人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶hAPE1融合蛋白的构建、纯化及其功能的初步研究

目的 构建人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(hAEP1)原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,对其活性进行初步分析.方法 用PCR法扩增hAEP1基因,克隆入pET28a载体中,获得重组质粒pET28a-hAPE1.将重组质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达并鉴定.用His亲和层析技术进行蛋白纯化,得到hAPE1融合蛋白.用Western blot及电泳迁移率变动分析实验分析hAPE1融合蛋白的抗原性及活性.结果 所构建的重组质粒pET28-hAPE1经双酶切及DNA测序鉴定表明构建正确.IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE及Western blot鉴定均在预期位置出现阳性条带,His亲和层析纯化后得到hAPE1融合蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确.Western blot及电泳迁移率变动分析实验证明hAPE1融合蛋白具有抗原性、AP修复及氧化还原活性.结论 成功构建了人脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶的原核表达载体pET28a-hAPE1,并在E. coli BL21(DE3)中高效表达和纯化得到有抗原性及活性的hAPE1融合蛋白.     

截短的泡球蚴Em18基因原核表达质粒的构建、表达及鉴定

目的：构建截短的泡球蚴18（Em18）基因的原核表达质粒，获得高效表达、有生物活性的重组蛋白，并对其进行初步鉴定。方法：DNAman软件设计引物，PCR法扩增并构建截短的pET41a-Em18．1原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达和纯化rEm18．1-GST重组蛋白，采用SDS-PAGE电泳及Western免疫印迹法对其进行初步鉴定。结果：成功构建出截短的pET41a-Em18．1，SDS-PAGE检测表明rEm18．1-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为41kDa处有表达条带。Western blot结果显示rEm18．1-GST重组蛋白能被AE病人阳性血清识别。结论：截短的pET41a-Em18．1原核表达质粒表达的rEm18．1-GST重组蛋白具有良好的抗原性，为Em18抗原表位的分析奠定基础。     

细粒棘球蚴重组延伸因子-1基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对构建细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)延伸因子-1(Elongation factor1,EF-1)基因的重组质粒,并原核表达、纯化及对其免疫特性进行鉴定。方法从重组质粒EF-1/pGEM-T中酶切出EF-1目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)plysS进行融合表达,经His-band树脂纯化试剂盒小量纯化,SDS-PAGE和Westernblot方法鉴定表达产物。结果成功构建Eg.EF-1/pET28a/E.coliBL21基因工程菌株,诱导表达重组蛋白和纯化分离得到31KDaEg.EF-1均能被细粒棘球蚴天然抗原免疫的兔多克隆抗血清识别。结论初步证实该重组蛋白具有较好的抗原性。     

mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体（FSHR）基因N-端部分片段（28—90aa）（mFSHRn）;预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA,利用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）技术反转录成cDNA,按照GeneBank中小鼠FSHRN．端序列设计引物,扩增基因片段并插入pET32a载体,测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E．coli BL21（DE3）感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结果完全一致,生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论：mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗,成功构建了pET32a—mFHSRn原核表达重组质粒,获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株,为后续的相关研究奠定了基础。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者病毒基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性

目的 研究不同民族慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV前S2／S（preS2／S）和C（core,C）基因在大肠杆菌Escherichia coli（E.coli）中表达的稳定性和水平,并对其抗原性进行鉴定,为创制新型疫苗提供抗原材料。方法从中国云南少数民族地区50例慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV基因组DNA,将聚合酶链反应（PCR）扩增-克隆-测序的HBV preS2／S和C基因插入到表达载体pkPR上,构建重组pkPR-S2S和pkPR-C表达质粒,并在大肠杆菌TOP10中表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定表达产物非融合蛋白,并对其抗原性用Western印迹和ELISA方法进行检测。结果SDS-PAGE检测到全部慢性乙型肝炎患者pkPR-S2S和pkPR-C重组质粒在大肠杆菌TOP10中存在稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白相对分子质量分别为31000和21000,非融合蛋白浓度约占16％,纯度达96％。Western印迹和ELISA分析,非融合蛋白能分别与HBVpreS2／S抗原单抗、C抗原单抗及慢性乙型肝炎患者血清发生反应,而与对照的甲型肝炎（HAV）患者血清、丙型肝炎（HCV）患者血清及正常血清之间无交叉反应。结论中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者HBV preS2／S和C基因在大肠杆菌TOP10中有稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白具有抗原性。这些发现为创制新型疫苗具有潜在应用价值。     

小鼠PDL1胞外区的克隆、表达及生物学效应研究

目的：克隆小鼠PDL1膜外区（简称mPDL-1 IgV）基因,构建原核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法：提取小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆mPDL-1 IgV基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,构建原核表达质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR和双酶切鉴定,并测序。筛选阳性菌落,提取质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,同时纯化mPDL-1 IgV蛋白,进行生物学活性检测。结果：从小鼠脾细胞总RNA中成功获得mPDL-1 IgVcDNA克隆,重组质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV构建正确。转化pET28a（＋）／mPDL-1 IgV的E．coli BL21（DE3）成功诱导性表达重组小鼠PDL-1胞外区蛋白,并纯化mPDL-1 IgV蛋白,对其进行了复性和浓缩,复性后的蛋白显示出良好的生物学活性。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠PDL1胞外区蛋白,为进一步研究其功能提供了条件。     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL-6全长基因的克隆?表达及表达产物的纯化

目的:克隆人类疱疹病毒8型(human herpesvirus 8,HHV-8)ORF50截短基因和编码病毒IL-6(vIL-6)全长基因,将其置于大肠杆菌中作融合表达.并纯化融合表达的vIL-6.方法:分别以本实验室先前构建的重组质粒pcDNA3.1+ORF50和peD-NA3.1+vIL-6为模板,PCR扩增目的基冈片段,克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建含HHV-8 ORF50截短基因的重组原核表达质粒pORF50-C1,pORF50-C2,pORF50-C3和含vIL-6伞长基因的重组原核表达质粒pvIL-6.重组质粒经酶切鉴定和核酸序列测定正确后转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.用glutathione Sepharese 4B亲和层析柱纯化vIL-6表达产物.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western blot检测GST融合蛋白的表达和纯化情况.结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的序列与基因数据库中已登记的HHV-8相应序列呈现100%同源:IPTG诱导后的菌体.经SDS-PAGE,显示有相应大小的融合表达蛋白产生.Western blot亦在预期的位置检测到特异性条带.结论:在E.coli中获得了正确表达的HHV-8 ORF50基因3个截短片段和vIL-6全长基因,并成功纯化vIL-6融合蛋白.     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因研究

目的 分析金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因与耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药的相关性。方法 采用琼脂二倍稀释法测定246株铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的敏感性,Etest法进行金属酶表型的筛选,PCR检测金属β-内酰胺酶基因及耐消毒剂基因。结果 检出102株多重耐药株,21株广泛耐药株,分别占41.5%和8.5%;亚胺培南耐药组筛选出金属酶表型阳性24株,阳性率为37.5%,敏感组未检出;亚胺培南耐药组经PCR扩增金属酶阳性21株,阳性率为32.8%,其中8株为IPM-1,9株为IPM-2,4株为NDM-1,未检出VIM-1、VIM-2;敏感组株未检出金属酶基因,两组的检出率差异具有统计学意义(P<0.05);21株金属酶阳性和表型结果一致;耐药组耐消毒剂基因qacE?1阳性率为81.25%,敏感组阳性率为75%,两组间的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 耐亚胺培南铜绿假单胞菌表现为多重耐药;金属β-内酰胺酶基因的存在和其产生的金属酶是本地区铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一,其基因型主要为IPM-1、IPM-2和NDM-1,铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药还存在其他的主要机制;NDM-1阳性铜绿假单胞菌对头孢类抗生素、呋喃妥因、碳青霉烯类等多种抗菌药物耐药;合理使用有效的消毒剂将有利于控制NDM-1阳性菌的传播。     

生物相容性高分子基因载体的研究进展

基因治疗为各种先天性或后天性疾病(如肿瘤)提供了一种新的治疗方式,因此应用前景广阔。由于裸基因易受到多种因素(如,酶降解、肾滤过作用引起的快速清除、不易被细胞摄取、从内涵体到细胞质的释放不充分等)的影响,应用受到严重限制。要成功的达到基因治疗的目的,开发安全有效的基因传递系统十分必要。随着基因传递系统的日益发展,对所开发的载体的安全性要求也越来越高。本文介绍生物相容性高分子,如壳聚糖、聚氨基酯以及它们的衍生物作为肿瘤基因治疗非病毒高分子载体的一些研究动态。     

基因枪在肿瘤基因治疗中的应用价值

目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间,以及对小鼠肿瘤的治疗效果,探讨作为一种 基因转移工具,基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 （１）用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间;（２）通过基因枪向小鼠皮肤转Ｌａｃ￣Ｚ基因后,取转瓣皮肤做冰浇灌发片进行β－ｇａｌ染色,观察转基因蛋白在皮人中表达的部位;（３）用ＥＬＩＳＡ法检测向小鼠皮肤转ｍ     

ApoE、A2M、ACE基因与汉人Alzheimer病的相关性研究

目的 探讨山西汉族人群载脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)基因、a2-巨球蛋白(alpha-2 macroglobulin,A2M)基因、血管紧张素转换酶(angiotensin convening enzyme,ACE)基因多态性与Alzheimer病(AD)的相关性.方法 采用聚合酶链反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和电泳技术,观察山西汉族群体114例(AD患者55例,正常对照59例)的apoE基因、A2M基因、ACE基因多态性的分布并进行关联性分析.结果 AD组和对照组之间apoE各基因型分布总体比较其差异有统计学意义(P<0.05),其中ε4等位基因两组间比较存在明显统计学差异(P=0.000 2),且OR值大于5;AD组和对照组A2M各基因型、等位基因分布总体比较其差异有统计学意义(P<0.05).其中Ⅰ/Ⅴ基因型和Ⅴ等位基因与AD均呈显著正相关(Ⅰ/Ⅴ,基因型OR=2.85,95%CI=1.14-7.14;V等位基因OR=2.49,95%CI=1.05-5.89);两组间ACE各基因型及等位基因间的差异均无统计学意义(P>0.05).且按年龄、血压分层后AD组和对照组中ACE基因型及等位基因的分布差异无统计学意义;按是否携有apoE ε4分层后AD组和对照组A2M、ACE各基因型及等位基因两组分布均无差异(P>0.05).结论 apoE、A2M基因是晚发性AD的危险因子;AcE基因与晚发性AD不存在关联,还不能认为是晚发性AD的危险因子;且A2M基因、ACE基因与apoE基因无相互作用.     

携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体的构建

目的构建携带有凋亡素(Apoptin、VP3)、内皮抑素(Endostatin)双基因的重组腺病毒载体,为其在肿瘤治疗的应用研究打下基础。方法将VP3基因和Endostatin基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316中,将该穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒颗粒Ad-vp3-IRES-sEndo-his。其后挑选病毒空斑获取克隆进行小剂量扩增并提取病毒DNA进行PCR、RT-PCR检查以筛选和鉴定毒种,之后大剂量扩增所选得的病毒克隆并进行纯化、测定病毒的滴度。结果所得腺病毒经PCR、RT-PCR检测表明重组腺病毒Ad-vp3-IRES-sEndo-his包装成功。测定病毒50%组织培养感染剂量(TCID50)为5.7×109/ml,病毒颗粒滴度(VP)为1.9×1011/ml。结论成功构建携带凋亡素、内皮抑素双基因腺病毒载体并对其进行了大剂量扩增及提纯,达到了细胞及动物实验使用的标准。     

逆转录病毒载体介导胰岛素原基因突变体与葡萄糖激酶基因共转染的应用价值

目的研究逆转录病毒载体介导基因共转染的效率,探讨其在基因共转染领域的应用价值.方法以携葡萄糖激酶(glucokinase, gk)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene,mpin)的逆转录病毒共同感染HepG2细胞,经G418筛选,放免法、SDS-PAGE、Western-blot挑选联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞,RT-PCR鉴定.结果 G418筛选3周获阳性细胞克隆,采用放射免疫法、SDS-PAGE、Western-blot从20个细胞克隆中挑选出联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞4株,选取1株命名为细胞克隆"β";RT-PCR证实细胞"β" 中已有两个目的基因的转录.结论在需要目的基因长期表达的基因共转染领域,逆转录病毒载体仍有一定的应用价值,但如何提高其介导的基因共转染效率有待进一步探究.     

自杀基因联合细胞因子的癌症治疗

INTRODUCTION The transfer of suicide genes into tumor cells is currently being used in a variety of clinical gene therapy trials for the treatment of cancer, and suicide gene therapy is the transduction of a gene that transforms a non-toxic into a toxic substance[1].     

PCR基因芯片

基因芯片(gene chips)可以快速、微型化、自动化地检测大量基因,成了生物医学研究的重要推动力.随着微加工技术的发展, 我们建立了有1 200个微反应池的PCR基因芯片,将基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)技术结合在一起.PCR基因芯片综合了基因芯片体积小却可以检测大量基因,以及PCR敏感而且容易发现各种基因变异的特点,采用以PCR 为基础,而非以分子杂交为基础的检测方式,克服了杂交技术所存在的内在缺陷,大大增强了实验的敏感性和可重复性;扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围,更适用于各种基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定.PCR反应采用荧光探针作实时定量分析.在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景.     

核素报告基因显像在基因治疗监测中的应用

基因治疗作为一种新的疾病治疗方法,展示了广阔的临床应用前景;但基因治疗中仍存在着许多亟待解决的问题,尤其是如何实现在活体条件下对治疗基因的定位及表达进行监测和评估.放射性核素报告基因显像是近年来发展迅速的一种无创、灵敏的活体内监测基因表达的方法,具有灵敏度高和特异性强的优点,并可进行深部组织显像和重复显像,展示了良好的应用前景.文章就放射性核素报告基因显像用于监测基因治疗的原理、特点及应用进行综述.     

耐药不动杆菌AmpC酶及其相关基因分析

目的 了解不动杆菌产AmpC酶的情况,研究AmpC酶的调控基因AmpD、AmpR对产酶的影响.方法 126株不动杆菌,用Nitrocefin显色法、头孢西丁纸片筛选法和三维试验进行AmpC酶的检测,AmpC基因引物对提取的质粒DNA和染色体DNA进行PCR扩增并测序,对AmpC基因扩增阳性菌株进行AmpR、AmpD基因的扩增.结果 本组不动杆菌总β-内酰胺酶的检出率为78.6%(99/126).AmpC基因引物对质粒DNA和染色体DNA进行PCR扩增并测序显示,染色体DNA中存在AmpC基因,质粒DNA中未检测出AmpC基因.三维试验与PCR法相比,假阳性率为54.7%,假阴性率为17.4%.结论 不动杆菌产AmpC酶率较高,AmpC基因位于染色体上,在质粒上未发现.不动杆菌中AmpD、AmpR基因的改变导致AmpC酶表达水平的变化.AmpD的改变比AmpR改变更多见.三维试验与PCR法扩增AmpC基因检测方法相比,有一定的假阳性.除了亚胺培南外,产AmpC酶菌株的耐药率较不产AmpC酶株为高.