阿司匹林对人结肠癌HT-29细胞肠分化标志物表达的影响

背景与目的：非甾体抗炎药阿司匹林临床防治结肠癌确切有效,近年来有研究认为其防治结肠癌最终通过对结肠癌干细胞调控而实现。当结肠癌干细胞分化成熟时,结肠癌将不再进展、甚至消退。本研究旨在探讨非甾体抗炎药阿司匹林对人结肠癌HT-29细胞株分化的影响。方法：采用活细胞计数试剂盒CCK-8检测不同浓度阿司匹林抑制HT-29细胞增殖的作用,得出IC₅₀;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测阿司匹林IC₅₀干预24、48和72 h,肠分化标志物黏蛋白2(mucin 2,MUC2)、三叶因子3(trefoil factor 3,TFF3)、蔗糖酶-异麦芽糖酶(sucroseisomaltase)和溶菌酶(lysozyme)的mRNA表达情况;采用免疫细胞化学法检测MUC2蛋白在细胞中的表达情况;采用蛋白［质］印迹法(Western blot)检测sucrase-isomaltase及lysozyme的蛋白表达情况。结果：阿司匹林能明显抑制HT-29细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性;RTFQ-PCR和Western blot结果显示,阿司匹林干预HT-29细胞48、72 h,与对照组比较,肠杯状细胞标志物MUC2、TFF3的mRNA表达均上调(P<0.05),肠吸收细胞标志物sucrase-isomaltase和潘氏细胞标志物lysozyme的mRNA及蛋白表达均下调(P<0.05);免疫细胞化学实验结果显示,阿司匹林干预48 h,MUC2蛋白表达较对照组上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：非甾体抗炎药阿司匹林能影响人结肠癌HT-29细胞肠分化标志物的表达,且可能导致其向杯状细胞表型分化。     

5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人结肠癌细胞E-cadherin基因表达及甲基化的影响

背景与目的:结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制仍未完全明了。目前认为DNA甲基化导致转录抑制是恶性肿瘤发生的重要机制之一。E-cadherin能抑制肿瘤的浸润和转移,被公认为是浸润、转移抑制基因。结肠癌常表现有E-cadherin基因失活。本研究通过检测人结肠癌细胞株HT-29中E-cadherin基因表达及甲基化状态,初步探讨结肠癌的发病机制。方法:光镜观察5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)干预前后细胞形态学变化;免疫细胞化学及RT-PCR检测不同浓度5-Aza-CdR干预对HT-29细胞中E-cadherin蛋白及mRNA表达的影响;甲基化特异性PCR(MSP)分析细胞中E-cadherin基因甲基化状态。结果:5-Aza-CdR干预能使其甲基化的E-cadherin基因重新表达;免疫细胞化学染色检测1μmol/L5-Aza-CdR干预24h后细胞E-cadherin阳性率由(21±7)%提高到5μmol/L5-Aza-CdR干预时的(39±13)%;E-cadherin基因在HT-29细胞中有甲基化修饰。结论:E-cadherin基因启动子区异常甲基化是结肠癌发生、发展的重要机制之一,...     

SPRED1在结肠癌中的表达及意义

摘 要：［目的］ 探讨SPRED1在结肠癌中的表达，及其与结肠癌患者预后的相关性，以及对结肠癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响。［方法］ 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测SPRED1 mRNA在结肠癌细胞和组织标本中的表达，免疫组织化学技术检测SPRED1蛋白在结肠癌组织中的表达。使用小干扰RNA（siRNA）干扰结肠癌细胞内SPRED1表达后，CCK-8试剂盒检测结肠癌细胞增殖能力变化，Transwell小室检测结肠癌细胞迁移能力变化，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡水平。［结果］ SPRED1 mRNA在结肠癌细胞株和结肠癌组织中表达水平均显著上调（P均<0.001），高表达SPRED1患者的总生存期短于低表达SPRED1患者（HR=2.326，95%CI：1.340～4.062，P<0.05）。干扰SPRED1后，干扰组结肠癌SW480和SW620细胞在36h和48h后增殖能力显著下降（P<0.05），侵袭能力显著下降（SW480：t=42.05，P<0.0001；SW620：t=12.91，P=0.0002），且凋亡水平显著上升（SW480：t=18.46，P<0.05；SW620：t=18.52，P<0.0001）。［结论］SPRED1在结肠癌中表达上调，促进结肠癌的增殖和侵袭。     

siRNA敲减DNMT1表达对T-cadherin基因甲基化及结肠癌细胞生物学行为的影响

目的 肿瘤的发生、发展和侵袭转移是影响结肠癌治疗的重要原因,有研究发现DNA甲基化状态在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,抑制T-cadherin表达可增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力.本研究探讨siRNA敲减DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)基因表达对结肠癌细胞T-cadherin基因甲基化及细胞生物学行为影响.方法 设计针对DNMT1的siRNA1、siRNA2和siRNA3重组质粒,分别转染HT-29、SW620和HCT116细胞系,采用实时荧光定量PCR检测DNMT1表达,以筛选敲减效率最高的DNMT1 siRNA和细胞系.用敲减效率最高的DNMT1 siRNA转染相应细胞系,采用甲基化特异性PCR检测T-cadherin甲基化水平,采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测T-cadherin表达.用敲减效率最高的DNMT1 siRNA转染相应细胞系,采用噻唑蓝比色法、流式细胞术、Transwell和细胞划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移情况,观察敲减DNMT1对细胞生物学行为的影响;同时设置T-cadherin shRNA重组质粒转染组,观察同时敲减DNMT1和T-cadherin对细胞生物学行为的影响.结果 DNMT1 siRNA1重组质粒对HT-29细胞系DNMT1的敲减效果最好.DNMT1 siRNA1转染HT-29细胞后,DNMT1组T-cadherin基因甲基化水平明显低于空质粒组和空白组,DNMT1组与空质粒组(F=314.182)和空白组(F=283.625)差异有统计学意义,均P<0.001.DNMT1组和联合组DNMT1 mRNA表达量(0.27±0.08)和蛋白表达量(0.41±0.12)显著低于空质粒组和空白组.其中mRNA表达,DNMT1组与空质粒组(F=544.581)和空白组(F=525.811)组差异有统计学意义,均P<0.001;联合组与空质粒组(F=507.501)和空白组(F=494.958)也差异有统计学意义,均P<0.001.蛋白表达量,DNMT1组与空质粒组(F=217.550)和空白组(F=275.469)差异有统计学意义,均P<0.001:联合组与空质粒组(F=321.707)和空白组(F=407.225)也差异有统计学意义,均P<0.001:而DNMT1组和联合组比较mRNA(F=0.002,P=0.965)和蛋白表达量(F=0.811,P=0.394)均差异无统计学意义.DNMT1组T-cadherin mRNA表达量(1.17±0.34)和蛋白表达量(1.38±0.54)显著高于联合组、空质粒组和空白组.其中mRNA表达,DNMT1组与联合组(F=433.103)、空质粒组(F=313.768)、空白组(F=372.118)差异有统计学意义,均P<0.001.对于蛋白表达量,DN-MT1组与联合组(F=89.315)、空质粒组(F=156.745)、空白组(F=196.702)差异有统计学意义,均P<0.001.而联合组与空质粒组(F=1.310,P=0.262;F=0.144,P=0.714)和空白组(F=3.713,P=0.064;F=0.038,P=0.850)的mRNA和蛋白表达量比较差异无统计学意义.与联合组、空质粒组和空白组比较,DNMT1组第24、36、48、72 h的A值显著减小,F组别=14.479,P<0.001;F时间=37.755,P<0.001.DNMT1组与联合组(F=1004.194,P<0.001)、空质粒组(F=1190.815,P<0.001)、空白组(F=781.018,P<0.001)比较细胞总凋亡率显著升高;DNMT1组穿膜细胞数目为(61.3±10.7)个,与联合组(F=86.730,P<0.001)、空质粒组(F=282.962,P<0.001)、空白组(F=152.538,P<0.001)比较显著减少.DNMT1组细胞迁移距离为(235.8±6.3)μm,与联合组(F=2535.55,P<0.001)、空质粒组(F=9767.233,P<0.001)、空白组(F=8420.830,P<0.001)比较显著减少.而联合组与空质粒组和空白组比较,A值、细胞总凋亡率、穿膜细胞数目和细胞迁移距离均差异无统计学意义,P>0.05.结论 DNMT1 siRNA1可有效敲减HT-29细胞DNMT1表达,逆转T-cadherin高甲基化状态并上调其表达.敲减DNMT1可明显抑制HT-29细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭和迁移能力;而同时敲减T-cadherin能够逆转此种现象,说明敲减DNMT1引起的细胞生物学行为改变可能是通过T-cadherin来实现的.     

5-Aza-CdR诱导肿瘤细胞NY-ESO-1抗原的表达

目的：探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine, 5-Aza-CdR）对肿瘤细胞中NY-ESO-1抗原表达的诱导作用。方法：常规培养人胃癌细胞株SGC-7901、人肝癌细胞株H2P和MHCC97-H、人结肠癌细胞株HT-29和LoVo及人脑胶质瘤细胞株U251,RT-PCR和免疫细胞化学法检测5-Aza-CdR作用前后肿瘤细胞中NY-ESO-1 mRNA和蛋白的表达。结果：RT-PCR与免疫细胞化学检测仅见胃癌SGC-7901细胞阳性表达NY-ESO-1,其余5株肿瘤细胞不表达NY-ESO-1。NY-ESO-1阴性的肝癌细胞株H2P、结肠癌细胞株LoVo及脑胶质瘤细胞株U251经5-Aza-CdR（终浓度分别为1、5和10 μmol/L）处理6 d后,细胞形态和生长速度均无明显改变,而NY-ESO-1 mRNA和蛋白均被诱导为阳性表达,并随5-Aza-CdR浓度增加而阳性表达逐渐增强。结论：5-Aza-CdR能诱导肝癌、结肠癌、脑胶质瘤等肿瘤细胞中NY-ESO-1抗原的表达,为肿瘤免疫治疗提供了一条新思路。     

MicroRNA-4465对结肠癌细胞凋亡和侵袭的影响

目的 探讨microRNA-4465（miR-4465）在结肠癌细胞中的生物学作用及其潜在的调控机制。方法 qPCR检测SW480、HT-29和HCT-116三种结肠癌细胞中的miR-4465水平，然后在HCT-116细胞中过表达miR-4465，MTT法和流式细胞仪分别检测细胞活性和细胞凋亡，试剂盒检测Caspase-3活性，Transwell实验检测细胞侵袭，荧光素酶报告基因检测分别测定miR-4465与HMGA1、HMGA2或EZH2的靶向关系。Western blot和qPCR分别检测HMGA1、HMGA2、EZH2的蛋白和mRNA表达水平。结果 在SW480、HT-29和HCT-116三种结肠癌细胞中，miR-4465表达均显著下调（P<0.05）。过表达miR-4465能够降低结肠癌HCT-116细胞活性，提高细胞凋亡率，增强Caspase-3活性，抑制细胞侵袭（均P<0.05）。miR-4465直接靶向HMGA1、HMGA2或EZH2的3'-非翻译区（3'-UTR），进而负向调控其表达。结论 miR-4465过表达能够降低结肠癌细胞活性，促进细胞凋亡并抑制细胞侵袭，这可能与负向调控HMGA1、HMGA2或EZH2基因有关。     

DR4基因启动子甲基化对TRAIL诱导肺鳞癌细胞凋亡作用的影响

目的:探讨肺鳞癌中死亡受体4（DR4）不同甲基化状态是否会影响肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对肺鳞癌细胞的诱导凋亡作用。方法:采用甲基化特异性PCR（MSP）、RT-PCR和Western blot法检测5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理肺鳞癌细胞株（H226、SK-MES-1、H520）前后DR4基因启动子甲基化状态和基因表达情况;MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:MSP、RT-PCR和Western blot结果表明H226、SK-MES-1细胞DR4基因呈甲基化状态,其mRNA及蛋白均低表达,H520细胞中DR4基因呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白高表达;5-Aza-CdR干预后H226、SK-MES-1细胞DR4基因呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白表达较前均显著上调,差异有统计学意义（P＜0.05）,H520仍呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白表达量较前无明显差异。同时研究还证实TRAIL对H226、SK-MES-1细胞有不同程度的细胞增殖抑制率和凋亡率,但不敏感,5-Aza-CdR干预后,H226及SK-MES-1细胞对TRAIL的敏感性较前均显著增高（P＜0.05）。结论:5-Aza-CdR可以逆转肺鳞癌中DR4基因启动子甲基化状态,进而增加TRAIL诱导肺鳞癌细胞凋亡的作用。5-Aza-CdR联合TRAIL可能是治疗肺鳞癌的一种新策略。     

AQP-5基因沉默对结肠癌细胞增殖及信号转导通路的影响

背景与目的:水通道蛋白-5(aquaporin 5,AQP-5)在人结肠癌组织中表达增高,与结肠癌的发生、发展及转移过程有关。但AQP-5影响的信号转导通路及对结肠癌细胞的具体影响尚不明确。本研究通过抑制结肠癌细胞株HT-29内源性AQP-5的表达,探讨AQP-5对HT-29细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、细胞外调节激酶细胞外调节激酶(ERK)、c-jun氨基末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号转导通路的影响。方法:体外常规培养人结肠癌HT-29细胞,取对数生长期的细胞用于实验。蛋白质印迹法(Western blot)检测AQP-5-siRNA转染效率;采用噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测转染AQP-5 siRNA的HT-29细胞AKT、ERK、JNK和p38蛋白的磷酸化形式及总蛋白的表达水平。结果:AQP-5-siRNA转染使HT-29细胞AQP-5基因表达下调的效率达90%。MTT分析结果显示,转染了AQP-5-siRNA的HT-29细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05),流式细胞术发现转染了AQP-5-siRNA的HT-29细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。Western blot结果显示,与转染NS-siRNA的阴性对照组相比较,转染了AQP-5-siRNA的HT-29细胞磷酸化的AKT、ERK和JNK蛋白磷酸化形式表达量与总蛋白表达量的改变两者差异无统计学意义(P>0.05)。而转染了AQP-5-siRNA的HT-29细胞磷酸化p38与总的p38蛋白比值下降(P<0.05)。结论:针对AQP-5的si-RNA具有促进HT-29细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用,该作用可能与抑制p38MAPK蛋白的磷酸化活化有关。     

表观遗传修饰介导抑制SOSTDC1表达促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为

目的：探究含硬化蛋白域蛋白1（SOSTDC1）对宫颈癌细胞恶性生物学行为的调控及其分子机制。方法：收集2020年8 月至2022 年5 月间在福建省肿瘤医院活检或手术切除的53 例宫颈癌组织和相应的癌旁组织标本,免疫组化法检测SOSTDC1 蛋白在宫颈癌组织及相应癌旁组织中的表达,qPCR 法检测正常宫颈细胞、宫颈癌细胞中SOSTDC1 mRNA 表达;将SOSTDC1 过表达慢病毒（OE-sostdc1）和对照空病毒（NC）感染宫颈癌细胞SiHa 及CaSki,将其分为SiHa-OE-sostdc1、SiHa-NC、CaSki-OE-sostdc1、CaSki-NC 组,采用WST-1法、细胞集落形成实验、Transwell 实验和WB法检测转染各组SiHa 及CaSki 细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力和BMP、Wnt/β-catenin 信号途径相关蛋白及上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的表达。用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂2''-脱氧胞苷（5''-Aza-CdR）处理宫颈癌细胞后采用qPCR和WB法检测SOSTDC1 mRNA及蛋白的表达变化,用甲基化特异性PCR（MSP）检测5 例配对宫颈癌组织与癌旁组织中SOSTDC1 基因启动子区甲基化水平,同时qPCR 检测其SOSTDC1 mRNA水平。结果：与癌旁组织比较,SOSTDC1蛋白在宫颈癌组织中呈低表达（P<0.01）,且与淋巴结转移与FIGO分期有关联（均P<0.05）;与正常宫颈HUCEC细胞比较,SOSTDC1 mRNA 在宫颈癌C33A、HeLa、SiHa、CaSki 细胞中均呈低表达（均P<0.01）。过表达SOSTDC1显著抑制SiHa 及CaSki 细胞的增殖、迁移和侵袭能力（均P<0.05）。WB法结果检测显示,过表达SOSTDC1 显著抑制 SiHa 及 CaSki 细胞中磷酸化 Smad、Dvl2/3、β -catenin、VIM、N-cadherin、Snail 蛋白的表达（均P<0.05）,5''-Aza-CdR 处理后的SiHa 及CaSki 细胞中SOSTDC1 mRNA和蛋白水平均显著增加（均P<0.05）,MSP检测结果显示,相较于癌旁组织,宫颈癌组织中SOSTDC1基因启动子区呈高度甲基化,且SOSTDC1 mRNA水平降低（P<0.01）。结论：SOSTDC1在宫颈癌组织中呈低表达且与肿瘤的恶性进展关联,其表达下调与其基因启动子区高度甲基化有关,过表达SOSTDC1 可能通过阻断BMP及Wnt/β-catenin信号通路从而抑制SiHa、CaSki细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

沉默AQP-5表达对结肠癌细胞株HT-29凋亡影响机制探讨

目的 通过抑制内源性水通道蛋白(AQP-5)的表达,探讨AQP-5对HT-29细胞凋亡及凋亡抑制蛋白(inhibitaors of apoptosis proteins,IAPs)表达的影响.方法 体外常规培养人结肠癌HT-29细胞,通过siRNA技术抑制内源性AQP-5的表达,并经蛋白质印迹法检测AQP-5-siRNA转染效率;采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率;荧光实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染AQP-5-siRNA的HT-29细胞IAPs家族成员c-IAP1、c-IAP2、XIAP、NAIP、Survivin和Livin表达水平.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,转染AQP-5-siRNA的HT-29细胞AQP-5表达下调达90％.MTT分析结果显示,与转染NS-siRNA组细胞增殖抑制率(1.13±0.11)％相比,AQP-5-siRNA组的HT-29细胞增殖抑制率显著增加,高达(27.9±5.16)％,t=12.705,P＜0.001;流式细胞分析结果发现,与NS-siRNA组细胞凋亡率(0.99±0.18)％相比,AQP-5-siRNA组的HT-29细胞凋亡率显著增加,高达(10.81±1.32)％,t=-12.767,P＜0.001.荧光实时定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,与转染NS-siRNA组相比较,AQP-5-siRNA组c-IAP1(t=-3.232,P=0.018)、c-IAP2(t=-0.651,P=0.001)、XIAP(t=-9.296,P＜0.001)和Livin(t =-8.07,P＜0.001)的mRNA表达水平下降,AQP-5-siRNA组c-IAP1(t=-0.591,P=0.007)、c-IAP2(t=-4.889,P=0.008)、XIAP(t=-6.487,P=0.003)和Livin(t=-6.216,P=0.003)蛋白表达水平也下降,其中以XIAP下降最明显;Survivin和NAIP表达变化不明显.结论 AQP-5-siRNA可体外促进HT-29细胞凋亡,其机制可能与下调c-IAP1、c-IAP1、XIAP和Livin mRNA及蛋白表达有关.     

The roles of miR-200c in colon cancer and associated molecular mechanisms

The expression of miR-200c has been widely reported to be elevated in tumor tissues and sera of patients with colorectal cancer (CRC) and has been found to correlate with poor prognosis. However, how miR-200c regulates the apoptosis, survival, invasion, metastasis, and tumor growth in colon cancer cells remains to be fully elucidated. This study seeks to further investigate the role of miR-200c in colon cancer development. The expression of miR-200c in tumor and peritumoral tissues of 101 colon cancer patients was measured by real-time PCR. miR-200c expression in HCT-116 and HT-29 colon cancer cells was silenced by adenovirus-carried expression of antisense mRNA against miR-200c. The protein levels of PTEN, p53 Ser¹⁵, PP1, and activated caspase-3 in HCT-116 and HT-29 cells were measured by Western blot. This study demonstrated that the expression of miR-200c was significantly higher in tumor tissues than in peritumoral tissues of colon cancer patients. The elevated miR-200c expression significantly correlated with the TNM stage, lymph node metastasis, and invasion of colon cancer. Silencing miR-200c expression significantly induced cell apoptosis, inhibited long-term survival, invasion, and metastasis, and delayed xenograft tumor growth. Importantly, silencing miR-200c expression sensitized the therapeutic effect of Ara-C (Cytarabine). The effects of silencing miR-200c expression were associated with upregulation of PTEN protein and p53 Ser¹⁵ phosphorylation levels in HCT-116 cells and PTEN protein expression in HT-29 cells. In conclusion, miR-200c functions as an oncogene in colon cancer cells through regulating tumor cell apoptosis, survival, invasion, and metastasis as well as xenograft tumor growth through inhibition of PTEN expression and p53 phosphorylation.     

MicroRNA-99a促进结肠癌细胞的增殖和迁移及其可能机制

目的:探讨结肠癌患者组织中microRNA-99a表达水平以及对结肠癌细胞增殖和迁移的影响.方法:取南京医科大学附属常州二院胃肠病中心49例结肠癌患者肿瘤组织、癌旁组织(癌旁5cm)标本以及结肠癌细胞HCT-116、HT-29、SW-480、Caco-2和正常结肠上皮细胞HCoePic,采用实时荧光定量PCR检测结肠癌患者肿瘤组织和结肠癌细胞中microRNA-99a表达水平;结肠癌细胞株HT-29转染microRNA-99a抑制剂后,CCK-8法检测microRNA-99a对结肠癌细胞增殖的变化;transwell法观察microRNA-99a对结肠癌细胞迁移的影响;Western blotting检测了HT-29中FGFR-3的表达水平.结果:microRNA-99a表达在结肠癌组织中明显高于癌旁组织(6.27±0.48 vs 1.34±0.54,P＜0.05)、在肿瘤细胞中明显高于正常结肠上皮细胞(5.48±0.34,7.67±0.24,5.78±0.22,6.28±0.44 vs 1.45±0.37,P＜0.05).转染microRNA-99a抑制剂后,HT-29细胞的增殖和迁移能力均明显下降(P＜0.05);同时,HT-29中FGFR-3显著降低(P＜0.05).结论:microRNA-99a在结肠癌组织中高表达,低表达microRNA-99a可减弱结肠癌细胞的增殖和迁移能力,且可能通过FGFR-3信号通路发挥作用.     

miR－647在结肠癌细胞中的表达及临床意义

目的：分析miR－647在结肠癌组织及细胞系中的表达情况,探讨其对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及其可能的作用机理。方法：利用Real－time quantitative Polymerase Chain Reaction（qPCR）技术检测17例结肠癌患者癌及癌旁组织中miR－647的表达;利用qPCR技术检测正常人肠上皮细胞HIEC及结肠癌细胞HT－29中miR－647的表达;将miR－647 antagomir及对照分别转染至结肠癌细胞中,应用MTT实验检测细胞增殖,体外划痕实验检测细胞迁移能力,评价转染miR－647抑制剂对结肠癌细胞增殖能力和迁移能力的影响。结果：qPCR结果显示,与癌旁组织相比,miR－647在结肠癌肿瘤组织中表达明显升高;与正常人肠上皮细胞相比,人结肠癌细胞系HT－29中miR－647表达明显升高;MTT结果显示miR－647抑制剂可以显著抑制SW480和SW620细胞的增殖能力和细胞迁移能力。结论：miR－647通过促进结肠癌细胞的增殖和迁移能力,参与结肠癌的发生发展进程。     

藤黄酸联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡的效果和机制

背景与目的：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）能选择性地杀伤肿瘤细胞,但多种肿瘤对其耐药。该研究旨在探讨藤黄酸（gambognic acid,GA）与TRAIL联合对人结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤生长的影响及GA联合TRAIL抗结肠癌的作用机制。方法: 建立人结肠癌HT-29细胞裸鼠皮下移植瘤模型,测定TRAIL和（或）GA对裸鼠移植瘤的影响,采用H-E染色观察肿瘤组织形态结构改变,TUNEL法检测细胞凋亡状况;HT-29细胞经过siRNA干扰Nrf2表达后,通过AnnexinⅤ-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况,流式细胞术检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量,RT-PCR法检测Nrf2、Bcl-2、Bax和DR5 mRNA的表达水平。结果: 联合应用GA显著促进了TRAIL对裸鼠皮下移植瘤的生长抑制（抑瘤率达67.0%）和诱导凋亡作用,下调了组织中Nrf2、Bcl-2的表达,增强了Bax和DR5的表达;与阴性对照siRNA相比,Nrf2干扰能明显上调TRAIL诱导HT-29细胞的凋亡率,提高ROS含量,下调Nrf2和Bcl-2表达,上调Bax和DR5表达。结论: GA可能是通过下调Nrf2表达,使ROS水平升高而激活线粒体凋亡途径与死亡受体途径,从而逆转人结肠癌HT-29细胞体内外对TRAIL的耐药性。     

siRNA沉默livin的表达对人结肠癌HT-29细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默人结肠癌HT-29细胞livin表达对HT-29细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法:合成靶向livin的双链siRNA(livin-siRNA),转染HT-29细胞,RT-PCR及Western blotting检测HT-29细胞中livin mRNA及蛋白的表达,MTT实验检测HT-29细胞的增殖,流式细胞术检测HT-29细胞周期分布及凋亡,细胞侵袭实验检测HT-29细胞侵袭性的变化,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性的变化。结果:Livin-siRNA转染后48 h,与空白组、阴性对照组及脂质体组相比,livin-siRNA转染组HT-29细胞中livin mRNA水平明显下降(0.073±0.007 vs 0.395±0.082、0.423±0.025、0.418±0.032,P<0.05),其蛋白表达也明显下调(0.106±0.003 vs 0.456±0.065、0.473±0.078、0.491±0.045,P<0.05)。转染96 h后,livin-siRNA组HT-29细胞增殖能力明显低于对照组及脂质体组(0.564±0.102 vs0.833±0.127、0.860±0.153,P<0.05),且细胞凋亡率升高[(16.5±2.8)%vs(2.4±0.5)%、(3.7±1.0)%,P<0.05]。侵袭实验显示,livin-siRNA转染后,穿过Matrigel膜的HT-29细胞数量明显少于对照组及脂质体组[(31.3±4.5)vs(101.3±8.6)、(97.4±7.8)个,P<0.05)]。livin-siRNA组HT-29细胞的caspase-3活性低于对照组(0.160±0.023 vs 0.347±0.058,P<0.05)。结论:siRNA沉默livin的表达可抑制HT-29细胞的增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞的侵袭。     

下调miR-21对PDCD4表达及结肠癌HT-29细胞功能的影响研究

背景与目的：miR-21可能通过抑制PDCD4表达调控结肠癌浸润及转移等恶性行为。本研究通过下调miR-21表达后,检测结肠癌HT-29细胞功能的变化,并观察PDCD4在蛋白及mRNA表达水平的改变,探讨miR-21及PDCD4的表达在结肠癌恶性行为中的关系及机制。方法：构建靶向miR-21的干扰质粒simiR-21,转染HT-29细胞后,以实时定量PCR(qRT-PCR)法检测转染效率,MTT法检测转染后细胞增殖变化,流式细胞术检测转染后细胞调亡变化,Transwell检测迁移及浸润能力改变,蛋白质印迹法(Western blot)及qRT-PCR法检测干扰后PDCD4表达水平变化。结果：经qRT-PCR检测simiR-21在HT-29细胞转染效率为60%～65%,转染效率佳;MTT显示转染后72、96和120 h,HT-29增殖能力减弱(t=1.276,P<0.05;t=3.276,P<0.01;t=4.523,P<0.01);流式细胞术结果显示,与si-negative control及miR-21组对比转染后HT-29调亡率明显增加(t=2.132,P<0.05;t=3.524,P<0.05);Transwell结果显示,simiR-21转染细胞迁移能力降低(t=2.423,P<0.05;t=3.153,P<0.05),侵袭能力降低(t=3.245,P<0.05;t=5.236,P<0.05);Western blot检测结果显示,PDCD4蛋白在simiR-21细胞的表达水平明显上调(t=2.342,P<0.05;t=4.215,P<0.05);qRT-PCR检测结果显示,PDCD4 mRNA在simiR-21细胞的表达水平明显上调(t=2.261,P<0.05;t=3.492,P<0.05)。结论：simiR-21下调miR-21表达后,结肠癌HT-29细胞增殖能力受抑制,并促进其调亡,抑制迁移及浸润能力,PDCD4上调。miR-21可能通过下调PDCD4表达促进肿瘤细胞恶性行为,可作为结肠癌治疗新的靶向候选基因。     

DNA 甲基化抑制剂对肿瘤细胞中核糖核酸酶抑制因子表达下调的影响

背景与目的:人核糖核酸酶抑制因子 (ribonucleasE-inhibitor, RI) RI能有效抑制血管生成因子诱导的血管形成及某些可移植性实体瘤在动物体内的生长.然而, RI抗肿瘤的分子机制还未完全阐明.许多抑癌基因通过启动子区域异常的甲基化而使表达缺失,去甲基化抑制能使其表达恢复.为了进一步了解 RI的功能以及探讨 RI与肿瘤发生的关系,本实验拟研究甲基化抑制剂 5-aza-2′-deoxycytidinE-(5-Aza-CdR)对肿瘤细胞中 RI表达的影响.方法:用 5-Aza-CdR作用人乳腺癌细胞系 MCF-7、人胃癌细胞系 BGC-823、人的前列腺癌细胞系 DU-145和人结肠癌细胞系 HT-29.通过 RT PCR,蛋白免疫印迹法( Western blot) ,免疫荧光( immunofluorescence)和免疫细胞化学( immunocytochemistry)技术分析 RI基因的表达.结果:与对照组比较, 5-Aza-CdR能显著提高 RI基因在 MCF-7、 BGC-823和 DU 145细胞中的表达, RT PCR检测结果分别为 37.2%、 46.0%和 32.4%, Western blot检测结果分别为 26.4%、 20.9%和 24.4%( P< 0.01);但对 HT-29细胞没有明显的影响.结论: RI基因可能与胃癌、前列腺癌和乳腺癌的发生有关.     

NIBP在结肠癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨NIK和IKKβ连接蛋白（NIK and IKKβ binding protein,NIBP）在结肠癌组织中的表达及其与临床病理和预后之间的关系。方法:应用免疫组织化学染色法检测组织芯片中133例结肠癌和92例相匹配的癌旁正常结肠组织中NIBP蛋白的表达水平。结果:结肠癌组织中肿瘤细胞NIBP蛋白表达水平明显高于癌旁正常结肠组织上皮细胞（P=0.000）。NIBP蛋白表达水平与临床分期显著相关（P=0.044）,与性别、年龄、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移、远处转移、组织学类型、组织学分级无关。单因素生存分析显示NIBP蛋白高水平表达者较低水平表达者总生存期明显延长（P=0.006）,多因素分析结果表明NIBP蛋白表达水平是结肠癌患者独立的预后因素（HR=0.461,95%CI=0.229-0.925,P=0.029）。结论:NIBP可能参与结肠癌的发生发展,可能是预测结肠癌预后的新的生物学标志物。