组CIK细胞培养第11天时杀伤力为（7671±221）%,显著高于其他各组（均P<005）。 结论： 细胞因子IL-27体外可显著提高CIK细胞的增殖能力和杀伤能力,最佳培养周期为11 d。     

miR-335-5p靶向调控Galectin-3调节前列腺癌细胞免疫逃逸的机制研究

目的:探讨miR-335-5p靶向调控半乳糖凝集素-3（Galectin-3）对前列腺癌细胞免疫逃逸的影响。方法:qRT-PCR检测正常前列腺上皮细胞WPMY-1及前列腺癌细胞LNCaP、PC-3、DU145中miR-335-5p的表达;将PC-3细胞分为:NC组、mimics NC组、miR-335-5p mimics组、miR-335-5p mimics+pcDNA组、miR-335-5p mimics+pcDNA-Galectin-3组,qRT-PCR检测各组细胞中miR-335-5p表达;western blot检测各组细胞中Galectin-3蛋白表达。将上述5组细胞分别与自然杀伤细胞NK-92MI共培养后,ELISA法检测共培养细胞上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、干扰素γ（IFN-γ）水平;CCK-8法检测NK-92MI细胞的免疫杀伤率;流式细胞术检测NK-92MI细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因、RNA下拉、RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）实验验证miR-335-5p与Galectin-3的靶向关系。结果:与正常前列腺上皮细胞WPMY-1比较,前列腺癌细胞LNCaP、PC-3、DU145中miR-335-5p的表达水平显著降低（P＜0.05）,且PC-3细胞中miR-335-5p的表达水平最低,因此选用PC-3细胞为后续研究对象;与NC组比较,miR-335-5p mimics组PC-3细胞中miR-335-5p表达水平显著升高,Galectin-3蛋白表达显著降低（P＜0.05）;与NC共培养组比较,miR-335-5p mimics共培养组细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平及NK-92MI细胞免疫杀伤率显著升高,NK-92MI细胞凋亡率降低（P＜0.05）;与miR-335-5p mimics组比较,miR-335-5p mimics+pcDNA-Galectin-3组PC-3细胞中miR-335-5p表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,Galectin-3蛋白表达显著升高（P＜0.05）;与miR-335-5p mimics共培养组比较,miR-335-5p mimics+pcDNA-Galectin-3共培养组细胞上清液中TNF-α、IFN-γ水平及NK-92MI细胞免疫杀伤率显著降低,NK-92MI细胞凋亡率升高（P＜0.05）;miR-335-5p靶向负调控Galectin-3表达。结论:过表达miR-335-5p通过靶向下调Galectin-3表达来抑制PC-3细胞免疫逃逸。     

K562细胞和树突状细胞在细胞因子表达方面的相互作用

目的:探讨共培养条件下血液肿瘤K562细胞和树突状细胞（dendritic cells,DCs）在表达细胞因子方面的相互作用情况,探索血液肿瘤发生发展过程中的免疫逃逸机制。方法:利用免疫磁珠试剂盒从人健康外周血中分离纯化出高纯度的CD14+单核细胞,一定浓度的巨噬细胞集落刺激因子（granlocyte-macrophage colomy stimulating factor,GM-CSF）和白介素4（interlenkins-4,IL-4）将单核细胞诱导分化为未成熟DCs（immature DCs,imDCs）,再用一定浓度的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）将imDCs诱导为成熟DCs（mature DCs,mDCs）,分别将imDCs 和mDCs与K562细胞在Transwell系统中共培养48h,对照组为正常培养48h的DCs和撤细胞因子培养48h的DCs,ELISA方法分别检测各组细胞上清液中IL-10、IL-12、转化生长因子β1（transformed growth factor-β1,TGFβ1）和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况。结果:共培养后,DCs表达细胞因子IL-12减少,DCs和K562细胞表达TGFβ1增加,K562细胞表达VEGF增加。结论:共培养后,两种细胞在某些机制的相互作用下,DCs表达IL-12能力降低,DCs和K562细胞表达TGFβ1的能力增高,K562细胞表达VEGF的能力提高,这可能是共培养后DCs免疫功能下降和血液肿瘤细胞逃脱机体免疫监视的细胞因子方面的原因。     

4-1BBL修饰小鼠结肠癌疫苗体外诱导抗肿瘤免疫反应的研究

背景与目的:研究4-1BBL(4-1BB Ligand,即CD137配体)转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL)特异性杀伤活性及刺激淋巴细胞产生细胞因子的作用.材料与方法:采用脂质体介导法将真核表达质粒pMKITneo/4-1BBL导入小鼠结肠癌colon26细胞,经G418筛选后获得4-1BBL高表达克隆,用丝裂霉素C(MMC)处理后,制成肿瘤细胞瘤苗,与经体外诱导的同系小鼠CTL共同培养,测定对CTL特异性杀伤活性及对脾细胞产生细胞因子(IL-2、IL.-4和IFN-γ)的影响.结果:转染4-1BBL的colon26细胞高表达4-1BBL蛋白,将该细胞经MMC处理后制成的瘤苗,与野生型colon26细胞相比,对CTL特异性杀伤亲本肿瘤细胞的作用明显增强(P＜0.01),但CTL对非亲本肿瘤细胞的杀伤作用无明显影响(P＞0.05);该瘤苗在体外能显著增强脾细胞分泌细胞因子(IL-2、IL-4和IFN-γ)的能力(P＜0.01).结论:4-1BBL转基因小鼠结肠癌细胞瘤苗能有效诱导抗结肠癌免疫反应.     

恶性胸腔积液来源的树突状细胞IFN-γ、IL-10的表达

目的检测恶性胸腔积液来源树突状细胞(DCs)及其培养上清中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-10(IL-10)的表达,评估对淋巴细胞的影响。方法收集15例肺癌患者的恶性胸腔积液,密度梯度离心后贴壁获取DCs前体,以粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导培养DCs,流式细胞仪分析表型,ELISA法检测DCs培养上清中IL-10和IFN-γ的浓度。结果体外诱导培养后获得了典型形态的DCs,高表达CD83、HLA-DR和CD1a,成熟DCs上清中IFN-γ浓度明显增高,而IL-10浓度显著降低。结论恶性胸腔积液来源的DCs可能促进Th1反应。     

PD-S15 融合蛋白体外特异性靶向PD-1 分子并快速扩增NK/T细胞

[摘要] 目的：探讨anti-PD-1（scFv）/IL-15/IL-15Rα-sushi （简称PD-S15）融合蛋白体外特异性结合PD-1 的能力及其对NK/T细胞增殖能力的影响。方法：化学合成人anti-PD-1（scFv）基因和人IL-15/IL-15Rα-sushi 融合基因,经过酶切连接构建重组表达质粒pUC57-PD-S15,用LipofectamineTM 2000 瞬时转染HEK293T细胞,收获细胞培养液上清,用Wb法检测细胞培养液上清中PDS15融合蛋白的表达;用不同配比的PD-S15/X-VIVOTM15 培养液对PBMC和TIL 分别诱导培养后,用流式细胞术检测PD-S15 融合蛋白体外特异性结合PD-1 的能力和对PBMC增殖及CD3+CD8+、CD3+CD4+、CD3-CD56+各细胞亚群比例的影响;用细胞计数法检测PD-S15 融合蛋白对TIL 增殖能力的影响。结果：pUC57-PD-S15 表达质粒经双酶切和测序验证构建成功并成功转染HEK293T细胞,目标蛋白相对分子质量大约为55 000,符合预期。PD-S15 融合蛋白体外具有PD-1 特异性结合能力（P<0.05）及NK/T细胞活化增殖能力（P<0.05）;与经典TIL 培养方案相比,PD-S15 培养方案体外活化扩增T细胞的能力更强（P＜0.01）。结论：PD-S15 融合蛋白体外能够特异性靶向PD-1 分子并快速扩增NK/T细胞,为后续从肿瘤组织内或外周血中选择性扩增CD8+PD-1+抗原特异性T细胞奠定了基础。     

K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果

目的：评价新建立的K562工程细胞联合IL-2扩增方案对人NK细胞扩增和活化的效果。 方法：采集健康志愿者和肿瘤患者的外周血PBMC并分离NK细胞,采用前期构建的K562工程细胞(将IL-15、4-1BBL和IL-18在白血病K562细胞上进行跨膜表达获取）联合IL-2培养方案对NK细胞进行扩增和活化,以流式细胞术检测NK细胞的扩增效果和NK细胞表面受体表达水平,CCK-8法检测扩增后NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和ADCC活性,CCK-8法检测在培养方案扩增末期加入TKD多肽对NK细胞的活化效果。结果：对于健康志愿者的NK细胞,新建立扩增培养方案可使NK细胞在PBMC中的比例提高至（93±3）%;使NK细胞中活化性受体NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的比例分别提高60%、40%、20%、40%和63%,而抑制性受体的表达变化不大;扩增后NK细胞对白血病细胞K562、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMU-7721和乳腺癌细胞MCF-7的杀伤活性分别提高了19%、29%、26%和28%,其ADCC活性从（33±5.6）%上升至（65±12）%;方案中增加TKD可使NK细胞的杀伤活性从（86±4）%提高至（96±2）%。对于肿瘤患者的NK细胞,新扩增方案使其在PBMC的比例提高至（90.0±8.0）%,其对K562细胞的杀伤活性提高了17%左右。 结论： K562工程细胞联合IL-2扩增方案可高效扩增NK细胞,明显激活其杀伤活性,扩增和活化的NK细胞可满足临床治疗的需要。     

逆转录病毒介导IL-2基因转移对K562细胞增殖周期的影响

应用逆转录病毒载体将IL-2基因导入人红白血病细胞系K562细胞中。转导18天后,细胞DNA周期分析发现空载体转导的细胞K562/neo及含IL-2基因载体转导的细胞k562/IL-2的G0/G1期比例降低,而G2 M期增高。转导30天后K562/neo DNA周期分布恢复至转导前水平,而K562/IL-2细胞G0/G1期比例仍低于未转导细胞,G2 M期仍高于未转导细胞。MTT法检测细胞增殖活性观察到K562/IL-2从培养第4天起增殖活性明显落后于未转导细胞,核分裂指数亦低于水转导细胞。光学显微镜观察见K562/IL-2细胞中出现较多巨大细胞及多核巨细胞,细胞核数目可多达20余个,推测多核巨细胞的形成可能与细胞核反复分裂而胞质不能分裂有关。进一步形态计量学分析证实IL-2基因修饰的K562细胞体积增大,巨大细胞出现率显著高于未转导的K562细胞。结果提示K562/IL-2细胞体积增大与G2 M期细胞比例增高有关,推测IL-2基因修饰可能导致K562细胞周期滞留于G2期。     

IL-4/IL-4R对肝细胞癌生物学行为的影响及潜在的作用机制北大核心CSCD

目的检测白细胞介素-4/白细胞介素-4受体(Interleukin-4/Interleukin-4 receptor,IL-4/IL-4R)对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)生物学行为的影响及潜在的作用机制。方法体外培养Huh7细胞,并进行转染,沉默细胞中IL-4R基因的表达。CCK8法检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。Western blot法探索可能的作用机制。结果 IL-4促进Huh7细胞的增殖(P=0.01),沉默IL-4R可抑制Huh7细胞的增殖(P=0.00033),且细胞早期凋亡增加(P=0.014),凋亡蛋白Bax(P=0.016)和Caspase-3(P=0.029)表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2(P=0.003)表达减少。沉默IL-4R并不影响细胞晚期凋亡(P=0.108)及细胞周期(G_0/G_1期:P=0.677、S期:P=0.139、G_2/M期:P=0.855)变化。IL-4促进JAK1(P=0.01)和STAT6(P=0.005)的磷酸化。沉默IL-4R后细胞内JAK1(P=0.016)和STAT6(P=0.019)的磷酸化水平均降低。结论 IL-4/IL-4R可以激活HCC内JAK1/STAT6信号通路、促进HCC的增殖。此外,还通过调节凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的表达,最终抑制细胞凋亡。     

胃癌及癌周组织中4-1BBL IL-18 mRNA及其蛋白表达

目的:通过检测胃癌、胃粘膜、胃周淋巴结、大网膜、小网膜及腹膜中4-1BBL、IL-18 mRNA和蛋白表达以探讨胃癌局部的免疫状况及其免疫逃逸的机理.方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例胃癌患者、胃粘膜、胃周淋巴结、大网膜、小网膜及腹膜中的4-1BBL、IL-18 mRNA表达;采用流式细胞术检测胃癌及癌周各组织中4-1BBL、IL-18的蛋白表达.结果:40例胃癌患者的癌组织、胃粘膜、大网膜、小网膜、腹膜及胃周淋巴结中均可检测出4-1BBL和IL-18 mRNA和蛋白表达,但胃癌组织中4-1BBL和IL-18 mRNA和蛋白表达均低于其它各组(P＜0.05).结论:胃癌组织内处于低免疫状态,推测肿瘤细胞免疫逃逸现象可能与4-1BBL和IL-18的缺乏有关.     

IL-27基因转染人食管癌细胞诱导PBMC产生IFN-γ和IL-12的研究

目的：探讨小鼠白介素（mIL-27）基因转染人食管癌细胞株诱导正常人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-γ和IL-12的作用。方法：以逆转录病毒作为载体，将mIL-27基因转染入人食管癌细胞株Ecal09获得表达mIL-27的阳性细胞克隆（Eca109／mIL-27），RT-PCR检测目的基因的表达，用MTT法检测转基因mIL-27对细胞增殖的影响，用EUSA法检测其诱导正常人PBMC产生IFN-γ和IL-12的能力。结果：建立了表达mIL-27基因的人食管癌细胞株，Eca109／mIL-27细胞中有mIL-27p28和EBI3亚基基因表达，而Eca109／LXSN和Eca109细胞中未见表达，P〈0．01；Eca109／mIL-27与Eca109／LXSN和Eca109体外的体外增殖差异无统计学意义，P〉0．05；Eca109／mIL-27诱导正常人PB—MC产生IFN-γ和IL-12的含量高于Eca109／LXSN和Eca109，P〈0．01。结论：IL-27基因转染人食管癌细胞后可以诱导PBMC产生IFN-γ和IL-12的能力提高，提示可以用于肿瘤的免疫治疗。     

CD137单抗联合IL-15体外扩增NK细胞及其对肺癌细胞的杀伤活性

目的:建立CD137单抗联合IL-15体外扩增NK细胞的方案,研究扩增后NK细胞对肺癌细胞的杀伤活性。方法:分离健康人外周血单个核细胞,经免疫磁珠阴性分选获取CD3-CD56+NK细胞,将NK细胞分成对照组、IL-2组、IL-2+CD137单抗组、IL-2+IL-15组、IL-2+CD137单抗+IL-15组进行培养,经锥虫蓝染色法计算NK细胞的扩增倍数,流式细胞术检测NK细胞的表型,LDH酶释放法检测NK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性,ELISA法检测扩增后NK细胞培养液上清中IFN-γ的分泌量。结果:经磁珠分选后NK细胞纯度为(93.28±3.21)%。IL-2+CD137单抗+IL-15组NK细胞扩增倍数明显高于IL-2+CD137单抗组、IL-2+IL-15组、IL-2组及对照组[(86.20±5.00)vs(60.01±5.00)、(49.06±4.39)、(17.04±1.49)、(3.95+0.23)倍,P<0.01]。IL-2+CD137单抗+IL-15组NK细胞对A549细胞的杀伤效率明显高于其他各组[(93.14±3.27)%vs(83.15±4.03)%、(71.25±3.24)%、(62.27±3.01)%、(49.38±2.35)%,P<0.01]。IL-2+CD137单抗+IL-15组培养液上清中的IFN-γ的分泌水平明显高于IL-2+CD137单抗组、IL-2+IL-15组、IL-2组及对照组[(296.25±9.79)vs(260.47±11.55)、(201.13±6.36)、(138.36±6.09)、(38.42±3.56)pg/ml,P<0.01]。结论:CD137单抗联合IL-15能高效扩增NK细胞,扩增的NK细胞高效杀伤A549肺癌细胞。     

体外扩增对食管癌患者NK细胞表面受体表达及其抑瘤活性的影响

目的： 探讨食管癌患者NK细胞扩增前后的受体表达及其对肿瘤细胞的杀伤。 方法： 收集福建省肿瘤医院食管癌患者外周血20例,健康供者（对照组）外周血10例。NK细胞培养采用细胞因子（IL-2+IL-12+IL-15+IL-18）组合,流式细胞术检测NK细胞免疫表型及其受体（CD56+、CD69+、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD158b、CD159a）的表达,LDH法检测不同效靶比时NK细胞对多种肿瘤细胞株（K562、Raji、Eca-109、TE-1）的杀伤作用。 结果： 与对照组相比,食管癌患者外周血CD3+、CD4+细胞比例以及CD4+/CD8+T细胞比值明显降低（P<0.05）,NK细胞（CD3-CD56+）及调节性T细胞（Treg）比例明显升高（P<0.05）。经细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合定向扩增20 d后,食管癌患者NK细胞比例高达90%以上,NK细胞数扩增达1 000倍以上（P<0.01）;而CD3+T细胞、CD4+、CD8+T细胞、CD19+B细胞、Treg细胞及单核巨噬细胞（CD14+）比例均显著降低（P<0.01）,且食管癌患者与对照组之间无统计学差异（P>0.05）。经细胞因子体外培养20 d后,NK细胞表面CD69及活化性受体（NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46）均明显上调,而抑制性受体（CD158b、CD159a）均明显下调（P<0.05）。培养20 d后,食管癌患者NK细胞对肿瘤细胞K562、Raji、Eca-109、TE-1的杀伤能力均显著高于培养前\[（69.2±5.1）% vs （42.3±3.0）%,（44.6±3.2）% vs （21.1±2.0）%,（69.7±3.9）% vs （50.3±35）%,（67.1±4.5）% vs （41.2±3.3）%;均P<0.01\]。 结论: 细胞因子IL-2+IL-12+IL-15+IL-18组合能有效扩增外周血NK细胞并上调其活并性受体的表达、下调抑制性受体的表达,其数量及功能均能满足临床治疗需要。     

细胞因子IL-7与IL-15联合优化胃癌EBV特异性CTL细胞培养体系

目的:探讨细胞因子白细胞介素-7（IL-7）和IL-15在胃癌EB病毒（EBV）抗原特异性细胞毒性T细胞（CTLs）培养中较IL-2的优势。方法:提取胃癌患者外周血单个核细胞贴壁培养2 h,贴壁细胞加IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导树突状细胞（DC）,成熟的DC负载EBV抗原肽与T细胞混合培养,诱导EBV-CTLs,比较在细胞因子IL-2或IL-7/15培养条件下诱导的EBV-CTLs的扩增能力、表型、免疫应答及体外杀伤能力的差别。结果:与细胞因子IL-2相比较,IL-7联合IL-15培养的EBV-CTLs细胞中含有较高比例的CD3+ T细胞［（91.2±1.5）% vs （80.8±1.6）%,P=0.008 4］以及较高比例的CD3+CD8+ T细胞［（66.8±2.3）% vs （30.17±6.9）%,P=0.007 6］;在维持中央记忆性T细胞扩增方面,IL-7联合IL-15扩增的EBV-CTLs细胞中含有较高比例的CD8+CD62L+ T细胞［（26.4±2.3）% vs （9.6±1.4）%,P=0.003 6］及CD8+CD27+ T细胞［（38.5±3.7）% vs （16.7±2.9）%,P=0.01］;在免疫应答能力方面,接触DC负载抗原肽24 h后,IL-7联合IL-15培养的EBV-CTLs能分泌更多的γ干扰素（IFN-γ）,且CD137上调明显高于IL-2组;在体外杀伤实验中,IL-7联合IL-15诱导的EBV-CTLs对表达EBV抗原的靶细胞表现出更强的杀伤作用。结论:IL-7联合IL-15在扩增胃癌抗原特异性EBV-CTLs方面具有优势,扩增的细胞中含有较高比例的CD3+CD8+ T细胞,且能维持中央记忆性T细胞的扩增,表现出有更强的免疫应答和体外抗肿瘤效果,为其进一步临床个体化治疗 EBV阳性胃癌提供客观实验依据。     

IFN-γ和IL-4对乳腺癌细胞MCF-7生长及雌激素受体亚型影响的观察

目的:探讨干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-4(IL-4)对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长特性及雌激素受体(ER)亚型表达的影响。方法:以不同浓度IFN-γ(50、100和150μg/L)或IL-4(5、10和25μg/L)分别作用MCF-7细胞24、48、72和96h,MTT法检测细胞的增殖水平。选择100μg/L IFN-γ或10μg/L IL-4作用细胞96h(M/IFN-γ或M/IL-4),蛋白质印迹法检测ERα和ERβ的蛋白表达,流式细胞术分析细胞周期,RT-PCR检测凋亡抑制基因mRNA表达。结果:与对照组相比,IFN-γ作用96h后,细胞增殖活性受到抑制(100μg/L组P=0.000,150μg/L组P=0.003),G0～G1期细胞比例增多(P=0.003),S期减少(P=0.005),ERβ蛋白表达水平增加,P=0.038。IL-4作用96h后,细胞增殖活性增强(10μg/L组P=0.006,25μg/L组P=0.002),G0～G1期细胞比例减少(P=0.008),S期增多(P=0.007),ERβ蛋白表达水平减少(P=0.021),凋亡抑制基因的表达水平增加,P值分别为0.002、0.000和0.004。结论:辅助性T淋巴细胞1型(Th1)类细胞因子IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4可分别促进或抑制ERβ表达,进而抑制或促进肿瘤细胞生长;Th1/Th2偏移对乳腺癌细胞生长特性的作用,可能与改变ER亚型表达比例有关。     

IL-12基因联合吡柔比星治疗裸鼠膀胱癌移植瘤的实验

目的 探讨联合应用白细胞介素12(IL-12)质粒和吡柔比星（THP）对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 将人EJ膀胱癌细胞株裸鼠腋下接种,成瘤后设4组（每组6只）：联合组于骨骼肌注射IL-12真核表达质粒pcAGGS-mIL-12和腹腔注射THP;IL-12组骨骼肌注射pcAGGS-mIL-12;THP组腹腔注射THP;对照组肌肉及腹腔注射0.9%氯化钠溶液,以上注射每周2次,共4次。观察各组裸鼠肿瘤大小变化。4周后处死荷瘤鼠。免疫组织化学法检测肿瘤内VEGF 表达。ELISA法测定血液及肿瘤组织中IL-12和γ-干扰素(IFN-γ)的表达。结果 联合组肿瘤生长明显抑制,瘤重及体积明显小于其他组。ELISA法表明IL-12组和联合组 IL-12和IFN-γ都高表达。免疫组织化学法表明联合组VEGF基因表达量明显低于其他组（P<0.05）。结论 联合应用IL-12真核表达质粒pCAGGS-mIL-12和THP,对人膀胱癌裸鼠移植瘤的抑制作用明显强于单独应用IL-12和THP。     

IFN-α和IL-2联合激活的脐血对K562细胞的杀伤和净化作用研究

目的　探讨体外干扰素 α(IFN- α)联合白细胞介素 2 (IL- 2 )激活的脐血对慢性髓性白血病细胞株K5 62细胞的杀伤和净化作用。方法　采用细胞培养法和反转录聚合酶链反应法进行研究。结果　 IL- 2激活 3 d的脐血对 K5 62细胞具有显著的杀伤和净化作用 ,加用 IFN- α后这种作用得到明显增强。IL- 2单用或与 IFN- α联合对脐血 CFU- GM未见明显抑制作用。结论　 IFN- α可增强 IL- 2激活脐血对 K5 62的杀伤和净化作用。