HHIP基因CpG岛高甲基化水平参与胃癌的发生

目的：观察人胃癌、癌旁组织与胃癌AGS细胞中人音猬因子相互作用蛋白（human hedgehog interacting protein,HHIP）基因启动子区域CpG岛的甲基化水平,探索其与胃癌发生的关系。方法：RT-PCR检测30例人胃癌组织、癌旁组织及AGS细胞中HHIP mRNA的表达,免疫组织化学方法和甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP）分别检测胃癌组织和癌旁组织的HHIP表达和HHIP基因启动子区域甲基化状态。AGS细胞予甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycitydine,5-Aza-dc）处理前后,RT-PCR、MSP和硫化测序PCR（bisulfite sequencing PCR,BSP）分别检测AGS细胞中HHIP mRNA表达、启动子区域甲基化水平变化、CpG岛甲基化位点数量的变化;分析HHIP基因启动子区CpG岛甲基化水平变化与HHIP mRNA表达水平变化之间的相关性。结果：胃癌组织中的HHIP mRNA（0.82± 0.38 vs 1.60±0.26,P=0.000）和蛋白（0.51±0.03 vs 0.83±0.27,P<0.05）的表达均低于癌旁组织,并且与年龄、性别、TNM分期、分化程度、淋巴结转移均无显著相关性（均P>0.05）。癌旁组织中HHIP基因启动子区甲基化水平显著低于胃癌和AGS细胞\[（17.7±3.59）% vs （62.9±614）%、（99.7±0.67）%,均P<0.05\]。AGS细胞在5-Aza-dc干预后HHIP mRNA表达明显增高（4.68±022 vs 0.21±012,P<0.01）,HHIP基因启动子区甲基化水平明显下降\[（10.1±0.21）% vs （90.2±0.67）%,P<0.01\], CpG岛甲基化位点明显减少,并且HHIP基因启动子区甲基化水平与mRNA表达呈负相关（r=-0.693,P=0.00）。结论：HHIP基因启动子区CpG岛的高甲基化水平可能通过抑制HHIP基因表达参与胃癌的发生。     

SHP-1 在食管鳞状细胞癌组织中异常低表达的表观遗传学调节机制及其临床意义

目的：探讨食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）组织中蛋白酪氨酸磷酸酶1（protein tyrosin phosphatase 1，SHP-1）基因异常低表达的表观遗传学调节机制及其临床意义。方法：所用组织标本均来自河北医科大学第四医院2008-2011 年行食管癌根治术并且病理诊断为ESCC患者的癌组织及相应癌旁组织（距癌灶边缘2 cm以上），共71 例。ESCC细胞株（Eca109、Kyse170、Yes-2）培养完成后，进行甲基化抑制剂5-Aza-dC 或组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理，qPCR和Western blotting 实验检测ESCC组织和细胞系中SHP-1 mRNA和蛋白的表达变化，亚硫酸氢盐基因组测序（bisulfite genome sequencing，BGS）法检测ESCC 细胞系中SHP-1 基因启动子区CpG 位点的甲基化频率，甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MSP）技术检测ESCC组织和细胞中SHP-1 启动子区的甲基化状态，应用双荧光素酶报告基因实验检测SHP-1 启动子区CpG岛甲基化对其转录活性影响。分析ESCC组织中SHP-1 甲基化状态分别与临床病理特征和SHP-1 mRNA表达的关系，对组织SHP-1甲基化水平与ESCC患者生存率进行Kaplan-Meier 生存分析和Log-Rank 检验。结果:5-Aza-dC 处理后，SHP-1 mRNA蛋白在3种细胞株中的表达显著上调（均P<0.05），同时其启动子区的甲基化程度均明显降低(均P<0.05）；应用TSA处理细胞株后，SHP-1在各细胞株中的表达情况及甲基化状态无明显改变(P>0.05）；甲基转移酶处理细胞荧光素报告载体活性显著低于未处理细胞荧光素报告载体活性（P<0.05），表明SHP-1 的甲基化可抑制自身的转录。ESCC组织中启动子区的甲基化率明显高于癌旁组织（P<0.05），并与TNM分期、病理分级及淋巴结转移密切有关(P<0.05）；与癌旁组织相比，ESCC组织中SHP-1 mRNA相对表达量显著降低（P<0.05），并与启动子区甲基化有关（P<0.05）；Kaplan-Meier 分析显示，启动子区高甲基化与ESCC患者的不良预后有关（P<0.05）。结论：ESCC组织和细胞株中SHP-1 基因启动子区高甲基化状态可抑制其自身的转录活性，进而导致该基因表达沉默；SHP-1的高甲基化与ESCC患者预后不良有关，SHP-1 的甲基化状态可能成为ESCC患者预后的评估指标。     

miR-9通过靶向E盒结合锌指蛋白2调控小细胞肺癌的恶性生物学行为及其可能的机制

目的：探讨 miR-9 通过靶向 E 盒结合锌指蛋白 2（zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）对小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）细胞生物学行为的调控作用，分析miR-9在SCLC中的作用及其工作机制。方法：采用qPCR、WB和免疫组化方法检测于2018年2月至2019年11月于河北医科大学第四医院肿瘤内科接受手术治疗的67例SCLC患者癌组织及癌旁组织中ZEB2的表达。采用TargetScan预测miR-9的潜在靶基因并通过双荧光素酶报告基因试验、qPCR和WB法进行验证。CCK-8法、流式细胞术和Transwell实验检测miR-9和ZEB2 过表达对 NCI-H446 的生物学行为影响，WB法检测对细胞中E-cadherin，N-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响。利用miR-9过表达NCI-H446细胞构建SCLC裸鼠移植瘤模型，观察miR-9对裸鼠移植瘤生长的影响。结果：SCLC组织中ZEB2的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织（P<0.01）。miR-9在ZEB2的3'' UTR上具有潜在的结合位点，与对照组相比，miR-9过表达组NCI-H446细胞中ZEB2的mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01），细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.05或P<0.01），促EMT蛋白表达减少，而同时过表达ZEB2能够逆转上述影响。体内实验中，miR-9过表达组移植瘤体积、重量均明显低于对照组（P<0.05或P<0.01）。miR-9组裸鼠肿瘤组织中和ZEB2蛋白的表达均较对照组明显降低（P<0.01）。结论：miR-9通过靶向调控ZEB2从而抑制SCLC细胞的生物学行为以及NCI-H446裸鼠移植瘤的生长。     

miR-760 在宫颈鳞状细胞癌组织和细胞中的表达及其对SiHa 细胞恶性 生物学行为的作用

[摘要] 目的: 探讨微小RNA（miR）-760 在人宫颈鳞状细胞癌（CSCC）组织和细胞中的表达及其对SiHa 细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、EMT影响的分子机制。方法: 选用2015 年4 月至2018 年8 月山东省聊城市妇幼保健院妇科手术切除、经病理确诊的80 例CSCC组织及相应的癌旁组织标本和40 例子宫肌瘤切除术获取的正常宫颈组织标本,应用qPCR检测CSCC组织、癌旁组织和正常宫颈组织、人CSCC细胞系SiHa、HCC94 和人宫颈鳞状上皮永生化细胞株H8 中miR-760 的表达水平,分析miR-760 表达与CSCC患者临床病理特征的相关性。用脂质体转染法,将miR-760 mimics 和NC-mimics 质粒分别转染至SiHa 细胞,用qPCR检测SiHa 细胞中miR-760 的表达,用CCK-8 实验和流式细胞术分别检测SiHa 细胞增殖能力和凋亡水平,用Transwell 实验检测SiHa 细胞的侵袭和迁移能力,WB检测SiHa 细胞EMT相关蛋白上皮型钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）和神经型钙黏蛋白（N-cadherin）的表达变化。用生物学信息法预测FOXA1 与miR-760 的靶向关系,用双荧光素酶报告基因验证miR-760 对FOXA1的直接靶向调控作用。结果：CSCC组织中miR-760 表达明显低于癌旁组织及正常宫颈组织（均P<0.01）,miR-760 表达与患者淋巴结转移和临床分期密切相关（均P<0.01）。SiHa、HCC94 细胞中miR-760 的表达明显低于H8 细胞（均P<0.01）。通过转染miR-760 mimics 上调miR-760 表达,能够显著抑制SiHa 细胞的增殖能力和侵袭、迁移能力（均P<0.01）、促进其凋亡（P<0.01）,并上调Ecadherin的表达（P<0.01）、下调vimentin 和N-cadherin 的表达（均P<0.01）。FOXA1 是miR-760 的直接靶基因（P<0.01）,上调miR-760 表达显著抑制SiHa 细胞中FOXA1 mRNA和蛋白的表达（均P<0.05）。结论：在CSCC组织和细胞中miR-760 低表达,其通过靶向作用FOXA1 基因调控SiHa细胞的增殖、侵袭、迁移并促进凋亡,同时影响癌细胞的EMT进程。     

桥接整合因子1 去甲基化诱导细胞周期阻滞抑制食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖

目的：分析桥接整合因子1（bridging integrator-1, Bin1）去甲基化对Bin1 基因表达和食管鳞状细胞癌EC109 细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法：甲基化特异性PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）法检测去甲基化药物5-氮杂-2''脱氧胞苷（5-Aza-2''-deoxycytidine, 5-Aza-dc）处理后EC109 细胞Bin1 启动子区域的甲基化状态,用qPCR、Western blotting 和MTT法分别检测单独5-Aza-dc 和5-Aza-dc 加转染Bin1 基因干扰片段（Bin1 siRNA）处理对EC109 细胞Bin1 mRNA及其蛋白表达和细胞增殖能力的影响,流式细胞术和Western blotting 检测5-Aza-dc 处理后EC109 细胞周期和细胞周期相关蛋白（Cyclin D1 与CDK4）表达的变化。结果：去甲基化药物5-Aza-dc 处理后,EC109 细胞Bin1 基因启动子区域发生去甲基化。5-Aza-dc 处理的Bin1 去甲基化EC109 细胞Bin1 mRNA和蛋白表达明显上调（均P<0.05）,细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞阻滞在G0/G1 期,表现为S 期细胞比例显著减少,细胞周期相关蛋白Cyclin D、CDK4 表达均明显下调（均P<0.05）。Bin1 去甲基化EC109 细胞转染Bin1 siRNA后,Bin1 mRNA和蛋白表达明显下调,细胞增殖能力增强（均P<0.05）。结论：Bin1 基因启动子区域在EC109 细胞中呈完全甲基化状态,5-Aza-dc 去甲基化可使食管鳞癌细胞EC109 细胞Bin1 表达升高,通过降低细胞周期相关蛋白表达诱导细胞周期阻滞抑制EC109 细胞增殖。证实表观遗传学变化可能与食管癌细胞恶性增殖有关,可为食管癌治疗提供新的思路。     

生长抑制因子4对宫颈癌细胞CaSki增殖和凋亡的影响及作用机制研究

目的 探讨生长抑制因子4(ING4)对宫颈癌细胞CaSki增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 取50例宫颈癌患者的宫颈癌组织和癌旁组织,宫颈癌细胞系Hela、SiHa、CaSki和正常宫颈细胞系Ect1/E6E7,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测宫颈癌组织和细胞中ING4 mRNA的相对表达量,蛋白质印迹(Western blot)法检测组织和细胞中ING4蛋白的相对表达量.分别将转染ING4过表达慢病毒和稳定阴性对照慢病毒的宫颈癌细胞CaSki作为Lv-ING4组和Lv-NC组,将没有转染慢病毒的细胞作为对照组,CCK8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡能力,Western blot法检测caspase 3、β-catenin、c-myc蛋白的相对表达量.采用WNT/β-catenin信号激活剂LiCl处理ING4表达上调的宫颈癌CaSki细胞,检测细胞增殖能力、凋亡能力,以及caspase 3、β-catenin、c-myc蛋白的相对表达量.结果 宫颈癌组织中ING4 mRNA的相对表达量明显低于癌旁组织(P<0.01),宫颈癌细胞CaSki中ING4 mRNA和ING4蛋白的相对表达量均明显低于宫颈癌细胞Hela、SiHa和正常宫颈细胞Ect1/E6E7(P<0.01).慢病毒转染后,Lv-ING4组细胞中ING4 mRNA和ING4蛋白的相对表达量均明显高于对照组和Lv-NC组(P<0.01),光密度(OD)值明显低于对照组和Lv-NC组(P<0.01),细胞凋亡率明显高于对照组和Lv-NC组(P<0.01);Lv-ING4组宫颈癌细胞caspase 3蛋白的相对表达量明显高于对照组和Lv-NC组(P<0.01),β-catenin、c-myc蛋白的相对表达量均明显低于对照组和Lv-NC组(P<0.01).WNT/β-catenin信号激活剂LiCl处理ING4表达上调的宫颈癌细胞CaSki后,Lv-ING4+LiCl组细胞OD值明显高于Lv-ING4组(P<0.01),凋亡率明显低于Lv-ING4组(P<0.01),Lv-ING4+LiCl组细胞caspase 3蛋白相对表达量明显低于Lv-ING4组(P<0.01),β-catenin、c-myc蛋白相对表达量均明显高于Lv-ING4组(P<0.01).结论 ING4在宫颈癌中表达下调,其可能通过下调WNT/β-catenin信号激活通路抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

胰腺癌组织和细胞的耐药性与ABC转运蛋白基因1 的关系

[摘要] 目的：探讨胰腺癌耐药性与ABC转运蛋白基因1（ABCB1）的表达及其启动子甲基化的关系。方法：选用2015 年8月至2018 年8 月福建省肿瘤医院病理确诊的15 例胰腺癌及癌旁组织、3 例正常胰腺组织标本以及胰腺癌细胞株SW1990,用间歇浓度梯度倍增法将SW1990 细胞株诱导分化为吉西他滨（GEM）耐药胰腺癌细胞株SW1990/GZ。用qPCR分别检测胰腺癌及癌旁组织和SW1990、SW1990/GZ细胞中ABCB1 表达水平,用MSP-PCR法检测胰腺癌组织和SW1990、SW1990/GZ细胞中ABCB1启动子区域甲基化程度。结果：与SW1990 相比,SW1990/GZ细胞空泡增多、核分裂像增加、呈现团块生长,并呈现更强的耐药性（P<0.05）。胰腺癌组织中ABCB1 表达水平明显高于癌旁组织（P<0.01）。SW1990 和SW1990/GZ细胞中ABCB1 表达水平显著高于正常胰腺组织（P<0.05 或P<0.01）,其中SW1990/GZ 细胞中ABCB1 表达水平高于SW1990 细胞（P<0.05）。SW1990 和SW1990/GZ细胞及正常胰腺组织中的ABCB1 启动子均呈低甲基化状态。胰腺癌和正常胰腺组织中甲基化率分别为6.7%（1/15）及0.00%（0/3）,差异无统计学意义（均P>0.05）。结论：胰腺癌组织和细胞中ABCB1 表达增高与耐药性有关,但其基因表达不依赖于启动子的甲基化调控。     

低密度脂蛋白受体相关蛋白11在结直肠癌组织中的表达及其对SW480细胞增殖与凋亡的影响

目的：探讨低密度脂蛋白受体相关蛋白11（LRP11）在结直肠癌（CRC）组织中的表达及其对结肠癌SW480 细胞增殖与凋亡的影响。方法：利用生物信息学方法分析TCGA数据库中LRP11在CRC组织中的表达水平。用慢病毒感染技术分别将sh-LRP11及sh-NC 质粒转染至SW480 细胞,采用qPCR、WB法检测感染后各组细胞中LRP11的mRNA和蛋白的表达,CCK-8法、流式细胞术分别检测细胞的增殖活力、凋亡率及细胞周期分布情况,WB法检测SW480 细胞中cyclin D1、BAX、Bcl-2、β-catenin、活化β-catenin 等蛋白的表达水平。结果：TCGA数据库数据分析显示,LRP11 mRNA在CRC组织中的表达水平显著高于正常组织（P<0.05）。与sh-NC 组比较,sh-LRP11组SW480 细胞的增殖活力明显降低、细胞凋亡率显著升高（均P<0.01）,细胞中BAX表达显著升高、Bcl-2表达显著降低（均P<0.01）;G0/G1期细胞增多、S期细胞明显减少（均P<0.01）,cyclin D1的蛋白表达显著降低（P<0.01）;Wnt/β-catenin 信号通路中β-catenin 和活化β-catenin 的蛋白表达均显著下降（均P<0.01）。结论：LRP11 mRNA在CRC组织中呈高表达,干扰LRP11表达可抑制结肠癌SW480细胞增殖并促进其凋亡,为CRC提供了一种潜在的治疗靶点。     

HPV16E6 siRNA联合5-Aza-CdR对宫颈癌SiHa细胞中E-钙黏蛋白表达和基因甲基化的影响

目的:探讨HPV16E6 siRNA联合5-Aza-CdR(5-aza-2'-deoxycytidine,5-氮-2'-脱氧胞苷,又称地西他滨)对宫颈癌SiHa细胞中E-钙黏蛋白表达和基因甲基化的影响。方法:采用SiHa细胞构建的HPV16E6 沉默细胞株及5-Aza-CdR细胞株,检测细胞中E-cadherin mRNA和蛋白表达,以及E-cadherin甲基化状态。采用细胞黏附、Transwell体外侵袭、迁移实验检测5-Aza-CdR和siRNA E6对SiHa细胞黏附、侵袭迁移的影响。结果:5-Aza-CdR+siRNA E6组较5-Aza-CdR组、siRNA E6组中E-cadherin mRNA 及蛋白表达均上升,细胞的黏附率、侵袭抑制率和迁移抑制率均升高;5-Aza-CdR+siRNA E6组较5-Aza-CdR组、siRNA E6组中E-cadherin基因启动子区甲基化指数明显下降。结论:HPV16E6 siRNA联合5-Aza-CdR可显著引起宫颈癌细胞中E-cadherin 基因低甲基化,并可导致E-cadherin mRNA 及蛋白的表达水平明显上调,肿瘤细胞黏附能力升高,侵袭迁移能力下降,两者在一定程度起到协同作用。     

miR-4465 通过靶向下调HMGA1的表达抑制肝细胞癌Hep3B细胞的恶性生物学行为

目的：探讨miR-4465 靶向高迁移率族蛋白A1（HMGA1）对肝细胞癌 Hep3B 细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法：收集2020 年5 月至2021 年9 月在皖南医学院第一附属医院确诊为肝细胞癌患者的16 对癌组织和癌旁组织样本，采用qPCR 分析miR-4465 在肝细胞癌组织和Hep3B、Huh7细胞中的表达情况，双荧光素酶报告基因实验验证miR-4465 与HMGA1的调控关系。按转染物的不同将 Hep3B 细胞分为 mimics-NC 组 、miR-4465-mimics 组、inhibitor-NC 组、miR-4465 inhibitor组、si-NC 组、si-HMGA1 组；另外分组转染mimics-NC+pcDNA-NC、miR-4465 mimics+pcDNA-NC 和miR-4465 mimics+pcDNA-HMGA1进行回复实验。采用qPCR和WB法检测各组细胞中HMGA1 mRNA和蛋白水平的变化，CCK-8法检测各组细胞增殖能力的变化，划痕实验检测各组细胞迁移能力的变化，Transwell 实验检测各组细胞侵袭能力的变化。结果：miR-4465 在肝细胞癌组织和细胞中的表达水平显著低于癌旁组织和正常肝细胞（P<0.05或P<0.001）。转染48 h后，过表达miR-4465 的Hep3B细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（P<0.05、P<0.01或P<0.001）；敲低miR-4465 后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显升高（P<0.05、 P<0.01或P<0.001）。双荧光素酶报告实验验证了HMGA1-3''UTR 与miR-4465 的靶向结合关系，miR-4465 可以靶向下调HMGA1 mRNA 和蛋白质的表达（均P<0.01）。过表达HMGA1 能部分逆转过表达 miR-4465 对细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用及HMGA1 表达的抑制作用（均P<0.05）。结论：miR-4465 通过靶向下调HMGA1 在肝细胞癌Hep3B 细胞中的表达，从而抑制Hep3B细胞的恶性生物学行为。